kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí

Popsané metody a přístroje jsou určeny pro stanovení teploty tání látek, bez omezení z hlediska jejich čistoty.

Volba nejvhodnější metody závisí na charakteru zkoumané látky, zda danou látku je možné rozmělnit na prášek snadno, obtížně nebo vůbec ne.

Pro některé látky je vhodnější spíše stanovení teploty tuhnutí nebo krystalizace, do popisu metod byly zahrnuty i tyto postupy.

Pokud vzhledem k vlastnostem studované látky nelze dobře měřit žádný z uvedených parametrů, může být použita teplota tekutosti.

Teplotou tání se rozumí teplota, při které za normálního atmosférického tlaku dochází k přechodu mezi tuhou a kapalnou fází. Za ideálních podmínek odpovídá tato teplota teplotě tuhnutí.

Přepočet jednotek (K na ºC):

t = T - 273,15

Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

Některé kalibrační látky jsou uvedeny v literatuře (4).

Stanovuje se teplota nebo teplotní rozmezí fázové přeměny z tuhého do kapalného skupenství nebo z kapalného do tuhého skupenství. Při zahřívání/ochlazování vzorku studované látky za atmosférického tlaku se stanoví teploty počátku tání/tuhnutí a konce tání/tuhnutí. Je popsáno pět typů metod: kapilární metody, metody používající zahřívací bloky, stanovení teploty tuhnutí, metody termické analýzy a stanovení bodu tekutostičení (jak byl zaveden pro minerální oleje). V některých případech může být vhodné měřit místo teploty tání teplotu tuhnutí.

Postupy téměř všech zde uvedených zkušebních metod jsou popsány v národních a mezinárodních normách (viz Příloha 1).

Metody a zařízení zde popsaná je možné použít pro kapaliny a látky s nízkou teplotou tání, pokud nepodléhají chemickým reakcím ještě pod teplotou varu (např. autooxidaci, přesmyku, rozkladu, atd.). Metody lze aplikovat na čisté i znečištěné kapaliny.

Přednost je třeba dát metodám s detekcí fotočlánkem a metodám termické analýzy, protože umožňují určení jak teplot tání, tak teplot varu. Navíc tato měření mohou být prováděna automaticky.

„Dynamická metoda“ má tu výhodu, že ji lze použít i ke stanovení tenze par. Přitom není třeba korigovat teplotu varu na normální tlak (101, 325 kPa), protože ten lze během měření nastavit manostatem.

Poznámky

Vliv nečistot na stanovení teploty varu závisí ve velké míře na jejich povaze. Jestliže vzorek obsahuje těkavé nečistoty, které mohou ovlivnit výsledky, může být látka přečištěna.

Standardní teplota varu je definována jako teplota, při které tenze páry dané kapaliny činí 101,325 kPa.

Jestliže se měření teploty varu neprovádí za normálního tlaku, lze využít závislosti tenze páry na teplotě popsané Clausiusovou-Clapeyronovou rovnicí:

log⁡p=ΔHv2,3RT+konst.

Teplota varu se uvádí s udáním okolního tlaku při měření.

Přepočty:

Tlak (jednotka: kPa)

100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa

(jednotka „bar“ je nadále přípustná, její používání se však nedoporučuje).

133 Pa = 1 mm Hg = 1 torr

(jednotky „mm Hg“ a „torr“ nejsou povoleny).

1 atm = standardní atmosféra = 101 325 Pa

(jednotka „atm“ není povolena).

Teplota (jednotka: K)

t =T-273,15

t: Celsiova teplota, stupeň Celsia (°C)

T: termodynamická teplota, kelvin (K)

Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

Některé kalibrační látky je možné nalézt u metod uvedených v příloze.

Pět metod stanovení teploty varu (teplotního rozmezí varu) je založeno přímo na měření této teploty, další dvě využívají termální analýzy.

Použitelnost a přesnost jednotlivých postupů stanovení teploty varu a teplotního rozmezí varu jsou patrné z tabulky 1.

TABULKA 1. POROVNÁNÍ METOD STANOVENÍ TEPLOTY VARU

V mezinárodních a národních normách bylo popsáno několik metod (viz příloha).

Metody stanovení relativní hustoty, které jsou zde popsány, platí pro tuhé látky a kapaliny bez jakýchkoli požadavků na jejich čistotu. Jednotlivé metody, kterých je možno použít, jsou uvedeny v tabulce 1.

Relativní hustota (D₄ ²⁰) tuhých látek nebo kapalin je poměr mezi hmotností určitého objemu sledované látky, měřenou při 20 °C, a hmotnosti stejného objemu vody, stanovenou při 4 °C. Relativní hustota nemá žádný rozměr.

Hustota látky

p= mv kg .m-3

Referenční látky není nutné používat ve všech případech, kdy se studuje nová látka. Referenční látky by měly sloužit zejména k občasné kalibraci měřícího uspořádání a k porovnání výsledků při použití jiných metod.

Používají se čtyři skupiny metod.

Použitelnost metod pro stanovení relativní hustoty je uvedena v tabulce.

Technické podrobnosti mohou být nalezeny v normách, které jsou uvedeny v příloze.

Zkoušky je třeba provádět při 20 °C, přičemž je třeba uskutečnit nejméně dvě měření.

Pro provádění zkoušky je užitečné mít předběžné informace o struktuře a o teplotách tání a varu zkoumané látky.

Neexistuje žádná metoda vhodná pro celou oblast měření tenze par. Proto je pro měření tenze par v rozmezí od ‹ 10^-4 Pa do 10⁵ Pa doporučeno několik metod.

Tenze par dané látky je ovlivněna nečistotami v ní obsaženými. Vliv nečistot na tenzi par závisí ve značné míře na jejich druhu.

Je-li ve vzorku přitomné snadno těkavé rozpouštědlo, které by mohlo ovlivnit výsledek, měla by být látka přečištěna. Je-li to požadováno, může být měřen tlak par i u vzorku technické kvality.

U některých zde popsaných metod jsou užívány aparatury s kovovými díly.

Tato skutečnost by měla být brána v úvahu při zkoušení korozivních látek.

Tenze par dané látky je definována jako tlak nasycené páry nad tuhou nebo kapalnou látkou. Při termodynamické rovnováze je tenze par čisté látky výlučně funkcí teploty.

Jednotkou soustavy SI pro tlak je pascal (Pa).

Dále jsou uvedeny některé dříve používané jednotky s odpovídajícími přepočítacími faktory:

Jednotkou teploty v soustavě SI je kelvin (K).

Univerzální molární plynová konstanta R má hodnotu 8,314 J mol^-1 K^-1.

Závislost tenze par na teplotě je popsána Clausiusovou - Clapeyronovou rovnicí:

log⁡p= ΔHv2,3RT+konst.

Referenční látky není nutné používat ve všech případech, ve kterých se zkoumá nová látka. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kalibraci měřícího uspořádání a k porovnání výsledků při použití různých metod.

Pro stanovení tenze par je navrženo sedm metod, které je možné používat v různých oblastech hodnot tenze par. Každou z metod se stanovuje tenze par při různých teplotách. V omezeném rozsahu teplot je logaritmus tenze par čisté látky nepřímo úměrný teplotě.

V tabulce je uvedeno srovnání jednotlivých metod stanovení tenze par z hlediska jejich použitelnosti, opakovatelnosti, reprodukovatelnosti, oblasti měření a existujících norem.

TABULKA: KRITÉRIA JAKOSTI

Metody, které jsou zde popsány, se používají k měření povrchového napětí vodných roztoků.

Před provedením těchto zkoušek je účelné mít k dispozici informace o rozpustnosti látky ve vodě, o její struktuře, o hydrolýze a o kritické koncentraci pro tvorbu micel.

Dále uvedené metody je možné používat pro všechny chemické látky bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.

Měření povrchového napětí prstencovou metodou je omezeno na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižší než cca 200 mPa.s.

Povrchová volná entalpie vztažená na jednotku povrchu se nazývá povrchové napětí.

Vyjadřuje se v těchto jednotkách:

N.m ^-1 (jednotka v soustavě SI), nebo

mN.m ^-1 (odvozená jednotka v soustavě SI),

1 N.m^-1 = 10³ dyn.cm^-1,

1 mN.m^-1 = 1 dyn.cm^-1 v zastaralé soustavě CGS.

Referenční látky není nutné používat ve všech případech, ve kterých se studuje nová látka. Referenční látky by měly v první řadě sloužit k občasné kalibraci měřícího zařízení, a při použití jiné metody, k porovnání výsledků.

Referenční látky, které pokrývají široký obor hodnot povrchového napětí, jsou uvedeny v literatuře (1) a (3).

Metody jsou založeny na měření největší síly, kterou je nutné působit ve svislém směru na třmínek nebo prstenec, který se dotýká sledované kapaliny naplněné v měřící nádobě, aby se z této kapaliny vytáhl. Nebo se působí silou na destičku, která se svým okrajem dotýká povrchu, aby se vzniklý film vytáhl nahoru. Látky, jejichž rozpustnost ve vodě dosahuje koncentrace alespoň 1 mg.l^-1 se měří ve vodných roztocích jednotkové koncentrace.

Přesnost těchto metod pravděpodobně překračuje veškeré požadavky kontroly v ochraně životního prostředí.

Připraví se roztok látky v destilované vodě. Koncentrace roztoku by měla být 90 % koncentrace nasyceného roztoku látky ve vodě. Pokud tato koncentrace přesáhne 1 g.l^-1, použije se k měření roztok o koncentraci 1 g.l^-1. Látky, jejichž rozpustnost je nižší než 1 mg.l^-1 je zbytečné zkoušet.

Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující informace:

- použitá metoda,

- druh vody nebo použitého roztoku,

- přesná specifikace látky (identifikace a nečistoty),

- výsledky měření: jak odečtené hodnoty povrchového napětí s uvedením jednotlivých naměřených hodnot a jejich aritmetického průměru, tak korigované střední hodnoty (přičemž se bere v úvahu jak cejchovací faktor, tak tabulka korekcí),

- koncentrace roztoku,

- teplota při měření,

- stáří měřeného roztoku, zejména časový odstup mezi přípravou roztoku a měřením,

- znázornění časové závislosti povrchového napětí po nalití roztoku do měřící nádoby,

- je třeba uvést veškeré informace a poznámky užitečné pro vyhodnocení výsledků, zejména co se týká nečistot a skupenství

Vzhledem k tomu, že povrchové napětí vody je 72,75 mN.m^-1 při 20 °C, látky u nichž bylo touto metodou naměřeno povrchové napětí menší než 60 mN.m^-1, se chápou jako povrchově aktivní materiály.

Před provedením vlastního měření by měly být k dispozici informace o strukturním vzorci, tenzi par, disociační konstantě a chování látky při hydrolýze ( jako funkce pH).

Pro celý rozsah rozpustnosti ve vodě neexistuje jedna jediná metoda.

Dvě níže popsané metody pokrývají celý obor rozpustnosti, avšak nejsou použitelné pro těkavé látky:

- první metoda, která je použitelná pro čisté látky s malou rozpustností (< 10^-2 g.l^-1), stálé ve vodě; tato metoda se označuje jako „sloupcová eluční metoda“;

- druhá metoda, která je použitelná pro čisté látky s vyšší rozpustností (> 10^-2 g.l^-1), stálé ve vodě; tento postup se označuje jako „baňková metoda“.

Rozpustnost zkoumané látky ve vodě může být značně ovlivněna nečistotami.

Rozpustnost dané látky ve vodě je definována hmotnostní koncentrací jejího nasyceného roztoku ve vodě při dané teplotě. Rozpustnost ve vodě se udává v jednotkách hmotnosti v objemu roztoku. Jednotka v soustavě SI je kg.m^-3 (může se také používat g.l^-1).

Referenční látky není nutné používat ve všech případech, ve kterých se studuje nová látka. Referenční látky by měly sloužit v prvé řadě k občasné kontrole provádění metody a k porovnání s výsledky jiných metod.

Jednoduchým předběžným pokusem by se mělo stanovit přibližné potřebné množství vzorku a doba nutná pro dosažení nasycené koncentrace.

Pro každý pokus se spočítá střední hodnota z nejméně pěti po sobě následujících odebraných vzorků, vybraných z oblasti po dosažení rovnovážného nasycení měřenou látkou. Výsledky se udávají ve hmotnostních jednotkách na jednotku objemu roztoku.

Porovnají se průměry dvou nezávislých pokusů provedených za různých rychlostí průtoku. Jejich opakovatelnost musí být menší než 30 %.

Pro každou ze tří baněk se zaznamenají samostatně výsledky, které pokud jsou ustálené (opakovatelnost je menší než 15 %) se zprůměrují a udá se rozpustnost ve hmotnostních jednotkách na jednotku objemu roztoku. Pokud je rozpustnost velmi vysoká (více než 100 g.l^-1), vyžaduje to přepočet hmotnostních jednotek na objemové jednotky s využitím hustoty roztoku.

Protokol o zkoušce by měl pokud možno obsahovat následující informace:

- výsledky předběžného měření,

- přesný popis studované látky (identifikace a nečistoty),

- koncentrace, hodnoty rychlosti průtoku a pH pro každý vzorek,

- průměrné hodnoty a směrodatné odchylky pro nejméně pět vzorků z oblasti ploché části křivky nasycení z každého pokusu,

- průměrné hodnoty ze dvou po sobě následujících přijatelných měření,

- teplota vody během procesu rozpouštění,

- použitý analytický postup,

- druh použitého materiálu nosiče,

- způsob nanesení studované látky na nosič,

- použité rozpouštědlo,

- informace o jakékoliv chemické nestálosti studované látky během zkoušky a při použité analytické metodě,

- všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledku, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.

Protokol o zkoušce by měl pokud možno obsahovat tyto údaje:

- výsledky předběžného měření,

- přesný popis studované látky (identifikace a nečistoty),

- výsledky jednotlivých analýz a průměrné hodnoty, pokud byla pro jednu baňku stanovena více než jedna hodnota,

- hodnota pH každého vzorku,

- průměrná hodnota pro ty baňky, jejichž výsledky se shodují,

- teplota při stanovení,

- použitá analytická metoda,

- informace o jakékoliv chemické nestálosti studované látky během zkoušky a při použité analytické metodě,

- všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.

Pro provedení této zkoušky je užitečné, jsou-li před vlastním stanovením k dispozici předběžné informace o strukturním vzorci, disociační konstantě, rozpustnosti ve vodě, hydrolýze, rozpustnosti v n-oktanolu a o povrchovém napětí látky.

U disociujících látek je nutné provádět měření pouze v jejich nedisociované formě (volná kyselina nebo volná báze), získané použitím vhodného tlumivého systému o pH nejméně o jednu jednotku nižším (volná kyselina) nebo vyšším (volná báze) než pK.

Tato zkušební metoda zahrnuje dva samostatné postupy: metodu třepací láhve a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC). První z metod lze použít, ležíli hodnota log P_ow (definice viz dále) v oblasti -2 až 4, druhá, leží-li hodnota log P_ow v oblasti 0 až 6. Před provedením kteréhokoli ze zkušebních postupů je nutné nejdříve získat předběžný odhad rozdělovacího koeficientu.

Metoda třepací láhve je použitelná pouze pro čisté látky, které jsou rozpustné ve vodě a n-oktanolu. Nelze ji použít pro povrchově aktivní látky (pro které je nutné uvést hodnotu získanou výpočtem nebo odhad založený na příslušných rozpustnostech v n-oktanolu a vodě).

Metoda HPLC není použitelná pro silné kyseliny a zásady, komplexní kovové sloučeniny, povrchově aktivní látky a látky, které reagují s eluentem. Pro tyto látky je nutné uvést hodnotu získanou výpočtem nebo odhad založený na příslušných rozpustnostech v n-oktanolu a vodě.

Metoda HPLC je méně citlivá na přítomnost nečistot ve zkoušené látce, než metoda třepací láhve. Někdy však mohou nečistoty ztížit interpretaci výsledků, protože se stává nejistým určení píků. U směsí, které poskytují nerozlišitelný svazek, je nutné uvést spodní a horní mez log P.

Rozdělovací koeficient (P) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací (C_i) rozpuštěné látky v dvoufázovém systému tvořeném dvěma prakticky nemísitelnými rozpouštědly.

V případě n-oktanolu a vody platí:

Pow= cocw

kde

c_o = rovnovážná koncentrace látky v n-oktanolu,

c_w = rovnovážná koncentrace látky ve vodě.

Rozdělovací koeficient (P) je tedy podíl dvou koncentrací a udává se obvykle ve formě svého dekadického logaritmu (log P).

Metoda třepací láhve

Referenční látky není nutné používat ve všech případech, ve kterých se zkouší nová látka. Referenční látky musí v první řadě sloužit k občasné kontrole metody a umožnit porovnání výsledků při použití jiné metody.

Metoda HPLC

Za účelem korelace hodnot, naměřených pro danou látku metodou HPLC, s její hodnotou P, je nutné sestrojit kalibrační graf závislosti log P na chromatografických údajích, tvořený nejméně 6 referenčními body. Volba vhodných referenčních látek se přenechává uživateli. Pokud je to možné, měla by mít alespoň jedna referenční látka P_ow vyšší než zkoušená látka a jiná referenční látka P_ow nižší než zkoušená látka. U hodnot log P nižších než 4 může být kalibrace založena na údajích, získaných metodou třepací láhve. U hodnot log P vyšších než 4 může být kalibrace založena na ověřených hodnotách z literatury, pokud jsou tyto v souladu s vypočtenými hodnotami. Za účelem dosažení vyšší přesnosti je nejlépe zvolit referenční látky, které jsou svou strukturou příbuzné se zkoušenou látkou.

Existují obsáhlé seznamy hodnot P_ow pro mnoho skupin chemických látek (2),(3). Pokud nejsou k dispozici údaje o rozdělovacích koeficientech strukturně příbuzných látek, je možné použít obecnější kalibraci s jinými referenčními látkami. Seznam doporučených referenčních látek a jejich hodnot P_ow je uveden v dodatku 2.

Účelem této zkoušky je určit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Aby se co nejvíce usnadnil výběr nejvhodnější zkušební metody (statické, semistatické nebo průtokové) a zajistily se dostatečně konstantní koncentrace zkoušené látky po celou dobu experimentu, je nutné mít v co nejúplnější míře k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi páry, o chemické stabilitě, o disociační konstantě a o biologické rozložitelnosti zkoumané látky.

Jak při plánování tak i při interpretaci výsledků je třeba brát v úvahu další potřebné údaje (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a procentuální podíl významných nečistot, přítomnost a množství aditiv, jakož i rozdělovací koeficient n - oktanol/voda).

Akutní toxicitou se rozumí zjevný nežádoucí účinek, který v organismu vyvolá během krátké doby působení (řádově dny) daná látka. Při této zkoušce se vyjadřuje akutní toxicita jako střední letální koncentrace (LC₅₀); to je taková koncentrace látky ve vodě, která během trvalé expozice po určitou dobu usmrtí 50 % jedinců zkušební skupiny ryb.

Koncetrace zkoušené látky se udávají jako hmotnost na objem (mg.l^-1). Mohou se také vyjádřit ve hmotnostních podílech (mg.kg^-1).

Aby se prokázalo, že se reakce zkušebních druhů ryb za experimentálních podmínek v laboratoři podstatně nezměnila je možné provést kontrolní zkoušku s referenční látkou.

Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.

Aby se prokázalo, že LC₅₀ je vyšší než 100 mg.l^-1 může se provést limitní zkouška.

Ryby se vystaví účinku různých koncentrací studované látky přidané do vody po dobu 96 hodin. Úhyny se zjišťují nejméně každých 24 hodin a pokud je to možné, vypočtou se při každém pozorování také koncentrace, které usmrtí 50 % ryb (LC₅₀).

Kritéria kvality se vztahují na limitní zkoušku i na úplnou zkoušku.

Úhyn v kontrolních skupinách nesmí přesáhnout 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použije skupina menší než deset jedinců) až do konce zkoušky.

Koncentrace rozpuštěného kyslíku se musí udržet na 60 % hodnot nasycení vzduchem.

Koncentrace zkoušených látek by neměla poklesnout pod 80 % původních koncentrací po celou dobu trvání zkoušky.

U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují se či se neadsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena musí být dokladováno.

Pro látky, které jsou:

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po určitém období jejího ustálení, ale před vložením ryb.

Za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality se musí ve všech případech provádět další měření koncentrace během zkoušky.

pH by se nemělo změnit o více než o 1 jednotku.

Zkouška může být provedena jednou ze tří metod:

Statická metoda: Zkouška, při které zkoušený roztok neprotéká. (Roztoky se nemění během celé doby trvání zkoušky.)

Semistatická metoda: Zkouška bez průtoku zkoušeného roztoku, ale s jeho pravidelnou obměnou po delších časových úsecích (např. po 24 hodinách).

Průtoková metoda: Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádobách neustále obměňuje, přičemž studovaná látka se přivádí s vodou pro obnovu zkušebního média.

Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci zkoušené látky pro imobilizaci (EC₅₀) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před začátkem experimentu je třeba mít v co nejúplnější míře k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi páry, o chemické stabilitě, o disociační kontantě a o biologické rozložitelnosti zkoušené látky.

Jak při plánování, tak i při interpretaci výsledků zkoušek je třeba brát v úvahu další údaje, jako např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a procentuální podíl významných nečistot, přítomnost a množství přídavných látek, jakož i rozdělovací koeficient n-oktanol/voda.

Požadavek předpisů na stanovení LC₅₀ pro dafnie se naplňuje stanovením EC₅₀, jak je popsáno v této zkušební metodě.

Ve smyslu této zkušební metody se rozumí akutní toxicitou imobilizace dafnií střední efektivní (účinnou) koncentrací (EC₅₀). Je to taková koncentrace (vztaženo na výchozí koncentraci), která imobilizuje 50 % dafnií zkušební skupiny během doby působení (doby expozice).

Neschopnost plavání - imobilizace

Za neschopné plavání se považují ty dafnie, které po lehkém pohybu experimentální nádobou nevykazují během 15 sekund žádné plavací pohyby.

Veškeré koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost na objem (mg.l^-1) nebo hmotnost na hmotnost (mg.kg^-1).

Aby se prokázalo, že se reakce zkušebních dafnií za experimentálních podmínek v laboratoři podstatně nezměnila je možné provést kontrolní zkoušku s referenční látkou.

Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.

Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím 4 různých látek je uveden v příloze 2.

Aby se prokázalo, že EC50 je vyšší než 100 mg.l^-1, může se provést limitní zkouška.

Dafnie se vystaví na 48 hodin účinku zkoušené látky přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se doba kratší, zdůvodní se ve zprávě.

Za jinak stejných experimentálních podmínek a v odpovídajícím rozmezí zkoušených koncentrací působí různé koncentrace dané zkoušené látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Při různých koncentracích se pak po uplynutí zkušební doby objeví vždy určité procentuální podíly dafnií neschopných plavání. Koncentrace způsobující neschopnost plavání u 0 % resp. 100 % se získají přímo pozorováním, zatímco hodnota EC₅₀ pro 48 hodin se získá, pokud je to možné, výpočtem.

Při této metodě se používá statický postup. Experimentální roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.

Kritéria kvality se vztahují na limitní i úplnou zkoušku.

Imobilizace v kontrolních skupinách nesmí přesáhnout 10 % na konci zkoušky.

Dafnie v kontrolních skupinách nesmí být zachyceny na povrchu vody.

Je žádoucí, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušebních nádobách zůstala vyšší než 3 mg.l^-1 po celou dobu zkoušky. Za žádných okolností nesmí poklesnout pod 2 mg.l^-1.

Koncentrace zkoušených látek by se měla udržet v rozmezí 80 % původních koncentrací po celou dobu trvání zkoušky.

U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují či se neadsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena musí být dokladováno.

Pro látky, které jsou:

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po určitém období ustálení, ale před vnesením dafnií.

Ve všech případech se musí provádět další měření koncentrace během zkoušky za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality.

pH by se nemělo změnit o více než 1 jednotku.

Cílem zkoušky je určení vlivu látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobé pokusy (72 hodin) mohou být použity na zhodnocení účinků na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití na několika druzích řas, přičemž protokol o zkoušce musí obsahovat popis metodiky.

Metoda je vhodná zejména pro stabilní látky rozpustné za podmínek zkoušky ve vodě.

Metoda je použitelná pro látky, které přimo neinterferují s měřením růstu řas. Pokud je to možné, je žádoucí mít ještě před začátkem testu informace o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, o chemické stabilitě, o disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti odbouratelnosti látky

Jak při plánování zkoušky, tak při interpretaci výsledků by měly být brány v úvahu další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty látky, podstata a procento znečištění látky, přítomnost a množství aditiv, rozdělovací koeficient n-oktanol/voda).

Hustota buněk: počet buněk na 1 ml.

Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.

Rychlost růstu: přírůstek hustoty buněk za jednotku času.

EC₅₀: koncentrace zkoušené látky, která inhibuje růst buněk nebo snižuje růstovou rychlost o 50 % ve srovnání s kontrolou.

NOEC (no observed effect concentration): je nejvyšší zkoumaná koncentrace, při které nedochází k žádnému statisticky zjistitelnému snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.

Referenční látka může být použita jako prostředek na ověření faktu, že za laboratorních podmínek zkoušky se citlivost zkušebních organizmů významně nezměnila.

Použití referenční látky je nutné uvést do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních zkouškách (viz.(3) a příloha 2).

Za účelem prokázání, že EC₅₀ je vyšší než 100 mg.l^-1 je možné provést limitní zkoušku při této koncentraci.

Exponencielně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou vystaveny účinku různých koncentrací zkoušené látky za definovaných podmínek.

Zkoušené roztoky se inkubují 72 hodin, během nichž se měří hustota buněk v každém roztoku přinejmenším každých 24 hodin. Je stanovována inhibice růstu ve vztahu ke kontrolní kultuře.

Kritéria kvality se vztahují na limitní zkoušku i na úplnou zkoušku.

Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla zvýšit přinejmenším šestnáctkrát za 3 dny.

Koncentrace zkoušených látek by se měla udržet v rozmezí 80 % původní koncentrace po celou dobu trvání zkoušky.

U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují či adsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena, musí být dokladováno.

Pro látky, které jsou:

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po jejím ustálení.

Ve všech případech se musí provádět další měření koncentrace během zkoušky za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality.

Je známo, že podstatná část zkoušené látky se může během zkoušky zabudovat do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií kvality mělo brát v úvahu jak množství látky inkorporované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, když to není technicky možné změřit, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, dodržení kritérií kvality může být prokázáno změřením nejvyšší koncentrace látky ve zkušební nádobě bez řas a stanovením koncentrace v roztoku (nebo, jestliže to není technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky.

Plocha mezi růstovou křivkou a vodorovnou čarou N = N_o se vypočítá podle následující rovnice:

A= N1- N2 2 . t1+ N1+ N2- 2No2 .t2- t1+…+Nn-1+ Nn- 2N02. (tn- tn-1)

kde je

A - plocha

N_o - počet buněk.ml^-1 v čase t_o (na počátku zkoušky)

N₁ - změřená hustota buněk v čase t₁

N_n - změřená hustota buněk v čase t_n

t₁ - doba prvního měření od počátku zkoušky

t_n - doba n-tého měření od počátku zkoušky

n - počet měření od počátku zkoušky

Inhibice růstu v % (I_A) pro každou koncentraci zkoušené látky se vypočítá podle rovnice:

Ia= Ac- AtAc . 100

kde

A_c = plocha mezi růstovou křivkou kontrolní zkoušky a horizontální linií N = N₀,

A_t = plocha mezi růstovou křivkou při koncentraci t a horizontální linií N = N₀.

Hodnoty I_a se nanesou na semilogaritmický nebo na semilogaritmicko-probitový papír proti jednotlivým koncentracím. Po vynesení bodů na papír se tyto spojí od oka nebo vypočtenou regresní přímkou.

Hodnota EC₅₀ se odečítá na průsečíku regresní čáry a rovnoběžky s osou x v bodě I_a = 50 %. Abychom tuto hodnotu označili jednoznačně podle použité metody vyhodnocení doporučuje se použít symbol E_bC₅₀. Důležité je, že hodnota E_bC₅₀ je spojena s označením příslušné exposiční doby tj. E_bC₅₀ (0-72h).

Průměrná specifická rychlost růstu (µ) pro exponenciálně rostoucí kultury se vypočte jako:

μ= 1nNn-1nN0tn - t0

kde t₀ je čas počátku zkoušky.

Procento inhibice specifické rychlosti růstu při každé koncentraci zkoušené látky (I_µt) se vypočte podle vzorce:

Iμt= μc- μtμc . 100

kde

µc = průměrná specifická rychlost růstu kontrol,

µt = průměrná specifická rychlost růstu při koncentraci t.

Snížený průměrný růst v % ve srovnání s kontrolní hodnotou, při všech koncentracích zkoušené látky se nanese proti logaritmu koncentrace. Z takto vzniklého grafického znázornění lze odečíst hodnoty EC₅₀. Pro přesné označení bodu EC₅₀, zjištěného touto metodou se doporučuje použít symbol E_rC₅₀. Musí se uvést časy pozorování, tzn. hodnoty vztažené k dobám 0 - 72 h se označí symbolem E_rC₅₀ (0 - 72 h).

Poznámka: Specifická rychlost růstu je logaritmický výraz, nepatrné změny rychlosti růstu mohou odpovídat velkým změnám biomasy. Hodnoty E_bC a E_rC jsou proto numericky nesrovnatelné.

Hodnota NOEC se stanoví vhodnou statistickou metodou pro mnohočetné srovnávání vzorků (např. analýza variance a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch oblastí pod růstovými křivkami A (viz bod 2. 1) nebo specifických rychlostí růstu µ (viz bod 2. 2).

Je popsáno šest zkušebních metod, které umožňují vyhledávací posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:

Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a orientační poznámky.

Mezilaboratorní srovnávací pokus OECD, provedený v roce 1988, ukázal, že uvedené metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru zkoušené látky však může být v daném případě nejvhodnější určitá konkrétní metoda.

Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, o tenzi par a o adsorpční charakteristice dané chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO₂ , DOC, TOC, CHSK (viz přílohy 1 a 2) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.

Zkoušené chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě činí alespoň 100 mg.l_-1, je možné zkoušet všemi metodami za předpokladu, že jsou netěkavé a neadsorbují se. Pro látky málo rozpustné ve vodě, těkavé nebo adsorbovatelné jsou vhodné metody uvedeny v tabulce 1. Způsob, kterým je třeba zacházet s látkami málo rozpustnými ve vodě a těkavými, je popsán v příloze 3. Mírně těkavé látky je možné zkoušet metodou úbytku DOC, pokud ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) existuje dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro podchycení případné fyzikální ztráty.

Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkoušeného materiálu.

Pro volbu vhodných koncentrací pro zkoušku mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkoušené chemické látky pro bakterie (příloha 4). Tyto informace mohou mít zásadní význam pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.

Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

Pro ověření postupu se zkoušejí souběžně se studovanou látkou referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.

Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), octan sodný a benzoan sodný. Tyto referenční chemické látky se uvedenými metodami všechny rozkládají i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.

Bylo navrženo hledat referenční chemickou látku, která by byla pohotově rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Byl navržen hydrogenftalát draselný. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.

V respirometrických zkouškách mohou příjem kyslíku ovlivnit látky obsahující dusík v důsledku nitrifikace (viz přílohy 2 a 5).

Roztok nebo suspenze zkoušené látky v minerálním prostředí se naočkuje a inkubuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difúzním světle. Množství DOC připadající ve zkoušeném roztoku na inokulum je třeba udržovat ve srovnání s DOC připadajícím na zkoušenou látku co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě paralelní slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky. Přitom endogenní aktivita buněk v přítomnosti zkoušené látky neodpovídá přesně aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se provádí souběžně zkouška s referenční látkou.

Obecně řečeno po rozkladu následuje stanovení parametrů jako DOC, tvorba CO₂ a příjem kyslíku. Měření se provádí v dostatečně častých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se měří doplňkově k jinému parametru DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Je rovněž možné použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkoušené látky nebo se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).

Zkouška normálně trvá 28 dní. Měření je však možné ukončit před uplynutím 28 dní, tj. jakmile křivka biologického rozkladu dosáhla na základě nejméně tří stanovení fáze vodorovného průběhu. Měření je také možné prodloužit i po 28 dnech, vyplývá-li z křivky, že biologický rozklad začal, avšak že v 28. den nebylo ještě dosaženo vodorovné části křivky.

Obecné podmínky pro zkoušky jsou přehledně uvedeny v tabulce 2. Aparatury a další experimentální podmínky, specifické pro jednotlivé metody, jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.

Při výpočtu D_t , procentního úbytku, se používají střední hodnoty z dvojích měření daného parametru v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu pro inokulum. Příslušné vzorce jsou uvedeny dále v kapitolách pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a označí se 10-denní okénko. Vypočte a uvede se procentní úbytek dosažený na konci 10-denního okénka a hodnota pro vodorovnou část křivky nebo na konci zkoušky podle toho, která z nich je vhodnější.

V respirometrických zkouškách mohou látky obsahující dusík ovlivnit příjem kyslíku v důsledku nitrifikace (viz příloha 2 a 5).

Protokol o zkoušce má obsahovat, je-li to možné, tyto údaje:

- zkoušená a referenční chemická látka, jejich čistota;

- podmínky při zkoušce;

- inokulum: charakter a místo (místa) odběru, koncentrace a předběžná kondicionace;

- podíl a charakter průmyslového odpadu obsaženého v odpadní vodě, jsou-li známy;

- doba trvání zkoušky a teplota;

- v případě málo rozpustných zkoušených látek použitý způsob zacházení;

- použitá metoda zkoušení; je třeba uvést vědecké důvody a vysvětlení pro každou změnu postupu;

- přehled dat;

- veškeré pozorované projevy inhibice;

- jakýkoliv pozorovaný abiotický rozklad;

- analytické údaje o meziproduktech, pokud existují;

- graf procentního rozkladu v závislosti na čase pro zkoušenou a referenční látku; je třeba zřetelně označit fázi zdržení, fázi rozkladu, 10-denní okénko a směrnici (příloha 1). Byla-li při zkoušce splněna kritéria kvality, je možné pro graf použít střední hodnotu procentního rozkladu v baňkách obsahujících zkoušenou látku;

- procentní rozklad po 10-denním okénku, na vodorovné části křivky a na konci zkoušky.

Příprava zásobních roztoků viz I. 6. 2.

Smísí se 10 ml roztoku (a) s 800 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se na 1 l zřeďovací vodou.

Inokulum je možné získat z řady zdrojů: aktivovaný kal; splaškové odpadní vody; povrchové vody; půda nebo směs z uvedených typů.

Viz I. 6. 4, I. 6. 4. 1, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

Je například možné naplnit podíly po 800 ml minerálního média do 2 l Erlenmeyerových baněk a do jednotlivých baněk přidat dostatečná množství zásobních roztoků zkoušné a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC.l^-1. Zkontrolují se hodnoty pH a případně se upraví na 7,4. Baňky se naočkují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I. 6. 4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných tuhých látek na litr. Připraví se rovněž kontrolní zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referenční látky.

V případě potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního efektu zkoušené látky naočkováním roztoku, který v minerálním médiu obsahuje srovnatelná množství jak zkoušené tak referenční látky.

Je-li třeba, použije se rovněž další, sterilní, baňka s roztokem dané chemické látky bez inokula (viz I. 6. 6) ke kontrole zda je zkoušená chemická látka rozkládána abioticky.

Existuje-li dále podezření, že se zkoušená látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce a tím vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulku 1). Použije se baňka obsahující zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo.

Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 l a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha 2, odst.4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla možná volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Pak se nádoby umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

Baňka 1 a 2: Zkoušená suspenze

Baňka 3 a 4: Slepý pokus s inokulem

Baňka 5: Kontrola postupu

Pokud možno a je-li třeba:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola adsorpce

Baňka 8: Kontrola toxicity

Viz také bod I. 6. 7.

Během zkoušky se ve známých časových intervalech stanoví dvojmo koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10-denního okénka a procentní úbytek na konci 10-denního okénka. Pro každé stanovení je třeba odebírat pouze minimální nutné množství zkoušené suspenze.

Před odběrem vzorků se případně nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství zřeďovací vody (I. 6. 1). Před odběrem vzorků je třeba kultivační médium dobře promíchat a zajistit, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspenze. Ihned po odběru je třeba vzorky zfiltrovat přes membránu nebo zcentrifugovat (viz přílohu 2.4). Zfiltrované resp. zcentrifugované vzorky je třeba analyzovat týž den, jinak je možné je přechovávat nejdéle 48 hodin při 2 - 4 °C nebo po delší dobu při teplotě nižší než - 18 °C.

Procentní rozklad v čase t se vypočte, jak je uvedeno v bodě I. 7. 1. (stanovení DOC) nebo případně v bodě I. 7. 2. (specifická analýza).

Všechny výsledky se uvedou na přiložených přehledech dat.

Viz bod I. 5. 2.

Viz bod I. 8.

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1 jako chemická látka

Počáteční koncentrace v médiu, t_o: mg.l^-1 jako chemická látka

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná kondicionace, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných tuhých látek v reakční směsi: mg.l^-1

* D1 a D2 nesmí být průměrovány,pokud je mezi nimi významný rozdíl.

Příprava zásobních roztoků viz I. 6. 2.

Smísí se 10 ml roztoku (a) s 80 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní na 1 l zřeďovací vodou.

Tato metoda používá jako inokulum pouze 0,5 ml přečištěné odpadní vody a proto je nutné médiu dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků na 1 litr výsledného média:

Roztok stopových prvků:

Rozpustí se ve zřeďovací vodě a doplní se na 1000 ml.

Vitaminový roztok:

Kvasničný extrakt 15,7 mg

Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 µm, nebo se připraví čerstvě.

Viz I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

Je například možné naplnit podíly po 800 ml minerálního média do 2 l Erlenmeyerových baněk a do jednotlivých baněk přidat dostatečná množství zásobních roztoků zkoušené a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC.l^-1. Zkontrolují se hodnoty pH a případně se upraví na 7,4. Baňky se naočkují výtokem z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I. 6. 4. 2). Připraví se rovněž kontrolní pokusy s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referenční látky.

V případě potřeby se použije jedna baňka ke kontrole možného inhibičního efektu zkoušené látky naočkováním roztoku, který v minerálním médiu obsahuje srovnatelné koncentrace jak zkoušené, tak referenční látky.

Je-li třeba, použije se rovněž další, sterilní, baňka ke kontrole, zda je zkoušená chemická látka rozkládána abioticky, pomocí roztoku dané chemické látky bez inokula (viz I. 6. 6).

Existuje-li důvodné podezření, že se zkoušená látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce a tím vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Použije se baňka obsahující zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo.

Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 l a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha 2.4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla možná volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Pak se nádoby umístí do třepačky čímž se zahájí zkouška.

Baňka 1 a 2: Zkoušená suspenze

Baňka 3 a 4: Slepý pokus s inokulem

Baňka 5: Kontrola postupu

Pokud možno a je-li třeba:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola adsorpce

Baňka 8: Kontrola toxicity

Viz také bod I. 6. 7.

Během zkoušky se ve známých časových intervalech stanoví dvojmo koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možno určit začátek 10-denního okénka a procentní úbytek na konci 10-denního okénka. Pro každé stanovení je třeba odebírat pouze minimální nutné množství zkoušené suspenze.

Před odběrem vzorků se případně nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství zřeďovací vody (I. 6. 1). Před odběrem vzorků je třeba kultivační médium dobře promíchat a zajistit, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspenze. Ihned po odběru je třeba vzorky zfiltrovat přes membránu nebo zcentrifugovat (viz přílohu 2. 4). Zfiltrované resp. zcentrifugované vzorky je třeba analyzovat týž den, jinak je možné je přechovávat nejdéle 48 hodin při 2 - 4 °C nebo po delší dobu při teplotě nižší než - 18 °C.

Procentní rozklad v čase t se vypočte, jak je uvedeno v bodě I. 7. 1. (stanovení DOC) nebo případně v bodě I. 7. 2. (specifická analýza).

Všechny výsledky se uvedou na přiložených přehledech dat.

Viz bod I. 5. 2.

Viz bod I. 8.

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1 jako chemická látka

Počáteční koncentrace v médiu, to: mg.l^-1 jako chemická látka

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná kondicionace, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných tuhých látek v reakční směsi: mg.l^-1

* D1 a D2 nesmí být průměrovány,pokud je mezi nimi významný rozdíl.

Poznámka: obdobný vzor může být použit i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

Příprava zásobních roztoků je popsána v části I. 6. 2..

Roztok (a) v množství 10 ml se smíchá s 800 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní do 1 l zřeďovací vodou.

Inokulum má pocházet z různých zdrojů: aktivovaný kal, odtok z městské čistírny, povrchová voda, půdy či směs z uvedených.

Viz. část I. 6. 4, I. 6. 4. 1, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

Jako příklad je uváděno uspořádání pro 5 l baňky s obsahem 3 l suspenze.

V případě použití jiných objemů se hodnoty úměrně upraví tak, aby se zajistilo přesné měření vytvořeného CO₂.

Do každé 5 l baňky se vnese 2400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I. 6. 4. 1 a I. 6. 5) tak, aby koncentrace aktivovaného kalu byla 30 mg.l^-1 v konečném objemu 3 l inokulované směsi. Alternativně lze zředit kal tak, aby se získala suspenze 500 - 1000 mg.l^-1 v minerálním médiu a to ještě před přídavkem alikvotní části do 5 l baňky k dosažení koncentrace 30 mg.l^-1. Tento postup zajišťuje větší přesnost. Mohou být použita i jiná inokula (viz I. 6. 4. 2).

Inokulovaná směs se přes noc probublává vzduchem prostým CO₂ k odstranění absorbovaného CO₂.

Přidá se známý objem zásobního roztoku zkoušené látky a referenční látky, čímž se vytvoří dvojice baněk se živnou koncentrací ze zkoušené a referenční látky v rozmezí 10 až 20 mg.^l-1 DOC nebo TOC. Některé lahve se nasazují jako kontrola a to bez chemikálií. Špatně rozpustné látky se přidávají přímo do baněk na hmotnostní nebo objemové bázi nebo se postupuje podle přílohy 3.

Jestliže je to požadováno, použije se 1 sterilní baňka bez inokula ke zjištění abiotického rozkladu (viz I. 6. 6). Sterilizace se provádí pomocí vhodné koncentrace toxické látky.

Ve všech baňkách se upraví objem na 3 l přídavkem minerálního média prostého CO₂. Mohou se odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha 2) a/nebo specifickou analýzu. Pak se připojí absorpční nádobky.

V případě použití hydroxidu barnatého se spojují 3 nádobky, každá s obsahem 100 ml 0,0125 mol.l^-1 Ba(OH)₂ v sérii pro každou 5 l baňku. Roztok musí být prostý sraženiny síranu a uhličitanu barnatého a bezprostředně před použitím musí být stanovena jeho koncentrace. V případě použití hydroxidu sodného spojují se 2 jednotky, z nichž druhá slouží jako kontrola, že všechen CO₂ byl absorbován v první nádobce. Jako uzávěry absorpčních nádobek jsou vhodné sérové uzávěry. Do každé nádobky se přidá po 200 ml 0,05 mol NaOH, což je dostatečné k absorpci veškerého CO₂, který se uvolní při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů, což se koriguje odečtením slepého pokusu.

Baňka č. 1 a 2: Zkoušená suspenze

Baňka č. 3 a 4: Slepý pokus inokula

Baňka č. 5: Kontrola postupu

a dále s výhodou a když je to potřebné:

Baňka č. 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka č. 7: Kontrola toxicity

Viz. také část I. 6. 7.

Zkouška se zahajuje probubláváním suspenze vzduchem prostým CO₂ rychlostí 30 - 100 ml.min^-1. Pravidelně se odebírají a analyzují vzorky absorbátu CO₂. Doporučuje se, aby v průběhu prvních 10 dnů byly analýzy prováděny každý druhý až třetí den a dále každý pátý den až do 28. dne, což umožňuje určení periody.10 denního okna.

Na konci pokusu, 28. den, může být odebrán vzorek na stanovení DOC a/nebo na specifickou analýzu, změří se pH suspenze a pak se do každé baňky přidá 1 ml koncentrované HCl. Provzdušňuje se přes noc k odstranění v suspenzi přítomného CO₂. Poslední analýza CO₂ se provede 29. den.

Ve dnech, kdy se měří CO₂ se odpojuje ten absorbér, který je nejblíže baňce a roztok hydroxidu se titruje 0,05 mol HCl na fenolftalein. Zbývající absorbér se posune o jedno místo blíže k lahvi a nový absorbér se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125 mol.l^-1 hydroxidu barnatého se zapojí na místě posunutého, na konec série. Potřebné titrace se provádí tehdy, je-li pozorována sraženina v prvním absorbéru a před tím než je pozorovatelná ve druhém, nebo nejméně jednou týdně. Alternativně, v případě použití NaOH jako absorbentu, se pomocí injekční stříkačky odebere z absorbéru, který je nejblíže baňce malý vzorek, který se nastříkne přímo do analyzátoru uhlíku.

Druhý absorbér se analyzuje pouze na konci zkoušky, aby se tak mohl korigovat únik CO₂.

Množství CO₂ zachyceného v absorbéru je při titraci dáno:

mg CO₂ = (100.C_B - 0,5.V.C_A).44

kde

V = spotřeba HCl pro titraci 100 ml v absorbéru

C_B = koncentrace roztoku Ba(OH)₂ v mol.l^-1

C_A = koncentrace HCl v mol.l^-1

V případě, že C_B je 0,0125 mol a C_A 0,05 mol je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)₂ 50 ml a hmotnost CO₂ je dána:

0,052 . 44 . mlHCl=1,1 . mlHCl

Tedy, v tomto případě se hmotnost produkovaného CO₂ získá násobením spotřeby HCl faktorem 1,1.

Vypočítá se hmotnost CO₂ vyprodukovaného samotným inokulem, inokulem se zkoušenou látkou s použitím příslušných výsledků titrace. Jejich rozdíl je hmotnost CO₂, který byl vyprodukován samotnou zkoušenou látkou.

Např. když samotné inokulum poskytuje titrací 48 ml a inokulum se zkoušenou látkou 45 ml,

CO₂ z inokula = 1,1. (50 - 48) = 2,2 mg

CO₂ z inokula a zkoušené látky = 1,1.(50 - 45) = 5,5 mg

a z toho hmotnost CO₂ vyprodukovaná zkoušenou látkou je 3,3 mg.

Procentní biologická rozložitelnost se vypočítá z:

% rozkladu = (mg CO₂. 100)/(TCO₂. mg zkoušené látky)

nebo

% rozkladu = (mg CO₂. 100)/(mg TOC.3,67)

kde 3,67 je přepočítací koeficient 44/12 pro uhlík na CO₂.

Takto se postupuje pro každé měření jež se provádělo po celou dobu zkoušky vždy s dosazením TCO₂ spočítané pro každý den..

Při absorpci do NaOH se vypočítá hmotnost produkovaného CO₂, vyjádřeného jako anorganický uhlík, vynásobením této koncentrace objemem absorpčního roztoku.

Procento rozkladu se vypočítá ze vztahu:

% TCO₂ = [( mg IC ze zk. b. - mg IC ze sl. p.) / mg TOC ve zk. 1]. 100

kde

IC = anorganický uhlík,

sl.p. = slepý pokus,

zk. b. = zkušební baňka

zk. l. = zkoušená látka.

Úbytek DOC se může spočítat podle části I. Všechny výsledky se zapisují do sestavy dat.

Počáteční hmotnost anorganického uhlíku ve zkušební suspenzi v minerálním médiu nesmí být na počátku pokusu větší než 5 % celkového uhlíku. Celkové množství CO₂ vyvinutého v inokulovaném slepém pokusu nesmí překročit na konci pokusu 40 mg na litr média. V případě, že se získají hodnoty větší než 70 mg CO₂. l^-1, měly by se experimentální postup i výsledky kriticky posoudit.

Viz také I. 5. 2.

Viz část I. 8.

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg látky na litr

Počáteční koncentrace v médiu: mg látky v mediu

Množství celkového uhlíku nasazeného do baňky: mg C

TCO₂: mg CO₂

Zdroj:

Způsob úpravy:

Předúprava: pokud byla

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg CO₂

Metoda: Ba(OH)₂ / NaOH/ jiná

Poznámka: podobné uspořádání lze použít i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

Analyzátor uhlíku

% odstr. DOC= 1- Ct- Cb(t)Co- Cb(o) . 100

% abiot. rozkladu = (produkce mg CO₂ ve steril. podm. po 28 dnech / TCO₂).100

Příprava zásobních roztoků je popsána v části I. 6. 2

Smíchá se 10 ml roztoku (a) s 800 ml zřeďovací vody a přidá se po 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se do 1 l zřeďovací vodou.

Inokulum má být získáno z různých zdrojů: aktivovaný kal, vyčištěná městská odpadní voda, povrchová voda a půda nebo jejich směs.

Viz část I. 6. 4, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

S použitím zásobních roztoků se připraví roztoky zkoušené a referenční látky v minerálním médiu, koncentračně ekvivalentní 50 - 100 mg.l^-1 TSK.

V případech, kdy lze vyloučit nitrifikaci vypočítá se TSK za předpokladu tvorby amoniových solí, v opačném případě na bázi tvorby dusičnanů (viz příloha 2.2)

Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.

Špatně rozpustné látky se přidávají v pozdějším stádiu (viz dále).

Má-li se stanovit toxicita zkoušené látky připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční a zkoušenou látku dohromady a to ve stejných koncentracích jako v individuálních roztocích.

Je-li požadováno stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkoušené látky při obvyklé koncentraci 100 mg TSK.l^-1 sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I. 6. 6)

Připravené roztoky zkoušené a referenční látky se vnesou, nejméně v duplikátech, do nádobek. Do dalších nádobek se vnese pro kontrolu inokula pouze minerální médium a v případě, že je to požadováno, směs zkoušené látky a referenční látky a sterilní roztok.

V případě, že je zkoušená látka špatně rozpustná, přidává se v této fázi přímo navážením nebo odměřením objemu nebo se postupuje podle přílohy 3. Do absorbéru CO₂ se přidá KOH, pelety NaOH nebo jiný absorbent.

Nádobka č. 1 a 2: zkoušená suspenze

Nádobka č. 3 a 4: slepý pokus

Nádobka č. 5: kontrola postupu

když je to potřebné:

Nádobka č. 6: sterilní kontrola

Nádobka č. 7: kontrola toxicity

Viz část I. 6. 7.

Po vytemperování nádobek na zvolenou teplotu se do vybraných nádobek přidá inokulum tak, aby se ustavila koncentrace suspendovaných látek ne větší než 30 mg.l^-1. Nádobka se zkompletuje, přezkouší na těsnost, pustí se míchání a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není potřebné věnovat pokusu žádnou jinou pozornost vyjma denních odečtů a kontroly teploty a míchání.

Vypočítá se spotřeba kyslíku z pravidelných a občasných odečtů postupem, jenž doporučuje výrobce přístroje. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v nádobkách a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSK počítaná na vznik amoniaku (platí pro látky s obsahem dusíku).

Je-li to požadováno, odebírá se vzorek z nádobek ke stanovení DOC nebo specifickou analýzu - viz příloha 2. Při prvním odběru z nádobky je nutné znát zbývající objem v nádobce. V případě zkoušky s dusíkatými látkami stanovuje se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů v průběhu 28 dnů a z nich se počítá korekce spotřeby kyslíku podle příohy 5.

Spotřeba kyslíku zkoušenou látkou po zvoleném času a po korekci na slepý pokus se dělí hmotností zkoušené látky v nádobce. To poskytuje BSK vyjádřenou jako mg.mg^-1:

BSK= SKZL- SK0m (mg.mg-1)

kde

SK_ZL = spotřeba kyslíku zkoušenou látkou (mg),

SK₀ = spotřeba kyslíku ve slepém pokusu (mg),

m = hmotnost zkoušené látky v nádobce.

Procentní biologický rozklad se vypočte z rovnice

% biologického rozkladu=% TSK= BSKTSK . 100

nebo ze vztahu

% CHSK= BSKCHSK . 100

Je nutné poznamenat, že obě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; upřednostňuje se použití první metody.

Pro látky, jež obsahují dusík se používá vhodné TSK (pro NH₄ nebo NO₃) podle toho co je známo nebo odhadováno o výskytu nitrifikace (příloha 2). Jestliže se nitrifikace vyskytuje, ale není úplná, koriguje se spotřeba kyslíku podle změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha 5).

V případě, že se stanovuje organický uhlík a /nebo se provedla specifická analýza, počítá se stupeň rozkladu podle odstavce I. 7.

Všechny výsledky se zapisují do tabulkových sestav.

Normální spotřeba kyslíku inokulem je 20 - 30 mg.l^-1 a nemá být větší než 60 mg.l^-1 v průběhu 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg.l^-1 vyžadují kritické hodnocení výsledků a experimentální techniky.

V případě, že pH je mimo rozsah 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkoušenou látkou je menší než 60 % je nutno zkoušku opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.

Viz odst. I.

Dále je uveden příklad protokolu.

MANOMETRICKÁ RESPIROMETRICKÁ ZKOUŠKA

Zásobní roztoky se připravují podle I. 6. 2.

Smíchá se 1 ml roztoků (a) až (d) a doplní se do 1 l zřeďovací vodou.

Inokulum se běžně získává z odtoku z biologické čistírny nebo z laboratorní jednotky, které čistí převážně komunální odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Běžně se užívá jedna kapka až 5 ml filtrátu na 1 l média. Vhodné množství inokula se musí vyzkoušet (viz. I. 6. 4. 2 a I. 6. 5)

Minerální médium se silně provzdušňuje po dobu 20 minut. V jedné zkoušce je nutné použít jedno minerální médium. Obecně je médium připraveno pro práci po 20 h stání při pracovní teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu. Jeho obsah by měl být okolo 9 mg.l^-1 při 20 °C. Všechny operace s médiem nasyceným vzduchem se provádí tak, aby nevznikly bublinky, např. se použije sifon.

Připravují se paralelní skupiny BSK lahviček pro simultánní měření zkoušené látky a referenční látky. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů byly k dispozici vždy alespoň 2 lahvičky. K tomu, aby bylo možné určit 10 denní okno je potřeba více lahviček.

Do velkých lahví se do 1/3 naplní provzdušněné médium, pak se přidá zásobní roztok zkoušené látky a referenční látky do zvláštní lahve tak, aby konečná koncentrace látek byla max. 10 mg.l^-1. Slepý pokus se nasazuje bez zkoušené a referenční látky.

Ke zjištění, zda aktivita inokula není limitující, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách klesnout pod 0,5 mg.l^-1. Toto omezuje koncentraci zkoušené látky na 2 mg.l^-1. Ovšem pro látky těžce rozpustné ve vodě a s nízkou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg.l^-1. V některých případech lze doporučit provádět paralelně měření při 2 koncentracích studované látky např 2 a 5 mg.l^-1. Běžně se TSK počítá pro tvorbu amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace, počítá se TSK pro tvorbu dusičnanů (viz příloha 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, počítá se korekce z analytických koncentrací dusičnanů.

V případě, že zkoušená látka je toxická (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), musí se nasadit nové série lahviček.

Nasazuje se za stejných podmínek jako v předchozím případě.

Roztok ve velkých lahvích se inokuluje odtokem z biologické čistírny (1 kapka až 5 ml) nebo jiným inokulem jako např. říční vodou (viz I. 6. 4. 2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným médiem a s pomocí hadičky, která sahá na dno, se připraví homogenní roztok.

V běžném pokusu se používají následující lahvičky:

nejméně 10 se zkoušenou látkou a inokulem,

nejméně 10 jen s inokulem,

nejméně 10 s obsahem referenční látky a inokulem

a dále, je-li to zapotřebí 6 lahviček obsahujících zkoušenou látku, referenční látku a inokulum (kontrola toxicity). Pro zjištění 10 denního okna je zapotřebí dvojnásobný počet lahviček.

Připravený roztok se ihned po přípravě plní do příslušné skupiny lahviček a to ze spodní čtvrtiny lahve (nikoliv ze dna), tak, aby se všechny lahvičky úplně naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. Lahvičky určené pro počátek pokusu se ihned analyzují na obsah kyslíku Winklerovou metodou nebo pomocí oximetru. Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného. Takto fixované lahvičky, které obsahují hnědě zbarvené hydratované oxidy Mn³⁺ se skladují na temném místě při teplotě 10 - 20 °C nejdéle po dobu 24 h. Zbývající lahvičky se uzavřou (bez bublinek) a inkubují se při 20 °C ve tmě. Každá série musí být doprovázena slepým pokusem, který kontroluje inokulum.

V duplicitních lahvičkách se nejméně 1x týdně stanovuje kyslík a to po celou dobu 28 dnů.

Týdenní vzorky umožňují stanovení 14 denního okna, kdežto vzorky každé 3 - 4 dny dovolují stanovit 10 denní okno, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček.

Pro látky, které obsahují dusík se musí provést korekce na nitrifikaci. To se provádí tak, že se změří kyslík pomocí oximetru a pak se stanoví dusičnany a dusitany. Spotřeba kyslíku na tuto oxidaci se počítá podle přílohy 5.

Nejprve se vypočte BSK po každé časové periodě tak, že se odečte spotřeba kyslíku v mg.l^-1 slepého pokusu od spotřeby se zkoušenou látkou. Takto získaný výsledek se dělí koncentrací zkoušené látky a tím se získá specifická BSK v mg kyslíku na mg látky. Pak se vypočítá procentní biologická rozložitelnost jako podíl specifické BSK a specifické TSK (počítané podle přílohy 2. 2) nebo CHSK (stanovené analyticky podle přílohy 2. 3).

BSK= mg O2 zk.l.-mg O2 sl. p.=mg kyslíku na mg latky mg zk.l. v lahvi

% rozkladu= BSK mg kyslíku na mgzk.l. TSK mg kyslíku na mg zk.l. . 100

nebo

% rozkladu= BSK (mg kyslíku na mg zk.l.)CHSK (mg kyslíku na mg zk.l.) . 100

kde

zk. l. = zkoušená látka,

sl. p. = slepý pokus.

Je potřeba podotknout, že tyto dvě metody neposkytují nezbytně stejné výsledky. Upřednostnit by se měla metoda s použitím TSK.

Pro zkoušenou látku obsahující dusík se používá vhodná TSK (NH₄ nebo NO₃) podle toho, co se ví nebo očekává o výskytu nitrifikace (viz příloha 5). V případě, že se nitrifikace vyskytuje, ale není úplná, koriguje se spotřeba kyslíku podle analytických koncentrací dusitanů a dusičnanů.

Spotřeba kyslíku ve slepých pokusech nesmí být vyšší než 1,5 mg.l^-1 po 28 dnech. Vyšší hodnoty vyžadují prozkoumání použité experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku v lahvičkách nesmí být nižší než 0,5 mg.l^-1 v jakémkoliv časovém úseku zkoušky. Tyto kyslíkové hladiny jsou platné jen v případě, že metoda, jíž se stanovuje kyslík, je schopná tyto koncentrace přesně měřit.

Viz také část I.5.2.

Viz I.8.

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1

Počáteční koncentrace v lahvičce: mg.l^-1

TSK nebo CHSK: mg O₂.mg zkoušené látky^-1

Zdroj:

Úprava:

Předúprava v případě, že byla použita:

Koncentrace v reakční směsi: mg/l

Metoda: Winkler / oximetr

Poznámka: Podobný vzor může být použit i pro referenční látku a pro kontrolu toxicity.

Průměr nelze počítat v případě velkých diferencí replikátů.

m_to = hodnota ve zkušební lahvičce v čase 0

m_x = hodnota ve zkušební lahvičce v čase x

m_bo = hodnota slepého pokusu v čase 0

m_bx = hodnota slepého pokusu v čase x

Uplatní se všechny korekce na nitrifikaci iii + vi z části 6.

Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je (mb_o - mb₂₈) v mg.l^-1. Tato spotřeba je důležitá pro platnost zkoušky. Měla by být menší než 1,5 mg.l^-1.

Vždy 3 ml dále uvedených roztoků a, b, c, a d se doplní deionizovanou vodou na objem 1000 ml.

Odeberou se vzorky z nejméně deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemikálie. Z míst jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řek, jezer a moří se odebírá l litr kalu, povrchových půd, vody a j., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyflotovaných látek a odstátí se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou. Do práce se bere vhodný objem tohoto filtrovaného supernatantu a naplní se jím nádoba, která se 23,5 h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije 1/3 objemu a doplní stejným objemem rozoku, který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a hydrogenfosforečnanu draselného a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad dobré laboratorní praxe: odtok musí být čirý, teplota musí být udržovaná při 25 ± 2 °C, pH má být 7 ± 1, kal má dobře sedimentovat, provzdušňování musí být dostatečné za všech okolností, mají být přítomni provoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé 3 měsíce. Takto získané inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace a déle než po čtyřech měsících. Proto je nutné odebírat vzorky ze zvolených 10 míst každé 3 měsíce.

K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant starého kalu smíchává se stejným objemem nového kalu a směs se kultivuje podle popsaného postupu. Do práce se kal bere 18 - 24 h po přídavku živin.

Připravuje se 6 baněk podle schematu:

č. 1 zkoušená látka ve zřeďovací vodě 100 mg.l^-1

č. 2, 3, 4 zkoušená látka v minerálním médiu 100 mg.l^-1

č. 5 referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu 100 mg.l^-1

č. 6 minerální médium

Málo rozpustné látky se přidávají přímo odvážením nebo odměřením objemu nebo se zpracují jak je uvedeno v příloze č. 3, s výjimkou těch, u kterých nemohou být použita rozpouštědla nebo emulgátory. Do speciálních uzávěrů lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.

Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspenze), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby výsledná koncentrace kalu byla 30 mg.l^-1. Láhev č. 1 je bez inokula, čímž se získává abiotická kontrola.Nasadí se zátka, zkontroluje se těsnost, zapnou se míchadla a započne se s měřením úbytku kyslíku za stíněných podmínek. Denně se kontroluje teplota, míchání, zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenávají se všechny změny barvy obsahu láhve. Při využití 6 křivkového zapisovače se získává přímo křivka BSK. Na konci inkubace, která je obvykle 28 dní, měří se pH v láhvi a stanovuje zbytková koncentrace zkoušené látky a jejich metabolitů a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také DOC (postup podle přílohy 2). V případě těkavých látek se používá speciální postup. V případě výskytu nitrifikace se stanovují, jestliže je to možné, dusičnany a dusitany.

Spotřeba kyslíku zkoušenou látkou za daný čas v mg, korigovaná slepým pokusem za stejnou dobu, se dělí hmotností zkoušené látky v pokusu. Tento postup poskytuje výsledek vyjádřený jako spotřeba kyslíku v mg.mg^-1 zkoušené látky, což je:

BSK= mg02zk.l.-mgO2(sl. p.)mg zk. l.=mgO2/mg zk. l.

kde

zk. l. = zkoušená látka,

sl. p. = slepý pokus,

m = hmotnost zkoušené látky.

Procentický biologický rozklad se získá ze vztahu:

% biol. rozkladu=% TSK= BSKTSK . 100

Pro směsi se TSK vypočítává z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché látky. Dosazuje se odpovídající TSK pro NH₄ a NO₃ podle toho, zda se úplná nitrifikace vyskytuje či ne. V případě neúplné nitrifikace se vychází ze změn koncentrace NO₃ a NO₂ podle přílohy 5.

Spočítá se procento primárního biologického rozkladu z úbytku původní chemické látky (viz I.7.2)

Dt= Sb- SaSb . 100 %

V případě, že se v lahvi č. 1 zjistí fyzikálně-chemický úbytek původní látky zaznamená se tento jev a za koncentraci zkoušené látky (S_b) po 28 dnech se dosadí tato koncentrace.

V případě stanovení DOC (nepovinné) se úplná procentická biologická rozložitelnost počítá ze vztahu:

Dt= 1- Ct- Cbt C0- Cbo . 100

Jestliže byl zjištěn úbytek DOC v láhvi č. 1, která měří abiotický rozklad, pak se do výpočtu dosazuje koncentrace DOC zjištěná v této láhvi.

Všechny výsledky se zaznamenají do souhrnu, jehož vzor je přiložen.

Slepý pokus mívá spotřebu kyslíku inokulem 20 - 30 mg.l^-1 a neměl by být větší než 60 mg.l^-1 v průběhu 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg.l^-1 vyžadují kritické vyhodnocení získaných dat a experimentální techniky. V případě, že pH je mimo rozsah 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkoušenou látkou je menší než 60 %, zkouška by měla být opakována s nižší koncentrací látky.

Viz také I.5.2.

V případě, že rozklad anilinu, vypočítaný ze spotřeby kyslíku, nedosáhne 40 % po 7 dnech a 65 % po 14 dnech, je nutné zkoušku považovat za neplatnou.

Viz I.8.

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg.l^-1 jako látka

Počáteční koncentrace v médiu, Co: mg.l^-1 jako látka

Objem reakční směsi, V: ml

TSK: mg O₂.l^-1

Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci na syntetické splašky = ... mg.l^-1.

Objem aktivovaného kalu v konečném médiu = . . . ml

Koncentrace kalu v konečném médiu = . . . mg.l^-1

Typ použitého respirometru:

Poznámka: Podobný vzor může být použit pro referenční látku

* neprůměrovat, jestliže jsou mezi jednotlivými měřeními velké rozdíly

Analyzátor uhlíku:

% rozkladu = [(S_b- S_a)/S_b].100

Počítá se pro lahve č. a1, a2, a3.

Je-li k dispozici, může být připojena křivka BSK v závislosti na čase.

Cílem této metody je měření biochemické spotřeby kyslíku (BSK) tuhých nebo kapalných organických látek. Výsledky dosažitelné touto metodou platí v první řadě pro látky rozpustné ve vodě; v zásadě lze touto metodou zkoušet i těkavé a ve vodě obtížně rozpustné látky.

Metodu lze použít jen pro organické látky, které v koncentracích používaných při zkoušce nemají žádný inhibiční účinek na inokulum. Není-li daná látka při koncentracích používaných ve zkoušce rozpustná, je pro zajištění její dostatečné dispergace případně třeba použít zvláštní postupy, např. dispergaci ultrazvukem.

Při interpretaci nižších hodnot získaných jako výsledek zkoušky a při volbě vhodných koncentrací při zkoušení může být užitečná znalost údajů o toxicitě zkoušené látky.

Biochemická spotřeba kyslíku (BSK) je definována jako množství rozpuštěného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci určitého množství rozpuštěné látky za předepsaných podmínek.

Výsledky se udávají jako g spotřeby kyslíku (BSK) na 1 g zkoušené látky.

Doporučuje se použít vhodnou referenční látku pro přezkoušení aktivity inokula.

Určité množství zkoušené látky se rozpustí nebo disperguje ve vhodném živném médiu bohatém na kyslík, poté se naočkuje inokulem a za stálé předepsané teploty se ve tmě inkubuje. BSK se stanoví na základě rozdílu mezi obsahem rozpuštěného kyslíku před začátkem a na konci zkoušky. Zkouška musí trvat nejméně 5 dní, avšak ne více než 28 dní.

Souběžně s touto zkouškou je třeba provést slepý pokus bez zkoušené látky.

Stanovení BSK není možné považovat za bezpečné stanovení biologické rozložitelnosti dané látky. Tuto zkoušku lze považovat pouze za první posouzení (vyhledávací, skríningovou).

Připraví se roztok nebo disperze zkoušené látky o vhodné koncentraci. Poté se stanoví BSK pomocí některé vhodné národní nebo mezinárodní standardizované metody.

Účelem metody je stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek za určených standardizovaných laboratorních podmínek.

Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledků je užitečné znát údaje o chemickém vzorci zkoušené látky (např. obsah halidů, organické sole železa nebo chlorované uhlovodíky).

Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky. Vyjadřuje se jako množství kyslíku oxidačního činidla, které spotřebuje oxidovaná látka za určených laboratorních podmínek.

Výsledek zkoušky se udává v g spotřeby kyslíku na 1 g zkoušené látky.

Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

Určité množství látky, rozpuštěné nebo rozptýlené ve vodě, se oxiduje zahříváním s dichromanem draselným v prostředí silné kyseliny sírové pod zpětným chladičem za přítomnosti síranu stříbrného jako katalyzátoru. Přebytečný dichroman se stanoví titrací standardním roztokem síranu železnato-amonného.

U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý.

CHSK je „indikátorem oxidovatelnosti“ a jako taková je využívána jako praktický nástroj ke stanovení obsahu organických látek

Výsledek zkoušky mohou zkreslit chloridy. Rovněž anorganické redukující nebo oxidující látky mohou stanovení chemické spotřeby kyslíku zkreslit.

Některé cyklické sloučeniny a mnoho sloučenin těkavých (např. nižší mastné kyseliny) se v této zkoušce neoxidují úplně.

Nejprve se připraví roztok nebo disperze zkoušené látky tak, aby se dosáhlo CHSK mezi 250 a 600 mg. l^-1.

Poznámka:

V případě špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek je možné odvážit a vnést přímo do zkušební baňky s vodou množství práškovité nebo kapalné látky odpovídající přibližně 5 mg CHSK.

CHSK je často možné s výhodou, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit variantní metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnavačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto modifikací se obvykle úspěšně stanoví i látky obtížně stanovitelné konvenční metodou - např. kyselina octová. Metoda vyhovuje i v případě pyridinu. Jestliže se koncentrace dichromanu draselného zvýší na 0,0416 mol.l^-1 (0,25 N), může se zvýšit přímo navažované množství látek na 5 - 10 mg, což usnadňuje stanovení látek obtížně rozpustných ve vodě.

V ostatních případech se CHSK stanoví vhodnou národní nebo mezinárodní metodou.

Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. U látek, které jsou jen málo biologicky rozložitelné má obvzláštní význam a může ovlivnit persistenci dané látky v životním prostředí.

Většina hydrolýzních reakcí probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, takže poločasy jsou nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků z koncentrací použitých v laboratoři na podmínky životního prostředí.

Mimo to byly u řady chemických sloučenin uvedeny příklady uspokojivé shody dat naměřených v čisté a v přírodní vodě (2).

Pro používání této zkušební metody je užitečné znát již předem údaj o tenzi par dané látky.

Metoda je vhodná jen pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty zpravidla ovlivňují výsledky.

Chování látek při hydrolýze je nutno zkoumat při hodnotách pH obvykle se vyskytujících v životním prostředí (pH 4 - 9).

Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou, která se dá znázornit výměnou skupiny X za skupinu OH:

RX + HOH = ROH + HX (1)

Rychlost, kterou ubývá koncentrace RX, je dána vztahem:

rychlost = k.[ H₂O ].[ RX ] (2)

Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce v přebytku, popisuje se tento typ reakce obvykle jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je zjištěná rychlostní konstanta dána výrazem:

kobs = k.[ H₂O ] (3)

a lze ji určit pro dané pH a teplotu T z výrazu:

kobs=2,303t.logC0Ct (4)

kde

t = čas,

Co = koncentrace látky v čase nula,

Ct = koncentrace látky v čase t,

2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a logaritmem při základu 10.

Koncentrace je možné udávat v g.l^-1 nebo v mol.l^-1.

Jednotkou konstanty k_obs je (čas)^-1.

„Poločas“, t_1/2, je definován jako doba, po jejímž uplynutí je počáteční množství látky sníženo o 50 %:

C_t = 1/2.C_o (5)

Z rovnic (4) a (5) plyne, že

t_1/2 = 0,693/k_obs (6)

Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.

Jako standardní látky byly použity (1):

Kyselina acetylsalicylová (aspirin),

0, 0 - diethyl - 0 - (6 - methyl-2-(1methylethyl)- 4 - pyrimidinyl) - ester kyseliny thiofosforečné (Dimpylat, Diazinon).

Látka se rozpustí v malé koncentraci ve vodě; kontrolují se pH a teplota.

Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.

Logaritmy koncentrace se vynesou proti času. Je-li získaná závislost lineární, je možné získat rychlostní konstantu 1. řádu ze směrnice přímky (viz odst.2).

Není -li možné rychlostní konstantu zjistit při zadané teplotě přímo, je obvykle možné ji odhadnout podle Arrheniova vztahu, který udává teplotní závislost rychlostních konstant. Za tím účelem se vynesou logaritmy rychlostních konstant získaných při jiných teplotách proti reciproké hodnotě absolutní teploty (K). Z lineárního průběhu je možné extrapolovat nebo interpolovat hodnoty těch rychlostních konstant, které nebyly určeny přímo.

V literatuře (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.

Reprodukovatelnost závisí zejména na kontrole pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve zvláštních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

Zpráva o průběhu pokusu by měla pokud možno obsahovat tyto údaje:

- popis látky,

- výsledky získané s referenčními látkami,

- princip a detaily použité analytické metody,

- pro každý experiment: teplotu, pH, složení tlumivého roztoku, tabulku se všemi údaji koncentrace - čas,

- u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty k_obs a t_1/2 včetně metody výpočtu,

- u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, grafické znázornění vztahu logaritmu koncentrace proti času,

- všechny údaje a pozorování potřebné pro interpretaci výsledků.

Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 °C) zkoušených látek za předpokladu, že pro podobné třídy látek již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že je možné očekávat, že aktivační energie zkoušené látky je stejné velikosti.

V této laboratorní zkoušce se zkoušená látka přidá do umělé půdy, do které se na 14 dní umístí žížaly. Po této době (a nepovinně i po sedmi dnech) se vyšetří letální účinek látky na žížaly. Zkouška je metodou relativně krátkodobého orientačního zjištění účinku chemických látek na žížaly při dermálním a potravním příjmu.

LC₅₀: Koncentrace látky, vyhodnocená jako hodnota, při které v průběhu zkoušky dojde k uhynutí 50 % pokusných zvířat.

Referenční látka se používá periodicky jako prostředek pro důkaz, že se citlivost zkušebního systému podstatně nezměnila.

Jako referenční látka se doporučuje chloracetamid analytické čistoty.

Půda představuje proměnlivé prostředí, takže se pro zkoušku používá pečlivě definovaná umělá hlinitá půda. V definované umělé půdě se chovají dospělé žížaly druhu Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) a exponují se různým koncentracím zkoušené látky. Obsah nádob se 14 dní (a nepovinně i 7 dní) po začátku zkušky rozprostře na podložku a spočítají se žížaly, které při jednotlivých koncentracích přežijí.

Zkouška je navržena tak, aby byla z hlediska zkušebního substrátu a organismů co nejreprodukovatelnější. Úhyn v kontrolních skupinách nesmí na konci zkoušky překročit 10 %, jinak je zkouška neplatná.

Uvedou se koncentrace zkoušené látky s odpovídajícím procentem mrtvých žížal.

Jsou-li údaje vyhovující, stanoví se hodnota LC₅₀ a meze spolehlivosti (p = 0,05) s použitím standardních metod (Litchfield a Wilcoxon, 1949, nebo ekvivalentní metoda). LC₅₀ se udává v mg zkoušené látky na 1 kg substrátu pro zkoušku (v sušině).

V případech, kdy sklon křivky koncentrací je pro výpočet LC₅₀ příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.

Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci rozsahu, do kterého spadá LC₅₀.

Je-li to možné, má protokol obsahovat tyto informace:

- prohlášení, že zkouška byla provedena v souladu s výše uvedenými kritérii kvality,

- o druhu provedené zkoušky (zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací a (nebo) definitivní zkouška),

- přesný popis experimentálních podmínek nebo konstatování, že zkouška byla provedena v souladu s metodou; je nutno uvést veškeré odchylky,

- přesný popis, jak byla zkoušená látka smísena se základním substrátem,

- informace o organismech použitých ve zkoušce (druh, stáří, střední hmotnost a rozsah jednotlivých hodnot, podmínky chovu, dodavatel),

- metoda použitá ke stanovení LC₅₀,

- výsledky zkoušky včetně všech použitých údajů,

- popis pozorovaných symptomů nebo změn v chování organizmů použitých ve zkoušce,

- úhyn v kontrolních zkouškách,

- LC₅₀ nebo nejvyšší zkoušená koncentrace nevyvolávající úhyn a nejnižší zkoušená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (a nepovinně sedm dní) od začátku zkoušky,

- grafické znázornění křivky koncentrace/odezva,

- výsledky získané s referenční látkou, ať v souvislosti s touto zkouškou nebo z dřívějších zkoušek kontroly jakosti.

Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.

Při interpretaci výsledků musí být zohledněna fyzikálně-chemická adsorbce na suspendované pevné částice.

Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l^-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l^-1. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.

Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.

Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této medodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.

Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:

- jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,

- mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,

- neinhibují bakterie,

- jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,

- pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.

Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.

Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.

Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:

DT%=1-CT-CBCA-CBA.100

kde:

D_T = rozklad ( %) v čase T,

C_a = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l^-1),

C_T = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l^-1),

C_B = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku (mg.l^-1),

C_BA = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l^-1).

Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.

Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.

Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3.2).

Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.

Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20-25 °C v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.

V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.

Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami.

Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.

V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny následující údaje:

- počáteční koncentrace látky,

- všechny informace a experimentální výsledky (název zkoušené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),

- koncentrace látky po 3 h,

- inhibiční křivka s popisem,

- datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použitá koncentrace atd.,

- vědecké odůvodnění případných změn v provedení zkoušky.

Postupné ubývání DOC nebo CHSK během dnů až týdnů naznačuje, že zkoušená látka je biologicky rozkládána.

V mnoha případech může ovlivňovat výsledky zkoušky fyzikálně-chemická adsorbce. To lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo částečné odstranění DOC nebo CHSK během prvních tří hodin zkoušky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkoušeného vzorku je nečekaně malý.

Má-li se rozlišit úplná nebo částečná biologická rozložitelnost od adsorbce, musí se provést další zkoušky.

Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnější je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkoušce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce.

Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivněny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozložitelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, že látka je přinejmenším alespoň částečně biologicky rozložitelná. Jestliže je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo žádný, mohla nastat inhibice mikroorganismů působením zkoušené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuštěním nebo úbytkem kalu nebo zakalem zkoušené suspenze. V takových případech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.

Vyšší citlivosti může být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použitím látek značených ¹⁴C. Jestliže je použita zkoušená látka s ¹⁴C, je možné stanovením ¹⁴CO₂ prokázat, že nastal rozklad zkoušené látky.

Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to možné, změny v chemické struktuře, které způsobily snížení obsahu výchozí, rodičovské, zkoušené látky.

Musí se také dokladovat ověření analytické metody a výsledky stanovení v živném médiu bez přídavku zkoušené látky.