Článek 1

Příloha k nařízení (EHS) č. 2676/90 se mění takto:

1. Kapitola 20 (Kyselina D-jablečná) se nahrazuje přílohou I tohoto nařízení.

2. Kapitola 38 (Deriváty kyanidů) se nahrazuje přílohou II tohoto nařízení.

3. Příloha III tohoto nařízení se doplňuje jako kapitola 44.

Článek 2

Toto nařízení vstupuje v platnost sedmým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

V Bruselu dne 12. dubna 1999.

Za Komisi

Franz Fischler

člen Komise

[1] Úř. věst. L 84, 27.3.1987, s. 1.

[2] Úř. věst. L 210, 28.7.1998, s. 10.

[3] Úř. věst. L 272, 3.10.1990, s. 1.

[4] Úř. věst. L 117, 7.5.1997, s. 10.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA I

„20. KYSELINA D-JABLEČNÁ

(enzymatická metoda)

1. PRINCIP

V přítomnosti D-malát-dehygedronasy (D-MDH) se kyselina D-jablečná (D-malát) oxiduje nikotinamidadenindinukleotidem (NAD) na oxaloctan. Vytvořený oxaloctan se štěpí na pyruvát a oxid uhličitý.

+++++ TIFF +++++

Množství vytvořeného NADH je úměrné obsahu kyseliny D-jablečné a měří se při vlnové délce 334, 340 nebo 365 nm.

2. ČINIDLA

Zkušební sada pro přibližně 30 stanovení:

a) lahvička 1 s asi 30 ml roztoku skládajícího se z tlumivého roztoku Hepes [N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethansulfonové kyseliny] pH = 9,0 a stabilizátorů;

b) lahvička 2 s asi 210 mg NAD lyofilizátu;

c) tři lahvičky 3 s D-MDH lyofilizátem, každá asi 8 U.

Příprava roztoků

1. Obsah lahvičky 1 použijte nezředěný. Před použitím roztok uveďte na teplotu 20 až 25 °C.

2. Obsah lahvičky 2 rozpusťte ve 4 ml redestilované vody.

3. Obsah jedné z lahviček 3 rozpusťte v 0,6 ml redestilované vody. Před použitím roztok uveďte na teplotu 20 až 25 °C.

Stabilita roztoků

Obsah lahvičky 1 je stabilní alespoň po dobu jednoho roku, pokud je uložen při +4 °C; roztok 2 je stabilní po dobu tří týdnů, pokud je uložen tři týdny při +4 °C a po dobu dvou měsíců při uložení při -20 °C; roztok 3 je stabilní po dobu tří měsíců, pokud je uložen při +4 °C.

3. VYBAVENÍ

3.1. Spektrofotometr, který umožňuje měření při vlnové délce 340 nm, při které je absorpce NADH na maximální hodnotě. Pokud není k dispozici, lze použít spektrofotometr se zdrojem nespojitého spektra, který umožňuje provádět měření při 334 nebo 365 nm. Jelikož se jedná o měření absolutní absorbance (tj. bez sady kalibračních roztoků, ale s odkazem na extinkční koeficient NADH), je nutné zkontrolovat stupnici vlnových délek a spektrální absorbanci přístroje.

3.2. Skleněné kyvety s délkou optické dráhy 1 cm (v případě, že dáváte přednost kyvetám na jedno použití, je možné používat tyto).

3.3. Mikropipety pro pipetování objemů v rozsahu od 0,01 do 2 ml.

4. PŘÍPRAVA VZORKU

Stanovení D-malátu se obvykle provádí přímo na víně bez předběžného odbarvení.

Množství D-malátu v kyvetě by mělo být mezi 2 a 50 μg. Víno proto musí být naředěno tak, aby dávalo koncentraci D-malátu mezi 0,02 a 0,5 g/l případně 0,02 až 0,3 g/l (v závislosti na použitém přístroji).

Tabulka zředění:

Odhadované množství D-malátu/litr | Zředění vodou | Faktor zředění F |

Měřeno při |

340 nebo 334 nm | 365 nm |

< 0,3 g | < 0,5 g | — | 1 |

0,3 – 3,0 g | 0,5 – 5,0 g | 1 + 9 | 10 |

5. POSTUP

Se spektrofotometrem nastaveným pro vlnovou délku 340 nm určete absorbanci pomocí kyvet 1 cm a buď použijte k nastavení nulové absorbance vzduch (bez kyvety v optické dráze) nebo použijte vodu.

Do kyvety pipetujte:

| Reference | Test |

Roztok 1 | 1,00 ml | 1,00 ml |

Roztok 2 | 0,10 ml | 0,10 ml |

Redestilovaná voda | 1,80 ml | 1,70 ml |

Vzorek pro měření | — | 0,10 ml |

Promíchejte a asi po šesti minutách změřte absorbanci referenčního a zkušebního roztoku (A1).

Přidejte:

| Reference | Test |

Roztok 3 | 0,05 ml | 0,05 ml |

Promíchejte, po dokončení reakce (přibližně 20 minut) změřte absorbanci referenčního a zkušebního roztoku (A2).

Vypočítejte rozdíl absorbance (A2 – A1) pro referenční roztok (ΔAT) a zkušební roztok (ΔAE). Nakonec vypočítejte rozdíl mezi těmito rozdíly ΔA = ΔAE – ΔAT.

Poznámka:

Doba potřebná pro dokončení enzymové aktivity se může měnit od dávky k dávce. Doba uvedená výše je dána jen jako vodítko a doporučuje se ji stanovit pro každou dávku.

Kyselina D-jablečná reaguje prudce. Enzym také převádí kyselinu L-vinnou, avšak mnohem pomaleji. To vysvětluje mírnou vedlejší reakci, což lze napravit pomocí extrapolace (viz dodatek A).

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Obecný vzorec pro vypočítání obsahu v mg/l je:

C =

kde:

V = objem zkušebního roztoku v ml (2,95 ml)

v = objem vzorku v ml (0,1 ml)

PM = molekulová hmotnost stanovované látky (pro kyselinu D-jablečnou je PM = 134,09)

d = optická dráha kyvety v cm (1 cm)

ε při 340 nm = 6,3 (l mmol-1 cm -1)

při 365 nm =3,4 (l mmol-1 cm -1)

při 334 nm = 6,18 (l mmol-1 cm -1)

Pokud bylo během přípravy vzorku provedeno zředění, musí se výsledek vynásobit faktorem zředění.

Obsah kyseliny D-jablečné se uvádí v miligramech na litr (mg/l) bez desetinných míst.

7. PŘESNOST

Podrobnosti o mezilaboratorní zkoušce na přesnost metody jsou shrnuty v dodatku B. Hodnoty odvozené z mezilaboratorní zkoušky mohou být nepoužitelné na rozsahy koncentrací stanovované složky a látek matrice jiné, než jsou uvedené v dodatku B.

7.1. Opakovatelnost

Absolutní rozdíl mezi dvěma jednotlivými výsledky získanými se stejným vzorkem podrobené provozovatelem zkoušce pomocí stejného přístroje v nejkratším časovém intervalu nepřekročí hodnotu opakovatelnosti r ve více než 5 % případů.

r = 11 mg/l

7.2. Reprodukovatelnost

Absolutní rozdíl mezi dvěma jednotlivými výsledky získanými se stejným vzorkem podrobené zkoušce ve dvou různých laboratořích nepřekročí hodnotu reprodukovatelnosti R ve více než 5 % případů.

R = 20 mg/l

8. POZNÁMKY

S ohledem na stupeň přesnosti je třeba v případě potřeby potvrdit hodnoty kyseliny D-jablečné pod 50 mg/l jinou metodou rozboru, která používá jiný princip měření, jako např. metodu Przyborského a kol. (Mitteilungen Klosterneuburg 43, 1993; 215 – 218, 1993).

Vzorek vína v kyvetě by neměl překročit 0,1 ml, aby nedošlo k možné inhibici enzymatické aktivity polyfenoly.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA II

"38. DERIVÁTY KYANIDŮ

(Pozor: při manipulaci s chemikáliemi chloraminem T, pyridinem, kyanidem draselným, kyselinou chlorovodíkovou a kyselinou fosforečnou dodržujte bezpečnostní opatření. Použité produkty řádně zlikvidujte v souladu s platnými environmentálními pravidly. Pozor na kyselinu kyanovodíkovou uvolněnou během destilace okyseleného vína.)

1. PRINCIP

Veškerá volná kyselina kyanovodíková ve víně se uvolňuje kyselou hydrolýzou a odděluje se destilací. Po reakci s chloraminem T a pyridinem se vytvořený glutakonový dialdehyd stanoví kolorimetricky na základě modrého zbarvení, které dává s kyselinou 1,3-dimethyl-barbiturovou.

2. VYBAVENÍ

2.1 Destilační aparatura

Používejte destilační aparaturu popsanou pro stanovení obsahu alkoholu ve víně.

2.2 Baňka o objemu 500 ml s kulatým dnem a s normalizovaným zábrusem.

2.3 Vodní lázeň řízená termostaticky na 20 °C.

2.4 Spektrofotometr umožňující měření absorbance při vlnové délce 590 nm.

2.5 Skleněné kyvety nebo kyvety na jedno použití s optickou dráhou 20 mm.

3. ČINIDLA

3.1 Kyselina fosforečná (H3PO4) při 25 % (hmotnost/objem)

3.2 Roztok chloraminu T (C7H7ClNNa O2S, 3H2O) 3 % (hmotnost/objem)

3.3 Roztok kyseliny 1,3-dimethyl-barbiturové: rozpusťte 3,658 g kyseliny 1,3-dimethyl-barbiturové (C6H8N2O3) v 15 ml pyridinu a 3 ml kyseliny chlorovodíkové (p20 = 1,19 g/ml) a přidejte 50 ml destilované vody.

3.4 Kyanid draselný (KCN)

3.5 Roztok jodidu draselného (KI) 10 % (hmotnost/objem)

3.6 Roztok dusičnanu stříbrného (AgNO3), 0,1 M

4. POSTUP

4.1 Destilace

Do baňky o objemu 500 ml (2.2) dejte 25 ml vína, 50 ml destilované vody, 1 ml kyseliny fosforečné (3.1) a několik skleněných korálků. Baňku ihned položte do destilační aparatury. Pomocí zkosené trubice veďte destilát do odměrné baňky o objemu 50 ml, která obsahuje 10 ml vody. Odměrnou baňku ponořte do ledové vody. V odměrné baňce nashromážděte 30 až 35 ml destilátu (nebo celkem asi 45 ml kapaliny).

Zkosenou trubici kondenzátoru propláchněte několika mililitry destilované vody, uveďte destilát na 20°C a doplňte destilovanou vodou až ke kalibrační značce.

4.2 Měření

Do kuželové baňky o objemu 50 ml se zabroušenou skleněnou zátkou dejte 25 ml destilátu, přidejte 1 ml roztoku chloraminu T a zazátkujte. Po přesně 60 vteřinách přidejte 3 ml roztoku kyseliny 1,3-dimethyl-barbiturové (3.3), zazátkujte a nechte stát 10 minut. Pak změřte absorbanci proti srovnávacímu vzorku (25 ml destilované vody místo 25 ml destilátu) při vlnové délce 590 nm v kyvetách s optickými dráhami 20 mm.

5. STANOVENÍ KALIBRAČNÍ KŘIVKY

5.1 Argentometrická titrace kyanidu draselného

V odměrné baňce o objemu 300 ml rozpusťte asi 0,2 g KCN (3.4), pečlivě zvážených, ve 100 ml destilované vody. Přidejte 0,2 ml roztoku jodidu draselného (3.5) a titrujte roztokem dusičnanu stříbrného 0,1 M (3.6) až do doby, kdy získáte stabilní nažloutlé zabarvení.

1 ml roztoku dusičnanu stříbrného 0,1 M odpovídá 13,2 mg KCN; vypočtěte koncentraci vzorku KCN.

5.2 Standardní křivka

5.2.1 Příprava standardního roztoku

Po stanovení koncentrace KCN podle postupu uvedeného v 5.1 připravte standardní roztok s obsahem 30 mg/l kyseliny kyanovodíkové (30 mg HCN ≡ 72,3 mg KCN) Roztok zřeďte 1/10.

Zaveďte 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml a 5,0 ml zředěného roztoku do odměrných baněk o objemu 100 ml a doplňte až ke značce destilovanou vodou. Připravené roztoky obsahují 30 μg, 60 μg, 90 μg, 120 μg a 150 μg kyseliny kyanovodíkové na litr.

5.2.2 Titrace

Vezměte takto získané vzorky o objemu 25 ml a pokračujte, jak je uvedeno výše v bodech 4.1 a 4.2.

Hodnoty získané pro absorbanci s ohledem na standardní roztoky jako funkce odpovídajícího obsahu kyseliny kyanovodíkové mají tvořit přímku procházející počátkem.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Kyselina kyanovodíková se uvádí v mikrogramech na litr (μg/l) bez desetinných míst.

6.1 Metoda výpočtu

Odečtěte obsah kyseliny kyanovodíkové na kalibrační křivce. Pokud byl vzorek zředěn, výsledek vynásobte faktorem zředění.

Bílé víno r = 3,1 μg/l nebo přibližně 6 %· xi

R = 12 μg/l nebo přibližně 25 %· xi

Červené víno r = 6,4 μg/l nebo přibližně 8 %· xi

R = 23 μg/l nebo přibližně 29 %· xi

xi = průměrná koncentrace HCN ve víně

xi = 48,4 μg/l pro bílé víno

xi = 80,5 μg/l pro červené víno."

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA III

44. STANOVENÍ ETHYL-KARBAMÁTU VE VÍNĚ: SELEKTIVNÍ DETEKČNÍ METODA S POUŽITÍM PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE/HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

(Použitelné pro stanovení ethyl-karbamátu pro koncentrace 10 až 200 μg/l)

(Pozor: při manipulaci s chemikáliemi, ethanolem, acetonem a karcinogenními produkty (ethyl-karbamát a dichlormethan) dodržujte bezpečnostní opatření. Použitá rozpouštědla řádně zlikvidujte v souladu s platnými environmentálními pravidly.)

A. Princip

Ke vzorku se přidává propyl-karbamát jako vnitřní standard, roztok se ředí vodou a dává do extrakční kolony s 50 ml pevné fáze. Ethyl-karbamát a propyl-karbamát se eluují dichlormethanem.

Eluát se koncentruje ve vakuové rotační odparce. Koncentrát se analyzuje plynovou chromatografií (GC – Gas Chromatography). Detekce se provádí hmotnostní spektrometrií s použitím fragmentometrie v režimu SIM (selected ion monitoring – sledování vybraných iontů)

B. Aparatura a chromatografické podmínky (příklad)

a) Plynový chromatograf/hmotnostní spektrometr (GC/MS) a v případě potřeby filtr vzorků a systém zpracování dat nebo rovnocenný.

Kapilární kolona z křemenného skla 30 m [1] × 0,25 mm vnitřní průměr, film 0,25 μm typu Carbowax 20M

Provoz: vstřikovač 180 °C, vektor heliového plynu při 1ml/minutu, vstřikování metodou bez dělení vstřikovaného množství.

Teplotní program: 40 °C po 0,75 minuty, pak zvyšovat o 10 °C/min. až na 60 °C, pak po 3 °C/min. až na 150 °C [2], pak zvýšit na 220 °C a udržovat tuto teplotu po 4,25 minuty. Specifický retenční čas pro ethyl-karbamát je 23 až 27 minut, pro propyl-karbamát 27 až 31 minut.

Rozhraní plynového chromatografu/spektrometru (GC/MS): převodní potrubí 220 °C. Parametry hmotnostního spektrometru ručně vyladěné perfluortributylaminem a optimalizované na nižší hmotnostní citlivost, režim snímání SIM, zpoždění rozpouštědla a čas zahájení snímání 22 minut, doba prodlevy/iont 100 ms.

b) Vakuová rotační odparka nebo koncentrační systém obdobný systému Kuderna Danish.

(

Poznámka:

rychlost regenerace ethyl-karbamátu ze zkušebního vzorku, C(g) musí být během procesu mezi 90 a 110 %.

)

c) Baňka – hruškovitého tvaru, 300 ml, jediné zabroušené hrdlo.

d) Koncentrační trubice – 4 ml, opatřená stupnicí, s teflonem potaženým spojem a zátkou.

C. Činidla

a) Aceton – kvalita LC

(

Poznámka:

před použitím v GC/MS zkontrolujte každou dávku na nepřítomnost odezvy pro ionty s m/z 62, 74 a 89.

)

b) Dichlormethan

(

Poznámka:

před použitím v GC/MS analyzujte každou dávku po 200násobné koncentraci pro kontrolu nepřítomnosti odezvy pro ionty s m/z 62, 74 a 89.

)

c) Ethanol - bezvodý

d) Standardní roztoky ethyl-karbamátu (EC)

1. Zásobní roztok – 1,00 mg/ml. Odvažte 100 mg EC (čistota 99 %) v odměrné baňce o objemu 100 ml a zřeďte acetonem.

2. Standardní pracovní roztok – 10,0 μg/ml. Přeneste 1 ml zásobního roztoku EC do odměrné baňky o objemu 100 ml a zřeďte acetonem až ke značce.

e) Propyl-karbamát (PC), standardní roztoky

1. Zásobní roztok – 1,00 mg/ml. Odvažte 100 mg PC (kvalita činidla) v odměrné baňce o objemu 100 ml a zřeďte acetonem.

2. Standardní pracovní roztok – 10,0 μg/ml. Přeneste 1 ml zásobního roztoku PC do odměrné baňky o objemu 100 ml a zřeďte acetonem až ke značce.

3. Vnitřní standard – 400 ng/ml. Přeneste 4 ml standardního pracovního roztoku PC do odměrné baňky o objemu 100 ml a zřeďte vodou až ke značce.

f) Standardní kalibrované roztoky EC-PC

Rozřeďte standardní pracovní roztok EC (d)(2) a standardní pracovní roztok PC (e)(2) dichlormethanem, abyste získali:

1. (100 ng EC a 400 ng PC)/ml;

2. (200 ng EC a 400 ng PC)/ml;

3. (400 ng EC a 400 ng PC)/ml;

4. (800 ng EC a 400 ng PC)/ml;

5. (1600 ng EC a 400 ng PC)/ml.

g) Zkušební vzorek – 100 ng EC/ml ve 40 % ethanolu

Přeneste 1 ml standardního pracovního roztoku EC (d)(2) do odměrné baňky o objemu 100 ml a zřeďte 40 % ethanolem až ke značce.

h) Extrakční kolona s pevnou fází – materiál na jedno použití naplněný křemelinou, kapacity 50 ml

Poznámka:

Před rozborem každou dávku extrakčních kolon zkontrolujte na regeneraci EC a PC a absenci odezvy pro ionty s m/z 62, 74 a 89. Připravte zkušební vzorek 100 ng EC/ml (g). Analyzujte 5,00 ml zkušebního vzorku podle popisu v D(a), E a F. Regenerace 90 až 110 ng EC/ml je uspokojivá. Absorpční činidla, jejichž průměr částic je nepravidelný, mohou vést a pomalému toku, což ovlivňuje regeneraci EC a PC. Pokud po několika zkouškách není dosaženo 90 až 110 % hodnoty zkušebního vzorku, vyměňte kolonu nebo k určení množství EC použijte upravenou kalibrační křivku regenerace. K získání upravené kalibrační křivky připravte standardní roztoky podle popisu v (f), ale místo dichlormethanu použijte 40 % ethanol.

Standardní kalibrační roztok analyzujte podle popisu v D, E a F.

Pomocí poměru EC/PC extrahovaných standardů stanovte novou kalibrační křivku.

D. Příprava zkušebního vzorku

Do dvou oddělených kádinek o objemu 100 ml vložte následující objemy testovaných materiálů.

a) vína o obsahu alkoholu více než 14 % objemových: 5,00 ± 0,01 ml;

b) vína o obsahu alkoholu nejvýše 14 % objemových: 20,00 ± 0,01 ml.

Do každé kádinky přidejte 1 ml roztoku vnitřního standardu PC C(e)(3) a vodu tak, abyste získali celkový objem 40 ml (nebo 40 g).

E. Extrakce

Extrakci je třeba provádět pod digestoří s přiměřeným odtahem.

Vzorek připravený podle bodu D přeneste do extrakční kolony.

Kádinku vypláchněte 10 ml vody a vyplachovací vodu přeneste do kolony.

Ponechte kapalinu absorbovat po dobu čtyř minut. Vymyjte 2 x 80 ml dichlormethanu. Eluát zachycujte v kuželové baňce o objemu 300 ml.

Odpařte eluát na 2 až 3 ml v rotační odparce na vodní lázni o teplotě 30 °C (poznámka: nenechte odpařit do sucha).

Koncentrovaný zbytek přeneste Pasteurovou pipetou do trubice se stupnicí o objemu 4 ml.

Baňku vypláchněte 1 ml dichlormetanu a vyplachovací tekutinu přeneste do trubice. Vzorek koncentrujte na 1 ml pod slabým proudem dusíku.

V případě potřeby přeneste koncentrát do baňky automatického vzorkovače k rozboru GC/MS.

F. Rozbor GC/MS

a) Kalibrační křivka

Do GC/MS vstříkněte 1 μl každého standardního kalibračního roztoku C(f). Nakreslete graf poměru plochy EC-PC pro odezvu iontů s m/z 62 na svislé ose a množství EC v ng/mg na vodorovné ose (100, 200, 400, 800 a 1600 ng/ml).

b) Kvantifikace EC

Do systému GC/MS vstříkněte 1 μl koncentrovaného extraktu připraveného podle E a vypočítejte poměr plochy EC-PC pro iont s m/z 62. Pomocí kalibrační křivky vnitřního standardu stanovte koncentraci EC (ng/ml) v extraktu. Vypočítejte koncentraci EC v zkušebním vzorku (ng/ml) tak, že vydělíte množství EC (ng) v extraktu objemem zkušebního vzorku (ml).

c) Potvrzení totožnosti EC

Stanovte, zda se odezvy pro ionty s m/z 62, 74 a 89 objevují během retenčního času EC. Tyto odezvy jsou typické pro hlavní fragmenty (M–C2H2)+ a (M–CH3)+ a molekulový iont (M)+. Přítomnost EC se potvrzuje, pokud relativní poměry těchto iontů jsou mezi 20 % poměrů pro standard EC. Extrakt může být nutné dále koncentrovat za účelem dosažení dostatečné odezvy pro iont m/z 89.

G. Mezilaboratorní testy

Tabulka udává jednotlivé výsledky pro praktický připravený vzorek a pro oba typy vína.

Cochranův test vedl k vyloučení pouze jedné dvojice výsledků, pro víno o obsahu alkoholu více než 14 % objemových a pro víno o obsahu alkoholu nejvýše 14 % objemových ze dvou různých laboratoří.

Relativní reprodukovatelnost (RSDR) má sklon k poklesu s tím, jak se zvyšuje koncentrace ethyl-karbamátu.

Provedení metody pro určení ethyl-karbamátu EC v alkoholických nápojích pomocí GC/MS.

Vzorek | Zjištěný průměr EC (ng/ml) | Regenerace přidaného EC (%) | Sr | SR | RSDr (%) | RSDR (%) |

Vína < 14 % obj. | 40 | | 1,59 | 4,77 | 4,01 | 12,02 |

| 80 | 89 | 3,32 | 7,00 | 4,14 | 8,74 |

| 162 | 90 | 8,20 | 11,11 | 5,05 | 6,84 |

Vína ≤ 14 % obj. | 11 | | 0,43 | 2,03 | 3,94 | 18,47 |

| 25 | 93 | 1,67 | 2,67 | 6,73 | 10,73 |

| 48 | 93 | 1,97 | 4,25 | 4,10 | 8,86 |

[1] Pro určitá zvlášť plná vína může být žádoucí kapilární kolona 50 m.

[2] Pro určitá zvlášť plná vína může být žádoucí teplotní program 2 °C/min.

--------------------------------------------------