PŘÍLOHA I

1. STANOVENÍ ŠKROBUPOLARIMETRICKÁ METODA

Tato metoda umožňuje stanovit obsah škrobu a produktů odbourávání škrobu o vysoké molekulární hmotnosti v krmivech za účelem kontroly souladu s požadavky směrnice Komise 86/174/EHS a směrnice Rady 96/25/ES.

Metoda zahrnuje dvě stanovení. V prvním je vzorek ošetřen za horka zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Po vyčeření a filtraci je polarimetricky změřena optická otáčivost roztoku.

Ve druhém je vzorek extrahován 40 % etanolem. Po okyselení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčistění a filtraci je optická otáčivost změřena jako v prvním stanovení.

Rozdíl mezi dvěma měřeními, vynásobený známým faktorem, udává obsah škrobu ve vzorku.

25 % (hmotnostních) kyselina chlorovodíková, d: 1,126 g/ml.

1,128 % (hmotnostních ve vztahu k objemu) kyselina chlorovodíková.

Koncentrace musí být stanovena titračně za použití roztoku hydroxidu sodného 0,1 mol/litr za přítomnosti 0,1 % (hmotnostních ve vztahu k objemu) methyl červeně v 94 % (objemově) etanolu. 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 mol/litr.

Carrezovo činidlo I: rozpusťte 21,9 g octanu zinečnatého Zn(CH₃COO)₂·2H₂O a 3 g ledové kyseliny octové ve vodě. Doplňte do 100 ml vodou.

Carrezovo činidlo II: rozpusťte 10,6 g hexakyanoželeznatanu draselného [K₄(Fe(CN)₆]·3H₂O ve vodě. Doplňte do 100 ml vodou.

40 % (objemově) etanol, d: 0,948 g/ml při 20 °C.

250 ml Erlenmeyerova baňka se standardním zábrusem a zpětným chladičem.

Polarimetr nebo sacharimetr.

Rozmělněte vzorek nadrobno tak, aby všechny jeho části prošly sítem s kulatými oky o průměru 0,5 mm.

Odvažte 2,5 g rozmělněného vzorku s přesností na mg a vložte jej do 100 ml odměrné baňky. Přidejte 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2), protřepejte, aby bylo dosaženo rovnoměrného rozmístnění testovaného vzorku a přidejte dalších 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Ponořte baňku do vroucí vodní lázně za stálého a silného protřepávání po dobu prvních třech minut, aby se zabránilo tvorbě shluků. Množství vody ve vodní lázni musí být dostatečné, aby po vložení baňky zůstala lázeň na bodu varu. Baňka nesmí být vyjmuta z lázně během protřepávání. Po přesně 15 minutách vyjměte z lázně, přidejte 30 ml studené vody a ihned ochlaďte na 20 °C.

Přidejte 5 ml Carrezova činidla I (3.3) a protřepávejte po dobu jedné minuty. Potom přidejte 5 ml Carrezova činidla II (3.4) a protřepávejte opět po dobu jedné minuty. Doplňte do objemu vodou, promíchejte a filtrujte. Pokud není filtrát zcela čirý (což je zřídka), opakujte stanovení za použití většího množství Carrezova činidla I a II, například 10 ml.

Změřte optickou otáčivost roztoku ve 200 mm trubici polarimetrem nebo sacharimetrem.

Odvažte 5 g vzorku s přesností na mg, vložte do 100 ml odměrné baňky a přidejte okolo 80 ml etanolu (3.5) (viz poznámky 7.2). Nechejte baňku stát jednu hodinu při pokojové teplotě; během této doby šestkrát silně protřepejte tak, aby se testovaný vzorek důkladně smísil s etanolem. Doplňte na objem etanolem (3.5.), promíchejte a filtrujte. Odpipetujte 50 ml filtrátu (= 2,5 g vzorku) do 250 ml Erlenmeyerovy baňky, přidejte 2,1 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) a silně protřepejte. Osaďte baňku zpětným chladičem a ponořte ji do vroucí vodní lázně. Po přesně 15 minutách vyjměte Erlenmeyerovu baňku z vodní lázně, převeďte obsah do 100 ml odměrné baňky, vypláchněte chladnější vodou a ochlaďte na 20 °C. Vyčeřte použitím Carrezova činidla I (3.3) a II (3.4), doplňte do objemu vodou, promíchejte, přefiltrujte a změřte optickou otáčivost, jak je uvedeno ve druhém a třetím odstavci 5.2.

Obsah škrobu ( %) se vypočítá následovně:

specifická optická otáčivost čistého škrobu. Číselné hodnoty konvenčně přijaté pro faktor jsou následující:

+ 185,9°rýžový škrob+ 185,4°bramborový škrob+ 184,6°kukuřičný škrob+ 182,7°pšeničný škrob+ 181,5°ječný škrob+ 181,3°ovesný škrob+ 184,0°ostatní typy škrobu a směsi škrobu v krmných směsích

Hmotnost (g) sacharózy ve 100 ml vody, dávající optickou otáčivost 100 stupňů sacharimetru při měření za použití 200 mm trubice

16,29 g pro francouzské sacharimetry

26,00 g pro německé sacharimetry

20,00 g pro smíšené sacharimetry

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 0,4 v absolutní hodnotě u obsahů škrobu nižších než 40 % a 1,1 % relativně u obsahů škrobu rovnajících se nebo vyšších než 40 %.

Pokud obsahuje vzorek více než 6 % uhličitanů, vyjádřených jako uhličitan vápenatý, musí být před stanovením optické otáčivosti rozloženy přesně odpovídajícím množstvím zředěné kyseliny sírové

V případě produktů s vyšším obsahem laktózy, jako je sušené mléčné sérum nebo odstředěné sušené mléko, postupujte následovně po přidání 80 ml etanolu (3.5) Osaďte baňku zpětným chladičem a ponořte ji do vodní lázně o teplotě 50 °C po dobu 30 minut. Nechejte vychladnout a pokračujte v analýze, jak je uvedeno v 5.3.

Následující krmné suroviny, v případě, že jsou přítomny ve významném množství v krmivech, jak známo způsobují interference při stanovení obsahu škrobu polarimetrickou metodou, a tím mohou být získány nesprávné výsledky:

• výrobky z cukrové řepy, jako cukrová pulpa, cukrovková melasa, cukrovarské vyloužené řízky, cukrovková melasovaná pulpa, cukrovková vináza, řepa cukrová,

• citrusová pulpa,

• lněné semeno; lněné expelery; extrahované lněné semeno,

• řepkové semeno; řepkové expelery; řepkové semeno extrahované; řepkové slupky,

• slunečnicové semeno; slunečnicové semeno extrahované; slunečnicové semeno částečně loupané, extrahované,

• kokosové expelery; kokosový extrahovaný šrot,

• bramborová pulpa,

• sušené kvasnice,

• výrobky bohaté na inulín (např. řízky a moučka z topinambur);

• škvarky.

Tato metoda umožňuje stanovit obsah dusíkatých látek v krmivu na základě obsahu dusíku, stanoveného podle Kjeldahlovy metody.

Vzorek je za přítomnost katalyzátoru mineralizován kyselinou sírovou. Kyselý roztok je alkalizován roztokem hydroxidu sodného. Čpavek je destilován a jímán v odměřeném množství kyseliny sírové, jejíž přebytek je titrován standardním roztokem hydroxidu sodného.

Síran draselný.

Katalyzátor: oxid měďnatý (II) CuO nebo pentahydrát síranu měďnatého (II), CuSO₄.5H₂O.

Granulovaný zinek.

Kyselina sírová, p₂₀ = 1,84 g/ml.

Kyselina sírová, c(½ H₂SO₄) = 0,5 mol/l.

Kyselina sírová, c(½ H₂SO₄) = 0,1 mol/l.

Indikátor methylová červeň: rozpusťte 300 mg methyl červeně ve 100 ml etanolu, δ = 95-96 % (objemově).

Roztok hydroxidu sodného (může být použit technický) δ = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

Roztok hydroxidu sodného c = 0,25 mol/l.

Roztok hydroxidu sodného c = 0,1 mol/l.

Granulovaná pemza, promytá v kyselině chlorovodíkové a zpopelněná.

Acetanilid (b.t. = 114 °C, N = 10,36 %)

Sacharóza (bez dusíku).

Přístroje vhodné pro provedení mineralizace, destilace a titrace podle Kjeldahlovy metody.

Odvažte, s přesností na 0,001 g, 1 g vzorku a přeneste jej do mineralizační baňky. Přidejte 15 g síranu draselného (3.1), a přiměřené množství katalyzátoru (3.2) (0,3 až 0,4 g oxidu měďnatého (II) nebo 0,9 až 1,2 g pentahydrátu síranu měďnatého (II), 25 ml kyseliny sírové (3.4) a několik granulí pemzy (3.11) a promíchejte. Zahřívejte láhev nejprve mírně za občasného kroužení, pokud nutno, dokud hmota nezkarbonizuje a pěna nezmizí; potom zahřívejte intenzivněji, dokud kapalina nevře rovnoměrně. Ohřev je adekvátní, když vroucí kyselina kondenzuje na stěně baňky. Chraňte boky před přehřátím a před přilnutím organických částic k nim. Když se roztok stane čirým a světle zeleným, pokračujte ve varu po další dvě hodiny, potom nechejte vychladnout.

Přidejte opatrně dostatek vody k zajištění úplného rozpuštění sulfátů. Nechejte vychladnout a potom přidejte několik granulí zinku (3.3).

Dejte do baňky destilačního přístroje přesně odměřené množství 25 ml kyseliny sírové (3.5) nebo (3.6) v závislosti na předpokládaném obsahu dusíku. Přidejte několik kapek indikátoru methyl červeně (3.7).

Spojte baňku s přestupníkem destilačního přístroje a ponořte konec přestupníku do kapaliny obsažené v titrační baňce do hloubky nejméně 1 cm (viz poznámky (8.3). Pomalu vlijte 100 ml roztoku hydroxidu sodného (3.8) do baňky bez ztráty čpavku (viz poznámky 8.1).

Zahřívejte láhev, dokud se čpavek nevydestiluje.

Titrujte přebytek kyseliny sírové v titrační baňce roztokem hydroxidu sodného (3.9) nebo (3.10) v závislosti na koncentraci použité kyseliny sírové, dokud není dosažen konečný bod.

Pro ověření, že reagencie neobsahují dusík, proveďte slepý pokus (mineralizaci, destilaci a titraci) za použití sacharózy (3.13) místo vzorku.

Obsah dusíkatých látek se vypočítá podle následující rovnice:

kde:

Objem NaOH (3.9 nebo 3.10)

použitého ve slepém pokusu (ml).

Objem NaOH (3.9 nebo 3.10)

použitého při titraci vzorku (ml).

Koncentrace (mol/l)

hydroxidu sodného (3.9 nebo 3.10).

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

0,2 % v absolutní hodnotě u obsahů dusíkatých látek nižších než 20 %;

1,0 % vzhledem k vyšší hodnotě, pro obsahy dusíkatých látek od 20 % do 40 %;

0,4 % v absolutní hodnotě u obsahů dusíkatých látek vyšších než 40 %.

Proveďte analýzu (mineralizaci, destilaci a titraci) u 1,5 až 2,0 g acetanilidu (3.12) za přítomnosti 1 g sacharózy (3.13); 1 g acetanilidu spotřebuje 14,80 ml kyseliny sírové (3.5). Výtěžek musí být nejméně 99 %.

Přístroje mohou být manuální, poloautomatické nebo automatické. Pokud přístroj vyžaduje přenos mezi kroky mineralizace a destilace, musí být tento přenos proveden beze ztrát. Pokud není baňka destilačního přístroje vybavena dávkovací nálevkou, přidejte hydroxid sodný ihned před spojením baňky s přestupníkem, pomalým nalitím po stěně.

Pokud výluh ztuhne, začněte stanovení za použití většího množství kyseliny sírové (3.4), než jaké je uvedeno dříve.

U produktů s nízkým obsahem dusíku, může být objem kyseliny sírové (3.6), přidaný do baňky, pokud je to nutné, snížen na 10 až 15 ml a doplněn na 25 ml vodou.

Tato metoda umožňuje stanovit frakci hrubých proteinů rozpustných pepsinem a kyselinou chlorovodíkovou za stanovených podmínek. Metoda je použitelná pro všechna krmiva.

Vzorek se ošetřuje 48 hodin při 40 °C roztokem pepsinu v kyselině chlorovodíkové. Suspenze se filtruje a obsah dusíku ve filtrátu se stanoví metodou pro stanovení obsahu hrubých proteinů.

Kyselina chlorovodíková, d: 1,125.

Kyselina chlorovodíková 0,075 N.

2,0 j/mg pepsinu; aktivita pepsinu je definována v metodě popsané v části 4 této přílohy a musí být kontrolována v souladu s touto metodou.

Asi 0,02 % (m/V), čerstvě připravený roztok pepsinu v kyselině chlorovodíkové (3.2); aktivita: 400 j/l.

Odpěňovací emulze (např. silikon).

Všechna činidla uvedená v bodě 3 metody pro stanovení obsahu hrubých proteinů.

Vodní lázeň nebo inkubátor nastavený na 40 °C ± 1 °C.

Mineralizační a destilační aparatura podle Kjeldahlovy metody.

Navážit 2 g vzorku s přesností na 1 mg a dát ho do odměrné baňky o objemu 500 ml. Přidat 450 ml roztoku pepsinu v kyselině chlorovodíkové (3.4) předehřátého na 40 °C. Protřepat, aby se zabránilo tvorbě hrudek. Ověřit, že je pH suspenze nižší než 1,7. Vložit baňku do vodní lázně nebo inkubátoru (4.1) a nechat ji tam 48 hodin. Protřepat po 8, 24 a 32 hodinách. Po 48 hodinách přidat 15 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), zchladit na 20 °C, doplnit po rysku vodou a filtrovat.

Odebrat 250 ml filtrátu s přesností na 1 mg a dát ho do baňky destilační aparatury (4.2). Přidat činidla nezbytná pro mineralizaci, jak je uvedeno v metodě pro stanovení hrubých proteinů, ve druhé větě bodu 5.1. Homogenizovat a uvést do varu. Pokud se vytvoří pěna, přidat několik kapek odpěňovací emulse (3.5). Pokračovat v silném varu, dokud se voda téměř zcela nevypaří. Snížit ohřev a opatrně odstranit poslední stopy vody.

Když je roztok čirý a bezbarvý (světlezelený, pokud se použije katalyzátor na bázi mědi), udržovat var ještě další hodinu. Nechat vychladnout.

Postupovat, jak je uvedeno v metodě pro stanovení hrubých proteinů v bodech 5.2 a 5.3.

Provést slepý pokus za použití stejného postupu, ale bez vzorku, který má být analyzován.

Odečíst objem kyseliny sírové spotřebované během slepého pokusu od objemu spotřebovaného zkušebním vzorkem. 1 ml kyseliny sírové 0,1 N odpovídá 1,4 mg dusíku.

Vynásobit množství dusíku faktorem 6,25. Výsledek vyjádřit jako procento vzorku.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u jednoho vzorku nesmí překročit:

• 0,4 absolutní hodnoty pro obsah nižší než 20 %,

• 2,0 % relativní hodnoty pro obsah vyšší než 20 % a nižší než 40 %,

• 0,8 absolutní hodnoty pro obsah vyšší než 40 %.

Hodnoty získané touto metodou nemají přímou souvislost se stravitelností in vivo.

Výrobky o obsahu tuku vyšším než 10 % musí být odtučněny extrakcí petrolétheru (b.v. 40 až 60 °C).

Tato metoda umožňuje stanovit aktivitu pepsinu použitého při stanovení hrubých proteinů rozpustných pepsinem a kyselinou chlorovodíkovou.

Hemoglobin se ošetří za stanovených podmínek pepsinem v prostředí kyseliny chlorovodíkové. Nehydrolyzovaná frakce proteinů se vysráží kyselinou trichloroctovou. Do filtrátu se přidá hydroxid sodný a činidlo Folin-Ciocalteu. Optická hustota tohoto roztoku se měří při 750 nm a odpovídající množství tyrosinu se odečte z kalibrační křivky.

Definice: Jednotka pepsinu je definována jako množství enzymu, které za podmínek metody uvolní za minutu takové množství hydroxyarylových skupin, jejichž zbarvení činidlem Folin-Ciocalteu má optickou hustotu odpovídající optické hustotě jednoho μmolu tyrosinu zbarveného stejným způsobem.

Kyselina chlorovodíková 0,2 N.

Kyselina chlorovodíková 0,06 N.

Kyselina chlorovodíková 0,025 N.

5 % roztok (m/V) kyseliny trichloroctové.

Roztok hydroxidu sodného 0,5 N.

Činidlo Folin-Ciocalteu. Dát 100 g wolframanu sodného (Na₂WO₄ · 2H₂O), 25 g molybdenanu sodného (Na₂MoO₄ · 2H₂O) a 700 ml vody do dvoulitrové baňky s kulatým dnem a normalizovaným zábrusem. Přidat 50 ml kyseliny fosforečné (d: 1,71) a 100 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (d: 1,19), připojit baňku na zpětný chladič, uvést do varu a udržovat roztok v mírném varu po dobu 10 hodin. Nechat vychladnout, odpojit zpětný chladič, přidat 175 g síranu lithného (Li₂SO₄ · 2H₂O), 50 ml vody a 1 ml brómu. Vařit po dobu 15 minut, aby se odstranil přebytek brómu.

Nechat vychladnout. Přelít roztok do odměrné baňky o objemu 1 l, doplnit po rysku vodou, homogenizovat a filtrovat. Nesmí zůstat nazelenalé zbarvení. Před použitím rozředit 1 objem činidla 2 objemy vody.

Roztok hemoglobinu: Navážit množství hemoglobinu, asi 2 g proteinového substrátu podle Ansonovy metody odpovídajícího 354 mg dusíku(Stanovit obsah dusíku podle Kjeldahlovy semimikrometody (teoretický obsah: 17,7 % dusíku).) a dát do baňky o objemu 200 ml s normalizovaným zábrusem. Přidat několik ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Spojit baňku s vakuovou pumpou a protřepávat, dokud se hemoglobin zcela nerozpustí. Uvolnit vakuum a za protřepávání doplnit kyselinu chlorovodíkovou (3.2) až na 100 ml. Připravit bezprostředně před použitím.

Standardní roztok tyrosinu: rozpustit 181,2 mg tyrosinu v kyselině chlorovodíkové (3.1) a doplnit do jednoho litru stejnou kyselinou (zásobní roztok). Odebrat 20 ml tohoto roztoku a rozředit kyselinou chlorovodíkovou (3.1) ve 100 ml. 1 ml tohoto roztoku obsahuje 0,2 μmol tyrosinu.

Vodní lázeň nastavená ultratermostatem na 25 °C + 0,1 °C.

Spektrofotometr.

Stopky, přesnost: 1 sekunda.

pH metr.

Rozpustit 150 mg pepsinu ve 100 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Odpipetovat 2 ml roztoku a dát ho do odměrné baňky o objemu 50 ml a doplnit po rysku kyselinou chlorovodíkovou (3.3). pH kontrolované pH metrem musí být 1,6+0,1. Ponořit baňku do vodní lázně (4.1).

Odpipetovat 5,0 ml roztoku hemoglobinu (3.7) do zkumavky, zahřát ve vodní lázni (4.1) na 25 °C, přidat 1,0 ml roztoku pepsinu získaného podle bodu 5.1 a promíchat asi deseti pohyby tam a zpět skleněnou tyčinkou zesílenou na jednom konci. Nechat zkumavku ve vodní lázni při 25 °C přesně po dobu 10 minut, počítáno od přidání roztoku pepsinu (doba a teplota musí být přesně dodrženy). Poté přidat 10,0 ml roztoku kyseliny trichloroctové (3.4) předehřátého na 25 °C, homogenizovat a filtrovat přes suchý filtr.

Odpipetovat 5,0 ml filtrátu, dát ho do Erlenmeyerovy baňky o objemu 50 ml, přidat 10,0 ml roztoku hydroxidu sodného (3.5) a za stálého protřepávání 3,0 ml zředěného činidla Folin-Ciocalteu (3.6). Po 5 až 10 minutách stanovit optickou hustotu roztoku spektrofotometrem při 750 nm v kyvetách o tloušťce 1 cm v porovnání s vodou.

Pro každé stanovení provést tento slepý pokus:

Odpipetovat 5,0 ml roztoku hemoglobinu (3.7) do zkumavky, zahřát ve vodní lázni (4.1) na 25 °C, přidat 10,0 ml roztoku kyseliny trichloroctové (3.4) předehřáté na 25 °C, homogenizovat a poté přidat 1,0 ml roztoku pepsinu získaného podle bodu 5.1. Promíchat skleněnou tyčinkou a nechat zkumavku přesně 10 minut ve vodní lázni (4.1) při 25 °C. Homogenizovat a filtrovat přes suchý filtr. Pokračovat v postupu uvedeném v bodě 5.3.

Do Erlenmeyerovy baňky o objemu 50 ml dát 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, a 5,0 ml alikvotního standardního roztoku tyrosinu, který odpovídá 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, a 1,0 μmolu množství tyrosinu. Doplnit sérii referenčním roztokem bez tyrosinu. Doplnit objemy kyselinou chlorovodíkovou (3.1) na 5,0 ml. Přidat 10,0 ml roztoku hydroxidu sodného (3.5) a za stálého protřepávání 3,0 ml zředěného činidla Folin-Ciocalteu (3.6). Změřit optickou hustotu jak je uvedeno v poslední větě bodu 5.3. Načrtnout kalibrační křivku uvedením optických hustot proti množstvím tyrosinu.

Odečíst z kalibrační křivky množství tyrosinu v μmolech, které odpovídá optické hustotě zbarveného roztoku a které bylo opraveno slepým pokusem.

Aktivita pepsinu v μmolech tyrosinu na 1 mg a za jednu minutu při 25 °C se vypočítá podle vzorce:

kde:

Množství pepsinu, které má být rozpuštěno, musí být takové, aby byla při konečném fotometrickém měření získána optická hustota 0,35 + 0,035.

Dvě jednotky na mg získané touto metodou odpovídají:

3,64 Ansonovovým milijednotkám/mg (μmolů tyrosinu/mg min. při 35,5 °C) nebo

36400 komerčních jednotek/g (μmolů tyrosinu/g za 10 min. při 35,5 °C).

Tato metoda umožňuje stanovit volný gossypolu, celkový gossypolu a chemicky příbuzné látky v bavlníkových semenech, bavlníkové mouce a bavlníkových pokrutinách a krmných směsích, které tyto látky obsahují. Spodní hranice pro stanovení obsahu je 20 ppm.

Gossypol je extrahován za přítomnosti 3-amino-1-propanolu, a to buď směsí isopropanolu a hexanu pro stanovení volného gossypolu, nebo dimethylformamidem pro stanovení celkového gossypolu. Gossypol je prostřednictvím anilinu přeměněn na gossypol-dianilin, jehož optická hustota je měřena při 440 nm.

Směs isopropanolu a hexanu: smíchat 60 objemových částí isopropanolu p.a. se 40 objemovými částmi n-hexanu.

Rozpouštědlo A: do odměrné baňky o objemu 1 l nalít asi 500 ml směsi isopropanolu a hexanu (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanolu, 8 ml ledové kyseliny octové a 50 ml vody. Doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Trvanlivost tohoto činidla je jeden týden.

Rozpouštědlo B: odpipetovat do odměrné baňky o objemu 100 ml 2 ml 3-amino-1-propanolu a 10 ml ledové kyseliny octové. Zchladit na pokojovou teplotu a doplnit po rysku N,N-dimethylformamidem. Trvanlivost tohoto činidla je jeden týden.

Anilin p.a.: pokud optická hustota slepého pokusu překročí 0,022, destilovat anilin přes zinkový prach s vyloučením prvních a posledních frakcí 10 % destilátu. Toto činidlo se skladuje v chladničce několik měsíců v zazátkované lahvi z hnědého skla.

Standardní roztok gossypolu A: do odměrné baňky o objemu 250 ml dát 27,9 mg octanu gossypolu. Rozpustit a doplnit po rysku rozpouštědlem A (3.2). Odpipetovat do odměrné baňky o objemu 250 ml 50 ml tohoto roztoku a doplnit po rysku rozpouštědlem A. Koncentrace gossypolu v tomto roztoku je 0,02 mg/ml. Před použitím nechat stát po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě.

Standardní roztok gossypolu B: do odměrné baňky o objemu 50 ml dát 27,9 mg octanu gossypolu. Rozpustit a doplnit po rysku rozpouštědlem B (3.3). Koncentrace gossypolu v tomto roztoku je 0,5 mg/ml.

Pokud jsou standardní roztoky gossypolu A a B chráněny před světlem, jejich trvanlivost je 24 hodin.

Mixér (třepačka): přibližně 35 ot./mim.

Spektrofotometr.

Množství zkušebního vzorku závisí na předpokládaném obsahu gossypolu ve vzorku. Je výhodné pracovat s malým množstvím zkušebního vzorku a relativně velkou alikvotní částí filtrátu, aby bylo možné získat dostatečné množství gossypolu pro přesné fotometrické měření. Pro stanovení volného gossypolu v bavlníkových semenech, bavlníkové mouce a bavlníkových pokrutinách by zkušební vzorek neměl překročit 1 g; pro krmné směsi to může být 5 g. Ve většině případů je použitelná alikvotní část 10 ml filtrátu; měla by obsahovat 50 až 100 μg gossypolu. Pro stanovení celkového gossypolu by množství zkušebního vzorku mělo být mezi 0,5 a 5 g, aby alikvotní část 2 ml filtrátu obsahovala 40 až 200 μg gossypolu.

Analýza by se měla provádět při pokojové teplotě kolem 20 °C.

Dát zkušební vzorek do odměrné baňky se zábrusovým hrdlem o objemu 250 ml, jejíž dno je pokryto skleněnými střepy. Pomocí pipety přidat 50 ml rozpouštědla A (3.2), zazátkovat baňku a jednu hodinu promíchávat v mixéru. Filtrovat přes suchý filtr a zachytit filtrát v malé baňce se zábrusovým hrdlem. Během filtrace zakrýt nálevku s kohoutem hodinovým sklíčkem. Pomocí pipety přidat do dvou odměrných baněk (A a B) o objemu 25 ml stejné alikvotní části filtrátu obsahujícího 50 až 100 μg gossypolu. Případně doplnit objem rozpouštědlem A (3.2) na 10 ml. Poté doplnit po rysku baňku (A) směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Tento roztok se použije jako referenční roztok pro měření roztoku pro slepý pokus.

Pomocí pipety přidat 10 ml rozpouštědla A (3.2) do dvou jiných odměrných baněk (C a D) o objemu 25 ml. Doplnit po rysku baňku (C) směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Tento roztok se použije jako referenční roztok pro měření roztoku pro slepý pokus.

Přidat 2 ml anilinu (3.4) do baněk (D) a (B). Zahřívat 30 minut nad vroucí vodní lázní, aby se vytvořilo zbarvení. Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu (3.1), homogenizovat a nechat stát jednu hodinu.

Stanovit spektrofotometrem při 440 nm a ve skleněných kyvetách o tloušťce 1 cm optickou hustotu roztoku pro slepý pokus (D) porovnáním s referenčním roztokem (C) a optickou hustotu roztoku vzorku (B) porovnáním s referenčním roztokem (A).

Odečíst optickou hustotu roztoku pro slepý pokus od optické hustoty roztoku vzorku (= upravená optická hustota). Z této hodnoty vypočítat obsah volného gossypolu, jak je uvedeno v bodě 6.

Dát zkušební vzorek obsahující 1 až 5 mg gossypolu do odměrné baňky o objemu 50 ml a přidat 10 ml rozpouštědla B (3.3). Současně připravit slepý pokus a dát 10 ml rozpouštědla B (3.3) do jiné odměrné baňky o objemu 50 ml. Zahřívat obě baňky 30 minut nad vroucí vodní lázní. Zchladit na pokojovou teplotu a doplnit po rysku obě baňky směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Homogenizovat a nechat stát 10 až 15 minut, poté filtrovat a zachytit filtráty v baňce se zábrusovým hrdlem.

Pomocí pipety přidat 2 ml filtrátu ze vzorku do dvou odměrných baněk o objemu 25 ml a 2 ml filtrátu slepého pokusu do dvou jiných odměrných baněk o objemu 25 ml. Doplnit na 25 ml obsah jedné baňky z každé série směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Tyto roztoky se použijí jako referenční roztoky.

Přidat 2 ml anilinu (3.4) do dvou jiných baněk. Zahřívat 30 minut nad vroucí vodní lázní, aby se vytvořilo zbarvení. Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit na 25 ml směsí isopropanolu a hexanu (3.1), homogenizovat a nechat stát jednu hodinu.

Stanovit optickou hustotu volného gossypolu, jak je uvedeno v bodě 5.2. Z této hodnoty vypočítat obsah celkového gossypolu, jak je uvedeno v bodě 6.

Výpočet výsledků se může provést buď na základě specifické optické hustoty (6.1), nebo na základě kalibrační křivky (6.2).

Za stanovených podmínek je specifická optická hustota tato:

Obsah volného nebo celkový obsah gossypolu ve vzorku se vypočítá takto:

kde:

Připravit dvě série po pěti odměrných baňkách o objemu 25 ml. V každé série přidat pipetou 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 a 10,0 ml standardního roztoku gossypolu A (3.5). Doplnit objemy rozpouštědlem A (3.2) na 10 ml.

Doplnit baňky první série, včetně slepého pokusu, směsí isopropanolu a hexanu (3.1) na 25 ml.

Přidat do každé baňky druhé série 2 ml anilinu (3.4). Zahřívat 30 minut nad vroucí vodní lázní, aby se vytvořilo zbarvení. Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu (3.1), homogenizovat a nechat stát jednu hodinu.

Za podmínek uvedených v bodě 5.2 stanovit optickou hustotu standardní série roztoků porovnáním s odpovídajícími roztoky referenční série. Načrtnout kalibrační křivku uvedením hodnot optické hustoty proti množství gossypolu (v μg).

Připravit 6 odměrných baněk o objemu 50 ml. Do první baňky přidat pipetou 10 ml rozpouštědla B (3.3) a do ostatních 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 a 10,0 ml standardního roztoku gossypolu B (3.6). Doplnit obsah každé baňky na 10 ml rozpouštědlem B (3.3). Zahřívat 30 minut nad vroucí vodní lázní. Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu a promíchat.

Přidat pipetou 2 ml těchto roztoků do dvou sérií o 6 odměrných baňkách o objemu 25 ml. Doplnit obsah baněk první série na 25 ml směsí i isopropanolu a hexanu (3.1) (referenční série).

Přidat do každé baňky druhé série 2 ml anilinu (3.4). Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu (3.1), homogenizovat a nechat stát jednu hodinu (standardní série).

Za podmínek uvedených v bodě 5.2 stanovit optickou hustotu standardní série roztoků porovnáním s odpovídajícími roztoky referenční série. Načrtnout kalibrační křivku uvedením hodnot optické hustoty proti množství gossypolu (v μg).

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

• 15 % relativní hodnoty pro obsah gossypolu nižší než 50 ppm,

• 75 ppm absolutní hodnoty pro obsah od 500 do 750 ppm,

• 10 % relativní hodnoty pro obsah vyšší než 750 ppm.

PŘÍLOHA II

1. STANOVENÍ A IDENTIFIKACE TETRACYKLINOVÝCH ANTIBIOTIK

Tato metoda umožňuje stanovit a identifikovat tetracyklinová antibiotika v krmivech, která obsahují nejméně 0,1 ppm antibiotik, v koncentrátech a premixech.

Vzorek se extrahuje směsí methanolu a kyseliny chlorovodíkové. Extrakt je podroben sestupné papírové chromatografii v porovnání s referenčními roztoky. Antibiotika jsou stanovena a identifikována porovnáním jejich hodnot Rf s hodnotami standardních látek, a to buď fluorescencí v UV světle (vysoký obsah antibiotik), nebo bioautografií na agarovém médiu naočkovaném B. cereus.

Směs čistého methanolu/kyseliny chlorovodíkové (d: 1,19): 98/2 objemově.

Kyselina chlorovodíková 0,1 N.

Amoniak, d: 0,91

Standardní látky: Chlortetracyklin, oxytetracyklin, tetracyklin, jejichž aktivita je vyjádřena v chlorovodíku.

Udržování rodičovských kmenů, příprava suspenze spór a očkování kultivačního média: řídit se pokyny podle bodů 3.1. a 3.2. metody pro stanovení obsahu chlortetracyklinu, oxytetracyklinu a tetracyklinu difúzí na agaru, jak je popsána v části 2 této přílohy.

Před použitím upravit pH na 5,8.

0,1 % (m/V) roztok 2,3,5-triphenyltetrazolium chloridu a 5 % (m/V) roztok glukosy.

Zařízení pro vzestupnou papírovou chromatografii (výška papíru 25 cm). Schleich a Schuell papír (2440B nebo 2043B) nebo ekvivalentní.

Odstředivka

Inkubátor nastavený na 30 °C.

UV lampa pro stanovení fluorescence.

Skleněné desky asi 20 x 30 cm pro bioautografii.

Na základě standardních látek (3.8) a za použití kyseliny chlorovodíkové (3.6) připravit roztoky, jejichž koncentrace odpovídá 500 μg chlortetracyklinu-HCL, oxytetracyklinu-HCL a tetracyklinu-HCL na 1 ml.

Zředit roztoky (5.1) fosfátovým pufrem (3.2) s cílem získat roztoky, jejichž koncentrace odpovídá 100 μg chlortetracyklinu-HCL, oxytetracyklinu-HCL a tetracyklinu-HCL na 1 ml.

Zředit roztoky (5.1) fosfátovým pufrem (3.2) s cílem získat roztoky, jejichž koncentrace odpovídá 5 μg chlortetracyklinu-HCL, oxytetracyklinu-HCL a tetracyklinu-HCL na 1 ml

Když je předpokládaný obsah antibiotika nižší než 10 ppm, je možné použít buď homogenizovaný vzorek, nebo nejjemnější frakci oddělenou proséváním, neboť antibiotika se nacházejí především v této frakci.

Suspendovat vzorek ve směsi (3.5) a odstředit. Sebrat supernatant a použít ho přímo nebo ho případně zředit směsí (3.5) s cílem získat koncentrace antibiotika asi 100 μg na 1 ml (6.1) a 5 μg na 1 ml (6.2).

Ponořit papír do pufračního roztoku, pH 3,5 (3.1). Odstranit přebytek kapaliny vtlačením papíru mezi listy suchého filtračního papíru. Poté kápnout na papír 0,01 ml referenčních roztoků (5.2 a 5.3) a extraktu (6.1 a 6.2). Pro dobré oddělení musí mít papír správnou vlhkost; pokud je to nutné, nechat trochu vyschnout.

Rozvinout sestupnou chromatografií. Použít eluent I (3.3) pro stanovení bioautografií a eluent II (3.4) pro stanovení UV světlem. Když čelo rozpouštědla dosáhne výšky 15 až 20 cm (asi 1 hodina 30 minut), přerušit chromatografii a vysušit papír.

Když je obsah antibiotika vyšší než 1 μg/cm², je možné po ošetření chromatogramu parami amoniaku (3.7) pozorovat ozářením pod UV lampou žluté fluoreskující skvrny (4.4).

Nalít kultivační médium (3.10), které se předem naočkuje B. cereus (3.9), na skleněné desky (4.5) a položit papír na kultivační médium. Po pěti minutách kontaktu odejmout papír a položit ho na jinou skvrnu v kultivačním médiu, kde zůstane během inkubační doby. Inkubovat přes noc při 30 °C. Přítomnost tetracyklinového antibiotika se projeví světlými inhibičními zónami v matném kultivačním médiu.

K fixaci chromatogramu se po inkubaci odpaří roztok (3.11) na papíře.

Relativní hodnoty Rf tetracyklinových antibiotik jsou uvedeny zde. Tyto hodnoty se mohou mírně měnit podle jakosti papíru a jeho vlhkosti:

Antibiotická aktivita „epi“ sloučenin je menší než aktivita normálních sloučenin.

Tato metoda umožňuje stanovit chlortetracyklin (CTC), oxytetracyklin (OTC) a tetracyklin (TC) v krmivech, koncentrátech a premixech. Spodní hranice pro jejich stanovení je 5 ppm. Obsahy nižší než 5 ppm mohou být určeny grafickou interpolací.

U obsahů rovných nebo nižších než 50 ppm se vzorek extrahuje zředěným formamidem. U obsahů vyšších než 50 ppm se vzorek extrahuje směsí acetonu, vody a kyseliny chlorovodíkové pro stanovení CTC a směsí methanolu a kyseliny chlorovodíkové pro stanovení OTC a TC.

Extrakty se poté zředí a jejich antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze CTC, OTC nebo TC na agarovém médiu naočkovaném B. cereus. Difúze se projeví vytvořením inhibičních zón za přítomnosti mikroorganismu. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika.

Naočkovat B. cereus do zkumavky se šikmým agarem odebraným z kultivačního média (4.1), bez methylenové modře a kyseliny borité. Inkubovat přes noc při asi 30 °C. Skladovat kulturu v chladničce a přeočkovat každých 14 dní na šikmý agar.

Smýt bakterie ze zkumavky se šikmým agarem (3.1) za použití 2 až 3 ml fyziologického solného roztoku (4.5). Naočkovat tuto suspenzi do Rouxovy baňky obsahující 300 ml kultivačního média (4.1), bez methylenové modře a kyseliny borité, jehož koncentrace agaru je 3 až 4 %. Inkubovat 3 až 5 dní při 28 až 30 °C, poté smýt spóry 15 ml ethanolu (4.6) poté, co byla mikroskopicky ověřena sporulace, a homogenizovat. Tato suspenze se může v chladničce skladovat nejméně 5 měsíců.

Předběžnými testy na deskách s bazálním médiem pro stanovení (4.1) určit množství očkovací látky, které umožní získat pro použité koncentrace antibiotiky největší možné, ale ještě zřetelné inhibiční zóny. Toto množství je obvykle 0,2 a 0,3 ml na 1000 ml. Očkování kultivačního média se provádí při 50 až 60 °C.

Před použitím upravit pH na 5,8.

Fosfátový pufr, pH 5,5, zředěný 1/10

Sterilní fyziologický roztok.

20 % (V/V) ethanol.

Kyselina chlorovodíková 0,1 N.

70 % (V/V) formamid: připravit čerstvý před použitím a upravit na pH 4,5 za použití kyseliny sírové asi 2 N.

Směs čistého acetonu/vody/kyseliny chlorovodíkové (d: 1,19): 65/33/2 objemově.

Směs čistého methanolu/kyseliny chlorovodíkové (d: 1,19): 98/2 objemově.

Standardní látky: CTC, OTC, TC, jejichž aktivita je vyjádřena v chlorovodíku.

Na základě standardních látek (4.11) a za použití kyseliny chlorovodíkové (4.7) připravit zásobní roztok, jehož koncentrace odpovídá 500 μg chlortetracyklinu-HCL na 1 ml. Tento roztok se skladuje v chladničce jeden týden.

Na základě tohoto zásobního roztoku připravit standardní pracovní roztok S8, jehož koncentrace odpovídá 0,2 μg chlortetracyklinu-HCL na 1 ml. Zředění se provede za použití fosfátového pufru, pH 5,5, zředěného 1/10 (4.3), do kterého bylo přidáno 0,01 % černě amido(Čerň amido slouží k označení inhibičních zón standardních roztoků (modré kruhy).).

Poté připravit postupným ředěním (1 + 1) za použití pufru (4.3) tyto koncentrace:

Postupem podle bodu 5.1 připravit na základě zásobního roztoku, jehož koncentrace odpovídá 400 μg oxytetracyklinu-HCL na 1 ml, standardní pracovní roztok S₈ obsahující 1,6 μg oxytetracyklinu-HCL na 1 ml a tyto koncentrace:

Postupem podle bodu 5.1 připravit na základě zásobního roztoku, jehož koncentrace odpovídá 500 μg tetracyklinu-HCL na 1 ml, standardní pracovní roztok S₈ obsahující 1,0 μg tetracyklinu-HCL na 1 ml a tyto koncentrace:

Do zkušebního vzorku přidat formamid (4.8) v množstvích uvedených v tabulce. Protřepávat 30 minut třepačkou. Poté ihned zředit fosfátovým pufrem (4.3) podle odkazů v tabulce s cílem získat koncentraci U₈. Koncentrace formamidu v tomto roztoku nesmí překročit 40 %.

Odstředit nebo dekantovat extrakt s cílem získat čirý roztok. Poté připravit koncentrace U₄, U₂ a U₁ postupným ředěním (1 + 1) za použití fosfátového pufru (4.3).

V závislosti na předpokládaném obsahu antibiotika ve vzorku nebo na jeho výrobní záruce přidat do zkušebního vzorku o hmotnosti 2 až 10 g 20ti násobek jeho objemu směsi (4.9). Protřepávat 30 minut třepačkou. Během extrakce musí zůstat pH nižší než 3; pokud je to nutné, upravit pH na 3 (u minerálních sloučenin za použití 10 % kyseliny octové). Odebrat alikvotní část extraktu a upravit pH na 5,5 za použití fosfátového pufru, pH 8,0 (4.4), za přítomnosti bromkresolové zeleně (měnící se ze žluté na modrou). Zředit za použití fosfátového pufru, pH 5,5, zředěného 1/10 (4.3), s cílem získat koncentraci U₈ (viz 6.1).

Poté připravit koncentrace U4, U2 a U1 postupným ředěním (1 + 1), za použití fosfátového pufru (4.3).

Postupovat jak je uvedeno v bodě 6.2.1 tak, že se směs (4.9) nahradí směsí (4.10).

Naočkovat bazální médium pro stanovení (4.1) při 50–60 °C suspenzí spór (3.2).

Difúze na agaru se provádí v miskách za použití čtyř koncentrací standardního roztoku (S₈, S₄, S₂, S₁) a čtyř koncentrací extraktu (U₈, U₄,U₂, U₁). Každá miska musí obsahovat čtyři koncentrace standardního roztoku a extraktu.

Za tímto účelem vybrat misky o takové velikosti, aby bylo možné udělat v agarovém médiu nejméně 8 děr o průměru 10 až 13 mm. Vypočítat množství naočkovaného kultivačního média (7.1), které se má použít pro získání stejnoměrné vrstvy o tloušťce asi 2 mm. Upřednostňuje se použití misek sestávajících se z plochých skleněných desek s dokonale rovným hliníkovým nebo plastovým kroužkem o průměru 200 mm a výšce 20 mm.

Pipetovat do děr přesně odměřená množství roztoku antibiotika mezi 0,10 a 0,15 ml, v závislosti na průměru děr.

U každého vzorku opakovat difúzi nejméně čtyřikrát s každou koncentrací, aby každé stanovení zahrnovalo vyhodnocení 32 inhibičních zón.

Inkubovat misky během 18 hodin asi při 28 až 30 °C.

Změřit průměr inhibičních zón, přednostně projekcí. Zaznamenat měření na semilogaritmický papír zanesením logaritmu koncentrací proti průměru inhibičních zón. Načrtnout křivky standardního roztoku a extraktu. Pokud nedošlo k interferenci, obě křivky budou paralelní.

Logaritmus relativní aktivity se vypočítá pomocí této rovnice:

Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita x relativní aktivita.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u jednoho vzorku nesmí překročit 10 % relativní hodnoty.

Tato metoda umožňuje stanovit chlortetracyklin (CTC), oxytetracyklin (OTC) a tetracyklin (TC) při koncentracích vyšších než 1 g/kg, pokud nezasahuje žádná látka, která by dávala vzniknout matným extraktům. Tato metoda je rychlejší než difúze na agaru.

Pro stanovení obsahu CTC se vzorek extrahje směsí acetonu, vody a kyseliny chlorovodíkové a pro stanovení obsahu OTC a TC směsí methanolu a kyseliny chlorovodíkové.

Extrakty se poté zředí a jejich antibiotický účinek se stanoví měřením světelné propustnosti kultivačního média, které bylo naočkováno Staphylococcus aureus a do kterého bylo přidáno antibiotikum. Světelná propustnost závisí na koncentraci antibiotika.

Naočkovat Staphylococcus aureus do zkumavky s šikmým agarem odebraným z kultivačního média (4.1.), do kterého se přidá 1,5 až 3 % agaru (podle jakosti). Inkubovat přes noc při 37 °C. Skladovat kulturu v chladničce a přeočkovat každé 4 týdny na šikmý agar. Zároveň připravit subkultury pro laboratorní použití.

24 hodin před použitím přeočkovat šikmý agar subkulturou a inkubovat přes noc při 37 °C. Suspendovat celou kulturu obsaženou ve zkumavce agaru v asi 2 ml bazálního média (4.1) a poté přenést suspenzi za sterilních podmínek do asi 100 ml stejného bazálního média (4.1). Inkubovat ve vodní lázni při 37 °C dokud růst kmene nedosáhne logaritmické fáze (1h30 až 2h).

pH po sterilizaci: 6,8 až 7,0.

Kyselina chlorovodíková 0,1 N.

Směs čistého acetonu/vody/kyseliny chlorovodíkové (d: 1,19): 65/33/2 objemově.

Směs čistého methanolu/kyseliny chlorovodíkové (d: 1,19): 98/2 objemově.

Asi 10 % (m/V) roztoku formaldehydu.

Standardní látky: CTC, OTC, TC, jejichž aktivita je vyjádřena v chlorovodíku.

Na základě standardní látky (4.7) a za použití kyseliny chlorovodíkové (4.3) připravit zásobní roztok, jehož koncentrace odpovídá 400 až 500 μg CTC-HCL, OTC-HCL nebo TC-HCL na 1 ml. Tento roztok se skladuje v chladničce jeden týden.

Do odměrné baňky o objemu 200 nebo 250 ml dát 1 až 2 g zkušebního vzorku. Přidat asi 100 ml směsi (4.4) a protřepávat 30 minut třepačkou. Doplnit po rysku fosfátovým pufrem, pH 4,5 (4.2). Homogenizovat a nechat stát.

Do odměrné baňky o objemu 200 nebo 250 ml dát 1 až 2 g zkušebního vzorku. Přidat asi 100 ml směsi (4.5) a protřepávat 30 minut třepačkou. Doplnit po rysku fosfátovým pufrem, pH 4,5 (4.2). Homogenizovat a nechat stát.

Zředit standardní roztok (5) a extrakt (6) fosfátovým pufrem, pH 4,5 (4.2), tak, aby vznikla série koncentrací. Pro každé stanovení se načrtne kalibrační křivka, ne které se znázorní interpolace nejméně dvou hodnot vztahujících se k extraktu. Ředění se vyberou podle podmínek růstu kmene, které se mohou lišit laboratoř od laboratoře. Obecně se postupuje takto:

Zředit standardní roztok (5) fosfátovým pufrem (4.2) s cílem získat standardní pracovní roztok, jehož koncentrace odpovídá 0,2 μg CTC-HCL na 1 ml. Poté připravit za použití fosfátového pufru (4.2), jak je uvedeno níže a ve zkumavkách určených pro stanovení, 6 ředění, každé ředění dvakrát.

Zředit extrakt (6.1) za použití fosfátového pufru (4.2) s cílem získat předpokládanou koncentraci 0,12 μg CTC-HCL. Dát 1 ml tohoto roztoku do dvou zkumavek a 0,75 ml (= 0,09 μg) do dvou jiných zkumavek. Doplnit objem dvou jiných zkumavek na 1 ml fosfátovým pufrem (4.2).

Zředit standardní roztok (5) za použití fosfátového pufru (4.2) s cílem získat standardní pracovní roztok, jehož koncentrace odpovídá 0,6 μg OTC-HCL nebo TC-HCL na 1 ml. Poté připravit za použití fosfátového pufru (4.2), jak je uvedeno níže a ve zkumavkách určených pro stanovení, 7 ředění, každé ředění dvakrát.

Zředit extrakt (6.2) za použití fosfátového pufru (4.2) s cílem získat předpokládanou koncentraci 0,48 μg OTC-HCL nebo TC-HCL na 1 ml. Dát 1 ml tohoto roztoku do dvou zkumavek a 0,5 ml (= 0,24 μg) do dvou jiných zkumavek. Doplnit objem dvou jiných zkumavek na 1 ml fosfátovým pufrem (4.2).

Naočkovat bazální médium pro stanovení (4.1) očkovací látkou (3.2) s cílem získat na fonometru při 590 nm 85 % světelnou propustnost v 5 cm kyvetě nebo 92 % světelnou propustnost ve 2 cm kyvetě při nastavení aparatury na 100 % propustnost nenaočkovaného bazálního média (4.1).

Dát do každé zkumavky (7.1.1 nebo 7.1.2) 9 ml naočkovaného kultivačního média (7.2). Naplnění zkumavek musí být provedeno v čistém, ale nezbytně ne sterilním prostředí.

Inkubace se musí provést ve vodní lázni, jejíž teplota se mícháním udržuje na 37 °C + 0,1 °C. Inkubační doba se zvolí takovým způsobem, aby bylo možné načrtnout křivky propustnosti, jejichž gradient je vhodný pro přesná měření (obecně 2h30 až 3h). Poté zastavit další růstu rychlým vstříknutím 1 ml roztoku formaldehydu (4.6) do každé zkumavky.

Změřit propustnost při 590 nm, přičemž fotometr se nastaví na 100 % propustnost nejčiřejšího standardního roztoku (odpovídajícího nejvyššímu obsahu antibiotika). Z důvodu malých rozdílů v zakalení různých zkumavek se doporučuje použít nejméně 2 cm a raději 5 cm kyvety.

Načrtnout kalibrační křivku na milimetrovém papíře zanesením fotometrických propustností proti koncentracím antibiotika. Odečíst na křivce hodnoty propustnosti extraktu. Vypočíst obsah antibiotika ve vzorku.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u jednoho vzorku nesmí překročit 10 % relativní hodnoty.

Tato metoda umožňuje stanovit oleandomycin v krmivech, koncentrátech a premixech, a to dokonce v přítomnosti tetracyklinů. Spodní hranice pro stanovení je 0,5 ppm.

Vzorek se extrahuje zředěným methanolovým roztokem tris (hydroximethyl) aminometanem. Po odstředění se extrakt zředí a jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze oleandomycinu na agarovém médiu naočkovaném B. cereus. Difúze se projeví vytvořením inhibičních zón za přítomnosti mikroorganismu. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika.

Naočkovat B. cereus do zkumavky se šikmým agarem odebraným z kultivačního média (4.1) a přidat 100 μg oxytetracyklinu na 5 ml. Inkubovat přes noc při asi 30 °C. Skladovat kulturu v chladničce a přeočkovat každé 4 týdny na šikmý agar.

Smýt bakterie ze zkumavky se šikmým agarem (3.1) za použití asi 3 ml fyziologického roztoku (4.3). Naočkovat tuto suspenzi do Rouxovy baňky obsahující 300 ml kultivačního média (4.1), jehož koncentrace agaru je 3 až 4 %. Inkubovat 3 až 5 dní při 28 až 30 °C, poté smýt spóry 15 ml ethanolu (4.4) poté, co byla mikroskopicky ověřena sporulaci, a homogenizovat. Tato suspenze se může v chladničce skladovat nejméně 5 měsíců.

Předběžnými testy na deskách se bazálním médiem pro stanovení (4.2) určit množství očkovací látky, které umožní získat pro různé použité koncentrace oleandomycinu největší možné, ale ještě zřetelné inhibiční zóny. Toto množství je obvykle 0,1 a 0,2 ml na 1000 ml. Očkování kultivačního média se provádí při 60 °C.

Před použitím upravit pH na 6,5.

Médium (4.1) upravené na pH 8,8.

Sterilní fyziologický roztok.

20 % (V/V) ethanol.

Čistý methanol

0,5 % (m/V) roztok tris (hydroxymethyl) aminometanu p.a.

Standardní látky: oleandomycin o známé aktivitě.

Rozpustit standardní látku (4.8) v 5 ml methanolu (4.5) a zředit roztokem (4.6) s cílem získat koncentraci oleandomycinu 100 μg/ml.

Na základě tohoto zásobního roztoku připravit zředěním s roztokem (4.6) standardní pracovní roztok S8 obsahující 0,1 μg oleandomycinu na 1 ml. Poté připravit postupným ředěním (1 + 1) za použití roztoku (4.6) tyto koncentrace:

V závislosti na předpokládaném obsahu oleandomycinu ve vzorku přidat do zkušebního vzorku o hmotnosti 2 až 10 g 100 ml roztoku (4.7) a protřepávat 30 minut třepačkou.

Odstředit, odebrat alikvotní část extraktu a zředit roztokem (4.6) s cílem získat předpokládanou koncentraci 0,1 μg oleandomycinu na 1 ml (= U₈). Poté připravit koncentrace U₄, U₂ a U₁ postupným ředěním (1 + 1) za použití roztoku (4.6).

Naočkovat bazální médium pro stanovení (4.2) při 60 °C suspenzí spór (3.2).

Difúze na agaru se provádí v miskách za použití čtyř koncentrací standardního roztoku (S₈, S₄, S₂, S₁) a čtyř koncentrací extraktu (U₈, U₄,U₂, U₁). Každá miska musí obsahovat čtyři koncentrace standardního roztoku a extraktu.

Za tímto účelem vybrat misky o takové velikosti, aby bylo možné udělat v agarovém médiu nejméně 8 děr o průměru 10 až 13 mm. Vypočítat množství očkovacího kultivačního média (7.1), které se má použít pro získání stejnoměrné vrstvy o tloušťce asi 2 mm. Upřednostňuje se použití misek sestávajících se z plochých skleněných desek s dokonale rovným hliníkovým nebo plastovým kroužkem o průměru 200 mm a výšce 20 mm.

Pipetovat do děr přesně odměřená množství roztoku antibiotika mezi 0,10 a 0,15 ml, v závislosti na průměru děr.

U každého vzorku opakovat difúzi nejméně čtyřikrát s každou koncentrací, aby každé stanovení zahrnovalo vyhodnocení 32 inhibičních zón.

Inkubovat misky během 18 hodin asi při 28 až 30 °C.

Změřit průměr inhibičních zón, přednostně projekcí. Zaznamenat měření na semilogaritmický papír zanesením logaritmu koncentrací proti průměru inhibičních zón. Načrtnout křivky standardního roztoku a extraktu. Pokud nedošlo k interferenci, obě křivky budou paralelní.

Logaritmus relativní aktivity se vypočítá pomocí této rovnice:

Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita x relativní aktivita.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u jednoho vzorku nesmí překročit 10 % relativní hodnoty.

Tato metoda umožňuje stanovit tylosin v krmivech, koncentrátech a premixech. Spodní hranice pro stanovení je 2 ppm.

Vzorek se ošetří fosfátovým pufračním roztokem o pH 8, předehřátým na 80 °C, a poté se extrahuje methanolem. Po odstředění se extrakt zředí a jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze tylosinu na agarovém médiu naočkovaném Sarcina lutea. Difúze se projeví vytvořením inhibičních zón za přítomnosti mikroorganismu. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika.

Naočkovat Sarcina lutea do zkumavky se šikmým agarem odebraným z kultivačního média (4.1) upraveného na pH 7,0. Inkubovat přes noc při asi 35 °C. Skladovat kulturu v chladničce a přeočkovat každý měsíc na šikmý agar.

Smýt bakterie ze zkumavky se šikmým agarem (3.1) za použití 2 až 3 ml fyziologického roztoku (4.4). Naočkovat tuto suspenzi do Rouxovy baňky obsahující 250 ml kultivačního média (4.1), upravit na pH 7,0. Inkubovat 24 hodin při 35 °C, poté smýt bakterie za pomoci 25 ml fyziologického roztoku (4.4). Homogenizovat a zředit tuto suspenzi s cílem získat 75 % světelnou propustnost při 650 nm.

Pokud se tato suspenze skladuje v chladničce, její trvanlivost je jeden týden.

Předběžnými testy na deskách s bazálním médiem pro stanovení (4.1) určit množství očkovací látky, které umožní získat pro použité koncentrace tylosinu největší možné, ale ještě zřetelné inhibiční zóny. Očkování kultivačního média se provádí při 48 až 50 °C.

Za účelem udržování rodičovského kmene a přípravy bakteriální suspenze upravit pH na7,0 a za účelem stanovení na 8,0.

Sterilní fyziologický roztok.

Čistý methanol.

40 % (V/V) methanol.

Směs fosfátového pufru (4.2)/čistý methanol: 60/40 objemově.

Standardní látka: tylosin o známé aktivitě.

Sušit standardní látku (4.8) 3 hodiny při 60 °C ve vakuové sušárně (5 mm rtuti). Navážit 10 až 50 mg do odměrné baňky, rozpustit v 5 ml methanolu (4.5) a zředit roztok fosfátovým pufrem, pH 7 (4.3) s cílem získat koncentraci základního tylosinu 1000 μg/ml.

Na základě tohoto zásobního roztoku připravit rozředěním směsi (4.7) standardní pracovní roztok S₈ obsahující 2 μg základního tylosinu na 1 ml.

Poté připravit postupným ředěním (1 + 1) za použití směsi (4.7) tyto koncentrace:

Pro koncentráty použít 10 g zkušebního vzorku; pro premixy a krmiva 20 g zkušebního. Přidat 60 ml fosfátového pufru, pH 8 (4.2), předehřátého na 80 °C, a homogenizovat 2 minuty (kuchyňský mixer, Ultra-turrax atd.).

Nechat stát 10 minut, přidat 40 ml methanolu (4.5) a homogenizovat 5 minut. Odstředit extrakt a zředit alikvotní část směsi (4.7) s cílem získat předpokládanou koncentraci tylosinu 2 μg/ml (= U₈). Poté připravit koncentrace U₄, U₂ a U₁ postupným ředěním (1 + 1) za použití směsi (4.7).

Pro obsahy nižší než 10 ppm odpařit extrakt do sucha v rotačním odpařovači při 35 °C a rozpustit reziduum ve 40 % methanolu (4.6).

Naočkovat bazální médium pro stanovení (4.1) upravené na pH 8 při 48 až 50 °C suspenzí bakterií (3.2).

Difúze na agaru se provádí v miskách za použití čtyř koncentrací standardního roztoku (S₈, S₄, S₂, S₁) a čtyř koncentrací extraktu (U₈, U₄,U₂, U₁). Každá miska musí obsahovat čtyři koncentrace standardního roztoku a extraktu.

Za tímto účelem vybrat misky o takové velikosti, aby bylo možné udělat v agarovém médiu nejméně 8 děr o průměru 10 až 13 mm. Vypočítat množství očkovaného kultivačního média (7.1), které se má použít pro získání stejnoměrné vrstvy o tloušťce 2 mm. Upřednostňuje se použití misek sestávajících se z plochých skleněných desek s dokonale rovným hliníkovým nebo plastovým kroužkem o průměru 200 mm a o výšce 20 mm.

Pipetovat do děr přesně odměřená množství roztoku antibiotika mezi 0,10 a 0,15 ml, v závislosti na průměru děr.

U každého vzorku opakovat difúzi nejméně čtyřikrát s každou koncentrací, aby každé stanovení zahrnovalo vyhodnocení 32 inhibičních zón.

Inkubovat misky přes noci při 35 až 37 °C.

Změřit průměr inhibičních zón, přednostně projekcí. Zaznamenat měření na semilogaritmický papír zanesením logaritmu koncentrací proti průměru inhibičních zón. Načrtnout křivky standardního roztoku a extraktu. Pokud nedošlo k interferenci, obě křivky budou paralelní.

Logaritmus relativní aktivity se vypočítá pomocí této rovnice:

Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita x relativní aktivita.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u jednoho vzorku nesmí překročit 10 % relativní hodnoty.

Metoda je určena pro stanovení obsahu virginyamicinu v krmivech a premixech. Dolní mez stanovitelnosti obsahu je 2 mg/kg (2 ppm)(1 mg virginiamycinu se rovná 1000 UK jednotek.).

Vzorek se extrahuje methanolickým smáčedlem Tween 80. Extrakt se dekantuje nebo odstředí a rozředí. Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze virginiamycinu na agaru, na nějž byl naočkován Micrococcus luteus. Difúze se projevuje vytvořením inhibičních zón mikroorganismu. Průměr těchto zón je považován za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotik pro stupnici použitých koncentrací.

Kultivační médium (4.1) v šikmých zkumavkách se naočkuje mikroorganismem Micrococcus luteus a 24 hodin se nechá inkubovat při teplotě 30 ^oC. Kultura se skladuje v chladničce při teplotě okolo 4 ^oC. Očkování se obnovuje každé dva týdny.

Vytvořená čerstvá kultura z nedávno připraveného agarového média (3.1) v šikmých zkumavkách se sklidí za pomoci 2 až 3 ml roztoku chloridu sodného (4.3). Touto suspenzí se naočkuje 250 ml kultivačního média (4.1) umístěného do Rouxovy baňky a nechá se inkubovat po dobu 18 až 20 hodin při teplotě 30 ^oC. Porost se sklidí pomocí 25 ml roztoku chloridu sodného (4.3) a zamíchá se. Suspenze se rozředí v poměru 1/10 roztokem chloridu sodného (4.3). Průchod světla suspenze musí být okolo 75 %, měřeno při 650 nm a tloušťce 1 cm ve srovnání s roztokem chloridu sodného (4.3). Tato suspenze může být uchována po dobu jednoho týdne při teplotě okolo 4 ^oC,

Roztok chloridu sodného 0,8 % (hmot./obj.): 8 g chloridu sodného se rozpustí ve vodě a rozředí se na 1000 ml; sterilizuje se.

Methanol.

Směs fosfátového tlumivého roztoku (4.2) a methanolu (4.4): 80/20 (obj./obj.).

0,5 % (hmot./obj.) methanolické smáčedlo Tween 80: 5 g Tweenu 80 se rozpustí v methanolu (4.4) a doředí se methanolem na 1000 ml.

Standardní substance: virginiamycin známé aktivity.

Přesně navážené množství standardní substance (4.7) se rozpustí v methanolu (4.4) a methanolem (4.4) se doředí tak, aby se získal roztok obsahující 1000 μg virginiamycinu na ml.

Je-li tento roztok uchován v uzátkované baňce při teplotě 4 ^oC, je stabilní po dobu 5 dní.

Z tohoto zásobního roztoku se postupným ředěním za pomoci směsi (4.5) připraví následující roztoky:

Odváží se 50 g vzorku se, přidá se 200 ml roztoku (4.6) a po dobu 30 minut se protřepává. Poté se nechá usadit nebo se odstředí. 20 ml roztoku se odebere z povrchu a odpařuje se na 5 ml v rotační odparce při teplotě nepřesahující 40 ^oC. Zbytek se rozředí směsí (4.5) tak, aby se získal předpokládaný obsah virginiamycinu 1 μg/ml (= u₈).

Odváží se množství vzorku nepřevyšující 10 g a obsahující mezi 1 a 50 mg virginiamycinu, přidá se 100 ml roztoku (4.6) a po dobu 30 minut se protřepává. Nechá se usadit nebo se odstředí, poté se rozředí směsí (4.5) tak, aby se získal předpokládaný obsah virginiamycinu 1 μg/ml (= u₈).

Z roztoku u₈ se připraví roztoky u₄ (předpokládaný obsah: 0,5 μg/ml), u₂ (předpokládaný obsah: 0,25 μg/ml) a u₁ (předpokládaný obsah: 0,125 μg/ml) prostřednictvím postupného rozřeďování (1 + 1) se směsí (4.5).

Zkušební kultivační médium (4.1) se naočkuje bakteriální suspenzí (3.2) při teplotě přibližně 50 ^oC. Předběžnými testy na miskách s kultivačním médiem (4.1) se stanoví množství bakteriální substance umožňující získat nejrozsáhlejší a nejjasnější inhibiční zóny pro různé koncentrace virginiamycinu.

Difúze na agaru se provádí na miskách se čtyřmi koncentracemi standardního roztoku (s₈, s₄, s₂ a s₁) a čtyřmi koncentracemi extrahovaného roztoku (u₈, u₄, u₂ a u₁). Na každé misce musí být nezbytně umístěny čtyři koncentrace standardu a čtyři koncentrace extraktu. Za tímto účelem se zvolí takový rozměr misek, který umožňuje vytvořit v prostředí agaru alespoň osm otvorů o průměru 10 až 13 mm, jejichž středy jsou od sebe vzdáleny alespoň 30 mm. Test by měl být prováděn především na miskách, které jsou vyrobeny ze skleněné desky, na kterou se umístí hliníkové nebo plastové kroužky o výšce 20 mm a průměru 200 mm.

Na misky se nalije kultivační médium (4.1) naočkované podle bodu 7.1. v takovém množství, které umožňuje získat přibližně 2 mm tlustou vrstvu (60 ml na misku o průměru 200 mm). Nechá se ztuhnout, vytvoří se otvory a do nich se umístí přesně naměřené objemy extrahovaných a standardních roztoků (mezi 0,10 a 0,15 ml na otvor v závislosti na průměru). Každá koncentrace se použije alespoň čtyřikrát tak, aby se při každém stanovení obsahu hodnotilo 32 inhibičních zón.

Misky se nechají inkubovat po dobu 16 až 18 hodin při teplotě 30 ± 2 ^oC.

Průměr inhibičních zón se změří s přesností na 0,1 mm. Průměrné rozměry pro každou koncentraci se zaznamenají na semilogaritmický papír grafem znázorňujícím logaritmus koncentrací v závislosti na průměrech inhibičních zón. Nejlépe vyhovující přímky standardního a extrahovaného roztoku se zaznamenají např. následovně:

„Nejlépe vyhovující bod“ pro nejnižší úroveň standardního vzorku (SL) se stanoví za použití vzorce:

„Nejlépe vyhovující bod“ pro nejvyšší úroveň standardního vzorku (SH) se stanoví za použití vzorce:

Nahrazením u₁, u₂, u₄ a u₈, za s₁, s₂, s₄ a s₈ ve výše uvedených vzorcích se podobným způsobem vypočítají „nejlépe vyhovující body“ pro nejnižší úroveň extraktu (UL) a nejvyšší úroveň extraktu (UH).

Vypočítané hodnoty SL a SH se zaznamenají na stejný grafický papír a jejich spojením se získá „nejlépe vyhovující“ přímka standardního roztoku. Podobně se zaznamenají i hodnoty UL a UH a jejich spojením se získá „nejlépe vyhovující“ přímka extraktu.

Nejsou-li přímky ničím ovlivněny, měly by být rovnoběžné. Z praktických důvodů se přímky považují za rovnoběžné, pokud se hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) neliší o více než o 10 % od své průměrné hodnoty.

Jestliže přímky nejsou rovnoběžné, je možné eliminovat buď u₁ a s₁ nebo u₈ a s₈ a hodnoty SL, SH, UL a UH se poté vypočítají za pomocí následujících vzorců:

a podobně pro hodnoty UL a UH. Při použití této alternativy by měla být dodržena stejná kritéria pro rovnoběžnost. Skutečnost, že byl výsledek vypočítán ze tří mezí, se poznamená v závěrečné zprávě.

Pokud jsou přímky považovány za rovnoběžné, vypočítá se logaritmus relativní aktivity (log A) pomocí jednoho z následujících vzorců podle toho, zda byly pro hodnocení rovnoběžnosti použity tři nebo čtyři úrovně.

Pro čtyři úrovně

Pro tři úrovně

nebo

Aktivita extraktu vzorku = aktivita odpovídajícího standardu x A

(u₈ = s₈ × A)

Jestliže se relativní aktivita nachází mimo rozmezí od 0,5 do 2,0, zkouška se zopakuje, přičemž se odpovídajícím způsobem upraví koncentrace extraktu nebo, jestliže to není možné, standardních roztoků. Jestliže není možné dostat relativní aktivitu do požadovaného rozmezí, je třeba považovat výsledek za přibližný a tato skutečnost by měla být uvedena v závěrečné zprávě.

Pokud přímky nejsou považovány za rovnoběžné, stanovení se opakuje. Není li dosaženo rovnoběžnosti, považuje se stanovení za nevyhovující.

Výsledek se vyjádří v miligramech virginiamycinu na kilogram krmiva.

Rozdíl výsledků mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku stejným laborantem nesmí být vyšší než:

• 2 mg/kg, v absolutní hodnotě, u obsahů virginiamycinu nižších než 10 mg/kg,

• 20 % nevyššího výsledku pro obsahy od 10 do 25 mg/kg,

• 5 mg/kg, v absolutní hodnotě, u obsahů virginiamycinu od 25 do 50 mg/kg,

• 10 % nevyššího výsledku pro obsahy nad 50 mg/kg.