Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

PŘÍLOHA

POPIS REFERENČNÍCH METOD ROZBORU

Stanovení obsahu alkoholu v % objemových

Referenční metoda obsahuje dva dodatky:

Metoda je vhodná pro stanovení skutečného obsahu alkoholu v % objemových v lihovinách.

ISO 3696:1987: Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

Skutečný obsah alkoholu v % objemových v lihovině je roven počtu litrů ethanolu obsaženého ve 100 litrech směsi voda-alkohol, která má stejnou hustotu jako lihovina po destilaci. Referenční hodnoty obsahu alkoholu v % objemových při 20 °C pro hustoty různých směsí voda-alkohol při 20 °C, které mají být použity, jsou uvedeny v tabulce, kterou na mezinárodní úrovni přijala Mezinárodní organizace pro legální metrologii ve svém doporučení č. 22.

Obecná rovnice vztahu mezi obsahem alkoholu v %objemových a hustotou směsi voda-alkohol při dané teplotě je uvedena v příloze nařízení Komise (EHS) č. 2676/90 (Úř. věst. L 272, 3.10.1990, s. 1) na s. 40 v kapitole 3 „Obsah alkoholu v % objemových“ nebo v příručce metod rozboru úřadu OIV (1994) (s. 17).

U likérů a krémů, u nichž se přesný objem měří velmi obtížně, musí být vzorek zvážen a nejprve se určí obsah alkoholu vztažený na jednotku hmotnosti.

Přepočítávací vzorec:

kde

Po vydestilování se obsah alkoholu v % objemových stanoví pyknometricky, elektronickou denzimetrií nebo denzimetrií s použitím hydrostatických vah.

Metoda je vhodná pro přípravu destilátu, který má být použit ke stanovení skutečného obsahu alkoholu v % objemových v lihovinách.

Lihoviny se destilují za účelem oddělení ethanolu a jiných těkavých složek od extrakčního zbytku (látek, které nedestilují).

Obvyklé laboratorní přístroje, a zejména:

Popsaná aparatura je určena pro vzorky o objemu nejméně 200 ml. Vzorky o menším objemu (100 ml) mohou být destilovány s použitím menší destilační baňky a za předpokladu, že bude použit destilační přestupník proti rozstříkávání nebo jiné zařízení proti strhávání kapaliny.

Vzorky se před rozborem uchovávají při laboratorní teplotě.

Předběžná poznámka:

• Destilaci lze provádět také postupem zveřejněným unií IUPAC (1968).

Přezkoušení destilační aparatury.

Aparatura musí mít následující vlastnosti:

• při destilaci 200 ml směsi voda-alkohol o známé koncentraci blízké 50 % obj. nesmí dojít ke ztrátám alkoholu vyšším než 0,1 % obj.

Lihoviny o obsahu alkoholu nižším než 50 % obj.

Do odměrné baňky se odměří 200 ml lihoviny.

Zaznamená se teplota této kapaliny, nebo se vytemperuje na standardní teplotu (20 °C).

Vzorek se převede do destilační baňky destilační aparatury a odměrná baňka se třikrát vypláchne vždy 20 ml destilované vody. Oplachová voda se vždy přidá k obsahu destilační baňky.

Toto zředění 60 mililitry je dostatečné u lihovin obsahujících méně než 250 g suchého extraktu na litr. Jinak by pro zabránění pyrolýze musel objem oplachové vody při koncentraci suchého extraktu 300 g/l činit alespoň 70 ml, při koncentraci 400 g/l 85 ml a při koncentraci suchého extraktu 500 g/l 100 ml (u některých ovocných likérů nebo krémů). Pro různé objemy vzorků se tyto objemy odpovídajícím způsobem upraví.

Přidá se několik varných tělísek (3.1) (a odpěňovací emulze u krémových likérů).

Do původní odměrné baňky na 200 ml, do níž bude jímán destilát, se přidá 20 ml destilované vody. Tato baňka musí být poté umístěna do chladné vodní lázně (4.1) (o teplotě 10 až 15 °C u anýzových lihovin).

Za občasného míchání obsahu destilační baňky, aby nedošlo ke strhávání kapaliny nebo ke spékání, se destiluje, dokud hladina destilátu nevystoupí několik milimetrů pod rysku odměrné baňky.

Po ochlazení destilátu na původní teplotu kapaliny ± 0,5 °C se baňka doplní destilovanou vodou po rysku a obsah se důkladně promíchá.

Tento destilát se použije pro stanovení obsahu alkoholu v % objemových (dodatek II).

Lihoviny o obsahu alkoholu vyšším než 50 % obj.

Do odměrné baňky na 100 ml se odměří 100 ml lihoviny a obsah se převede do destilační baňky destilační aparatury.

Odměrná baňka se několikrát vypláchne destilovanou vodou a oplachová voda se přidá k obsahu destilační baňky. Použije se dostatečné množství vody, aby byla destilační baňka naplněna přibližně do 230 ml.

Do odměrné baňky na 200 ml, do níž bude jímán destilát, se přidá 20 ml destilované vody. Tato baňka musí být poté umístěna do chladné vodní lázně (4.1) (o teplotě 10 až 15 °C u anýzových lihovin).

Za občasného míchání obsahu destilační baňky se destiluje, dokud hladina destilátu nevystoupí několik milimetrů pod rysku 200ml odměrné baňky.

Po ochlazení destilátu na původní teplotu kapaliny ± 0,5 °C se baňka doplní destilovanou vodou po rysku a obsah se důkladně promíchá.

Tento destilát se použije pro stanovení obsahu alkoholu v % objemových (dodatek II).

Obsah alkoholu v % objemových v lihovině je dvakrát vyšší než obsah alkoholu v destilátu.

Obsah alkoholu v % objemových se získá z hustoty destilátu stanovené pyknometricky.

Není-li uvedeno jinak, použijí se při rozboru pouze reakční činidla o čistotě p.a. a voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696:1987.

Roztok chloridu sodného (2 % (m/V))

Pro přípravu 1 litru roztoku se odváží 20 g chloridu sodného a rozpustí se v 1 litru vody.

Obvyklé laboratorní přístroje, a zejména:

Předběžné poznámky:

• V této metodě je popsáno použití pyknometru o objemu 100 ml ke stanovení obsahu alkoholu; poskytuje nejsprávnější výsledky. Je však možné použít menší pyknometr, například o objemu 50 ml.

Kalibrace pyknometru sestává ze stanovení následujících parametrů:

• tára prázdného pyknometru,

• objem pyknometru při 20 °C,

• hmotnost pyknometru naplněného vodou při 20 °C.

Kalibrace pomocí jednoramenných vah:

Stanoví se:

• hmotnost čistého, suchého pyknometru (P),

• hmotnost pyknometru naplněného vodou při t°C (P1),

• hmotnost tárovací nádobky (T0).

Zváží se čistý, suchý pyknometr (P).

Pyknometr se opatrně naplní destilovanou vodou o laboratorní teplotě a osadí se teploměrem.

Pyknometr se pečlivě otře do sucha a umístí se do tepelně izolovaného pláště. Pyknometr v plášti se převrací, dokud není teplota na teploměru konstantní.

V postranní kapiláře pyknometru se nechá vystoupat voda až k hornímu okraji kapiláry. Přesně se odečte teplota a podle potřeby se koriguje na nepřesnost teplotní stupnice.

Pyknometr naplněný vodou se zváží (P1).

Zváží se tárovací nádobka (T0).

• Tára prázdného pyknometru = P – m

  kde m je hmotnost vzduchu v pyknometru.

  m = 0,0012 × (P1 – P)

  0,0012 je hustota suchého vzduchu při 20 °C a tlaku 760 mm Hg

• Objem pyknometru při 20 °C:

  kde Ft je faktor pro teplotu t °C z tabulky I v kapitole 1 „Hustota a relativní hustota“ v příloze nařízení (EHS) č. 2676/90 (s. 10).

  Hodnota V20 °C musí být známa s přesností na 0,001 ml.

• Hmotnost vody v pyknometru při 20 °C:

  kde 0,998203 je hustota vody při 20 °C.

  Podle potřeby lze použít hodnotu 0,99715 pro hustotu vody při normálním tlaku a obsah alkoholu lze vypočítat pro odpovídající hustotu na vzduchu odečtenou z tabulek úřadu HM Customs and Excise (Úřad pro cla a nepřímé daně).

Metoda kalibrace pomocí dvouramenných vah:

• A.4.1.2.1. Tárovací nádobka se umístí na levou misku vah a čistý, suchý pyknometr s postranní kapilárou se zátkou na pravou misku vah. Váhy se vyváží závažím na misce s pyknometrem (p gramů).
• A.4.1.2.2. Pyknometr se opatrně naplní destilovanou vodou o laboratorní teplotě a osadí se teploměrem. Pečlivě se otře do sucha a umístí se do tepelně izolovaného pláště. Pyknometr v plášti se převrací, dokud není teplota na teploměru konstantní.

  V postranní kapiláře pyknometru se nechá voda vystoupat až přesně k hornímu okraji kapiláry. Postranní kapilára se osuší a uzavře se zátkou. Přesně se odečte teplota a podle potřeby se koriguje na nepřesnost teplotní stupnice.

  Pyknometr naplněný vodou se zváží tak, že se váhy vyváží závažím na misce pyknometru (p’ gramů).

• A.4.1.2.3. Výpočet

  • Tára prázdného pyknometru = p + m

    kde m je hmotnost vzduchu v pyknometru.

    m = 0,0012 × (p – p’)

  • Objem pyknometru při 20 °C

    kde Ft je faktor pro teplotu t °C z tabulky I v kapitole 1 „Hustota a relativní hustota“ v příloze nařízení (EHS) č. 2676/90 (s. 10).

    Hodnota V20 °C musí být známa s přesností na 0,001 ml.

  • Hmotnost vody v pyknometru při 20 °C:

    kde 0,998203 je hustota vody při 20 °C.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1,2].

Druhy vzorků

AOvocný likér: rozdělená úroveň (*).BBrandy: neoznačené duplikáty.CWhisky: neoznačené duplikáty.DGrappa: rozdělená úroveň (*).EAkvavit: rozdělená úroveň (*).FRum: rozdělená úroveň (*).

Hustota kapaliny se stanoví z elektronického měření kmitočtu kmitajícího oscilátoru ve tvaru U-trubice. Měření se provádí tak, že se vzorek přidá do oscilačního systému, jehož specifický oscilační kmitočet se přidáním látky změní.

Není-li uvedeno jinak, použijí se při rozboru pouze reakční činidla o čistotě p.a. a voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696:1987.

Obvyklé laboratorní přístroje, a zejména:

Statistické výsledky mezilaboratorního testu

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1,2].

Druhy vzorků

AOvocný likér: rozdělená úroveň (*).BBrandy: neoznačené duplikáty.CWhisky: neoznačené duplikáty.DGrappa: rozdělená úroveň (*).EAkvavit: rozdělená úroveň (*).FRum: rozdělená úroveň (*).

Obsah alkoholu v lihovinách se měří denzimetricky s použitím hydrostatických vah založených na Archimedově zákoně, podle něhož na těleso ponořené do kapaliny působí svisle vzhůru síla rovnající se tíze kapaliny vytlačené tělesem.

Není-li uvedeno jinak, použijí se při rozboru pouze reakční činidla o čistotě p.a. a voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696:1987.

Pro přípravu 100 ml roztoku se odváží 30 g hydroxidu sodného a objem se doplní 96 % ethanolem.

Obvyklé laboratorní přístroje, a zejména:

Plovák a odměrný válec se mezi jednotlivými měřeními očistí destilovanou vodou, vysuší měkkým laboratorním papírem, který neuvolňuje vlákna, a opláchnou se roztokem, jehož hustota má být stanovena. Měření musí být provedeno, jakmile se aparatura ustálí, aby se omezily ztráty alkoholu vypařováním.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1,2].

Druhy vzorků

AOvocný likér: rozdělená úroveň (*).BBrandy: neoznačené duplikáty.CWhisky: neoznačené duplikáty.DGrappa: rozdělená úroveň (*).EAkvavit: rozdělená úroveň (*).FRum: rozdělená úroveň (*).

V souladu s nařízením (EHS) č. 1576/89 se předpokládá použití této metody pouze u akvavitu, u něhož je suchý extrakt omezen do hodnoty 15 g/l.

ISO 3696:1987: Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

Celkový suchý extrakt nebo celková suchá hmota zahrnuje veškerou hmotu, která je za daných fyzikálních podmínek netěkavá.

Zváží se zbytek po odpaření lihoviny na vodní lázni a po vysušení v sušárně.

Válcová odpařovací miska s rovným dnem o průměru 55 mm.

Vroucí vodní lázeň.

Pipeta na 25 ml třídy přesnosti A.

Laboratorní sušárna.

Exsikátor.

Analytické váhy s přesností na 0,1 mg.

Vzorky se před rozborem uchovávají při laboratorní teplotě.

Do předem zvážené válcové odpařovací misky s rovným dnem o průměru 55 mm se pipetou odměří 25 ml lihoviny obsahující méně než 15 g sušiny na litr. Během první hodiny odpařování se odpařovací miska umístí na víko vroucí vodní lázně, aby kapalina nevřela, neboť by to mohlo vést ke ztrátám při rozstřikování. Poté se miska ponechá další hodinu v bezprostředním kontaktu s párou vodní lázně.

Sušení se dokončí tak, že se odpařovací miska umístí na dvě hodiny do sušárny při 105 ± 3 °C. Odpařovací miska se nechá vychladnout v exsikátoru a společně s obsahem se zváží.

Hmotnost zbytku vynásobená 40 se rovná hmotnosti suchého extraktu v lihovině a vyjádří se v g/l s přesností na jedno desetinné místo.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1,2].

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BRum: rozdělená úroveň.CGrappa: rozdělená úroveňDAkvavit: rozdělená úroveň

V nařízení (EHS) č. 1576/89 se stanoví minimální obsah těkavých látek jiných než ethanol a methanol u řady lihovin (u rumu, pěstitelské vínovice, ovocných destilátů atd.). Pouze u těchto lihovin se tímto obsahem obvykle rozumí součet koncentrací:

• 1. těkavých kyselin vyjádřených jako octová kyselina;
• 2. aldehydů vyjádřených jako ethanal součtem ethanalu (acetaldehydu) a ethanalového podílu v 1,1-diethoxyethanu (acetalu);
• 3. následujících vyšších alkoholů: propan-1-olu, butan-1-olu, butan-2-olu, 2-methylpropan-1-olu stanovených jednotlivě a dále 2-methylbutan-1-olu a 3-methybutan-1-olu stanovených jednotlivě nebo jako součet obou;
• 4. ethyl-acetátu.

Obvyklými metodami stanovení těkavých látek jsou tyto metody:

• těkavé kyseliny stanovením celkové kyselosti těkavých kyselin,

• aldehydy (ethanal a acetal), ethyl-acetát a alkoholy plynovou chromatografií (GPC).

Stanovení jiných než výše uvedených těkavých látek plynovou chromatografií může být zajímavé jako způsob stanovení jak původu suroviny použité při destilaci, tak podmínek destilace.

Některé lihoviny obsahují jiné těkavé látky, jako jsou aromatické složky, které jsou charakteristické pro surovinu použitou pro získání alkoholu, pro aroma lihoviny a pro zvláštní charakter přípravy lihoviny. Tyto složky jsou důležité pro posouzení požadavků stanovených v nařízení (EHS) č. 1576/89.

Tato metoda je vhodná pro stanovení 1,1-diethoxyethanu (acetalu), 2-methylbutan-1-olu (aktivního amylalkoholu), 3-methylbutan-1-olu (isoamylalkoholu), methanolu (methylalkoholu), ethyl-ethanoátu (ethyl-acetátu), butan-1-olu (n-butanolu), butan-2-olu (sek-butan-1-olu), 2-methylpropan-1-olu (isobutylalkoholu), propan-1-olu (n-propanolu) a ethanalu (acetaldehydu) v lihovinách plynovou chromatografií. Metoda používá vnitřní standard, například pentan-3-ol. Koncentrace těchto analytů se vyjadřuje v gramech na 100 litrů čistého alkoholu; před rozborem musí být stanoven obsah alkoholu ve výrobku. Mezi lihoviny, jejichž rozbor může být proveden touto metodou, patří whisky, brandy, rum, vínovice, ovocný destilát a matolinová pálenka.

ISO 3696:1987: Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

Kongenery se rozumějí těkavé látky, které vznikají spolu s ethanolem při kvašení, destilaci a zrání lihovin.

Kongenery v lihovinách se stanoví přímým nástřikem lihoviny, nebo vhodně naředěné lihoviny, do systému plynového chromatografu (GC). Před nástřikem se do lihoviny přidá vhodný vnitřní standard. Kongenery se separují při teplotním programu na vhodné koloně a detekují se plamenově-ionizačním detektorem (FID). Koncentrace každého z kongenerů se stanoví proti vnitřnímu standardu z odezvových faktorů, které se získají při kalibraci za stejných chromatografických podmínek, jako jsou podmínky při rozboru lihoviny.

Není-li uvedeno jinak, použijí se pouze reakční činidla o certifikované čistotě vyšší než 97 %, zakoupená u dodavatele s certifikátem ISO, která při zkušebním zředění neobsahují jiné kongenery (to lze potvrdit nástřikem jednotlivých standardů kongenerů při zkušebním zředění za chromatografických podmínek podle bodu 6.4), a voda výhradně o čistotě alespoň 3, jak je definována v normě ISO 3696. Acetal a acetaldehyd musí být uchovávány v temnu při méně než 5 °C, všechna ostatní reakční činidla mohou být uchovávána při laboratorní teplotě.

Čistý ethanol (CAS 64-17-5).

Methanol (CAS 67-56-1).

Propan-1-ol (CAS 71-23-8).

2-Methylpropan-1-ol (CAS 78-83-1).

Vhodné vnitřní standardy: pentan-3-ol (CAS 584-02-1), pentan-1-ol (CAS 71-41-0), 4-methylpentan-1-ol (CAS 629-89-1) nebo methyl-nonanoát (CAS 1731-84-6).

2-Methylbutan-1-ol (CAS 137-32-6).

3-Methylbutan-1-ol (CAS 123-51-3).

Ethyl-acetát (CAS 141-78-6).

Butan-1-ol (CAS 71-36-3).

Butan-2-ol (CAS 78-92-2).

Acetaldehyd (CAS 75-07-0).

Acetal (1,1-diethoxyethan) (CAS 105-57-7).

Roztok ethanolu, 40 % (V/V)

Pro přípravu roztoku ethanolu o koncentraci 400 ml/l se 400 ml ethanolu (5.1) odměří do odměrné baňky na 1 litr, doplní se po rysku destilovanou vodou a promíchá se.

Pouze pro líh zemědělského původu: absolutní ethanol (CAS 64-17-5).

Příprava a uchovávání standardních roztoků (postup pro validovanou metodu)

Všechny standardní roztoky musí být uchovávány při teplotě nižší než 5 °C a musí být každý měsíc čerstvě připraveny. Hmotnosti složek a roztoků musí být zaznamenány s přesností na 0,1 mg.

Standardní roztok – A

Následující reakční činidla se odměří pipetou do odměrné baňky na 100 ml obsahující 60 ml roztoku ethanolu (5.13) pro minimalizaci vypařování, objem se doplní po rysku roztokem ethanolu (5.13) a důkladně promíchá. Zaznamená se hmotnost baňky, každé přidané složky a celková konečná hmotnost obsahu.

Je vhodné přidat acetal a acetaldehyd jako poslední, aby se minimalizovaly ztráty vypařováním.

Pouze pro líh zemědělského původu: standardní roztok A se připraví tak, že se pipetou odměří reakční činidla se sníženými objemy vyšších alkoholů za účelem získání standardních roztoků o koncentracích blízkých zákonným limitům pro líh zemědělského původu.

Standardní roztok – B

Do odměrné baňky na 100 ml obsahující přibližně 80 ml roztoku ethanolu (5.13) se pipetou odměří 3 ml pentan-3-olu nebo jiného vhodného vnitřního standardu (5.5), objem se doplní po rysku roztokem ethanolu (5.13) a důkladně se promíchá.

Zaznamená se hmotnost baňky, hmotnost pentan-3-olu nebo jiného vnitřního standardu a celková konečná hmotnost obsahu.

Pouze pro líh zemědělského původu: standardní roztok B se připraví tak, že se pipetou odměří vhodný vnitřní standard se sníženými objemy za účelem získání standardních roztoků s koncentracemi blízkými zákonným limitům pro líh zemědělského původu.

Standardní roztok – C

Do odměrné baňky na 100 ml obsahující přibližně 80 ml roztoku ethanolu (5.13) se pipetou odměří 1 ml roztoku A (5.14.1) a 1 ml roztoku B (5.14.2), objem se doplní po rysku roztokem ethanolu (5.13) a důkladně se promíchá.

Zaznamená se hmotnost baňky, každé přidané složky a celková konečná hmotnost obsahu.

Standardní roztok – D

Pro zabezpečení kontinuity rozboru se s použitím dříve připraveného standardu A (5.14.1) připraví standard pro řízení jakosti (QC). Do odměrné baňky na 100 ml obsahující přibližně 80 ml roztoku ethanolu (5.13) se pipetou odměří 1 ml roztoku A (5.14.1), objem se doplní po rysku roztokem ethanolu (5.13) a důkladně promíchá.

Zaznamená se hmotnost baňky, každé přidané složky a celková konečná hmotnost obsahu.

Standardní roztok – E

Do odměrné baňky na 100 ml obsahující přibližně 80 ml roztoku ethanolu (5.13) se pipetou odměří 10 ml roztoku B (5.14.2), objem se doplní po rysku roztokem ethanolu (5.13) a důkladně se promíchá.

Zaznamená se hmotnost baňky, každé přidané složky a celková konečná hmotnost obsahu.

Standardní roztoky pro kontrolu linearity odezvy plamenově-ionizačního detektoru (FID)

Do samostatných odměrných baněk na 100 ml obsahujících přibližně 80 ml roztoku ethanolu (5.13) se pipetou odměří 0, 0,1, 0,5, 1,0 a 2,0 ml roztoku A (5.14.1) a 1,0 ml roztoku B (5.14.2), objem se doplní po rysku roztokem ethanolu (5.13) a důkladně se promíchá.

Zaznamená se hmotnost baňky, každé přidané složky a celková konečná hmotnost obsahu.

Standardní roztok pro řízení jakosti (QC)

Do navažovací baňky se pipetou odměří 9 ml standardního roztoku D (5.14.4) a 1 ml standardního roztoku E (5.14.5) a obsah se důkladně se promíchá.

Zaznamená se hmotnost navažovací baňky, každé přidané složky a celková konečná hmotnost obsahu.

Zařízení pro stanovení hustoty a obsahu alkoholu.

Analytické váhy s přesností na 0,1 mg.

Plynový chromatograf s možností teplotního programování, vybavený plamenově-ionizačním detektorem a integrátorem nebo jiným zařízením pro zpracování dat, které umožňuje měřit plochy píků nebo výšky píků.

Kolona (kolony) pro plynovou chromatografii, umožňující takovou separaci analytů, aby bylo rozlišení jednotlivých složek (kromě 2-methylbutan-1-olu a 3-methylbutan-1-olu) alespoň 1,3.

Vhodné jsou následující příklady kolon a chromatografických podmínek:

• 1. Retenční prázdná předkolona 1 m × 0,32 mm (vnitřní průměr), spojená s kolonou CP-WAX 57 CB 50 m × 0,32 mm (vnitřní průměr), tloušťka vrstvy 0,2 μm (stabilizovaný polyethylenglykol) napojenou na kolonu Carbowax 400 50 m × 0,32 mm (vnitřní průměr), tloušťka vrstvy 0,2 μm (kolony jsou spojeny press-fit konektory).

  Nosný plyn a tlak:	Helium (135 kPa)
  Teplota kolony:	35 °C po dobu 17 min., nárůst 12 °C/min do 70 °C, prodleva 25 min. při 70 °C
  Teplota nástřiku:	150 °C
  Teplota detektoru:	250 °C
  Nastřikovaný objem:	1 μl, dělicí poměr (split) 20 až 100:1

• 2. Retenční prázdná předkolona 1 m × 0,32 mm (vnitřní průměr), spojená s kolonou CP-WAX 57 CB 50 m × 0,32 mm (vnitřní průměr), tloušťka vrstvy 0,2 μm (stabilizovaný polyethylenglykol) (Retenční prázdná předkolona je napojena press-fit konektorem).

  Nosný plyn a tlak:	helium (65 kPa)
  Teplota kolony:	35 °C po dobu 10 min., nárůst 5 °C/min do 110 °C, nárůst 30 °C/min od 110 do 190 °C, prodleva 2 min. 190 °C
  Teplota nástřiku:	260 °C
  Teplota detektoru	300 °C
  Nastřikovaný objem:	1 μl dělicí poměr (split) 55:1

• 3. Plněná kolona (5 % CW 20M, Carbopack B), 2 m × 2 mm (vnitřní průměr)

  Teplota kolony:	65 °C po dobu 4 min., nárůst 10 °C/min do 140 °C, prodleva 5 min. při 140 °C, nárůst 5 °C/min do 150 °C, prodleva 3 min. při 150 °C
  Teplota nástřiku:	65 °C
  Teplota v detektoru:	200 °C
  Nastřikovaný objem:	1 μl

Laboratorní vzorek

Po obdržení se u každého vzorku změří obsah alkoholu (6.1).

Zkušební vzorek

Zváží se vhodná uzavíratelná navažovací baňka a hmotnost se zaznamená.

Do navažovací baňky se pipetou odměří 9 ml laboratorního vzorku a hmotnost se zaznamená (M_VZOREK).

Přidá se 1 ml standardního roztoku E (5.14.5) a hmotnost se zaznamená (MVS).

Zkušební vzorek se důkladně protřepe (alespoň 20krát se převrátí). Vzorky se musí před rozborem uchovávat při teplotě nižší než 5 °C, aby se minimalizovaly ztráty těkáním.

Slepý pokus

Na vahách s přesností na 0,1 mg (6.2) se zváží vhodně těsně uzavřená navažovací baňka a hmotnost se zaznamená.

Do navažovací baňky se pipetou odměří 9 ml roztoku ethanolu (5.13) o koncentraci 400 ml/l a hmotnost se zaznamená.

Přidá se 1 ml standardního roztoku E (5.14.5) a hmotnost se zaznamená.

Zkušební materiál se prudce protřepe (alespoň 20krát se převrátí). Vzorky musí být před rozborem uchovávány při méně než 5 °C, aby se minimalizovaly ztráty těkáním.

Předběžná zkouška

Provede se nástřik standardního roztoku C (5.14.3), aby bylo jisté, že dojde k separaci všech analytů s minimálním rozlišením 1,3 (kromě 2-methylbutan-1-olu a 3-methylbutan-1-olu).

Kalibrace

Kalibrace se zkontroluje následujícím postupem. Každý ze standardních roztoků (5.14.6) obsahujících vnitřní standard (VS) se analyzuje třikrát po sobě pro potvrzení linearity odezvy. Pro každý nástřik se z integrátoru odečtou plochy nebo výšky píků, vypočte se poměr R pro každý kongener a sestrojí se graf závislosti hodnot R na poměru koncentrací kongeneru a vnitřního standardu (VS) C. Výsledkem by měla být lineární závislost s korelačním koeficientem alespoň 0,99.

Stanovení

Provede se nástřik standardního roztoku C (5.14.3) a dvou standardních roztoků pro řízení jakosti (QC) (5.14.7). Následně se nastříknou neznámé vzorky (připravené podle bodů 8.1 a 8.2), přičemž se po každých 10 vzorcích nastříkne jeden standard pro řízení jakosti (QC) pro potvrzení stability rozboru. Po každých 5 vzorcích se nastříkne standardní roztok C (5.14.3).

Za předpokladu, že lze údaje zkontrolovat způsobem popsaným v dále uvedené metodě, lze použít automatizovaný systém zpracování dat.

Měří se buď plochy píků, nebo výšky píků kongeneru a vnitřního standardu.

Výpočet odezvového faktoru

Z chromatogramu po nástřiku standardního roztoku C (5.14.3) se pomocí rovnice (1) vypočítají odezvové faktory pro každý kongener.

kde

Rozbor vzorku

Koncentrace každého kongeneru ve vzorcích se vypočte z následující rovnice (2).

2)

kde

Rozbor standardního roztoku pro řízení jakosti (QC)

Pomocí dále uvedené rovnice (3) se vypočte výtěžnost pro každý kongener ve standardech pro řízení jakosti (QC), vyjádřený v procentech předpokládané hodnoty.

Koncentrace analytu ve standardu pro řízení jakosti (QC) se vypočte pomocí výše uvedených rovnic (1) a (2).

Konečné vyjádření výsledků

Výsledky se přepočítají z μg/g na gramy na 100 ml čistého alkoholu ve vzorku pomocí rovnice (4):

Koncentracia v g na liter ab solutneho alkoholu =

Konc. 10/(koncentrac.(% × 1000)

Výsledky se vyjádří na 3 platné číslice a maximálně jedno desetinné místo, např. 11,4 g na 100 litrů čistého alkoholu.

Pomocí výše uvedené rovnice (2) se vypočte koncentrace každého kongeneru v roztocích pro řízení jakosti připravených postupem podle bodů 8.1.1 až 8.1.4. Pomocí rovnice (3) se vypočte výtěžnost v procentech předpokládané hodnoty. Leží-li dosažené výsledky pro každý kongener v rozmezí ± 10 % jejich teoretické hodnoty, je možné v rozboru pokračovat. V opačném případě by měla být vyšetřena příčina nesprávného výsledku a učiněny příslušné kroky k nápravě.

Statistické výsledky mezilaboratorního testu: v následující tabulce jsou uvedeny hodnoty pro tyto sloučeniny: ethanal, ethyl-acetát, acetal (1,1-diethoxyethan), celkový ethanal, methanol, butan-2-ol, propan-1-ol, butan-1-ol, 2-methylpropan-1-ol, 2-methylbutan-3-ol, 3-methylbutan-1-ol.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1,2].

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DvWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty. (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Druhy vzorků

ABrandy: neoznačené duplikáty.BKirsch: neoznačené duplikáty.CGrappa: neoznačené duplikáty.DWhisky: rozdělená úroveň (*).ERum: rozdělená úroveň (*).

Tato metoda byla validována mezilaboratorní studií pro rum, brandy, matolinové a ovocné destiláty s obsahem od 30 mg/l do 641 mg/l.

ISO 3696: 1987 Jakost vody pro analytické účely – Specifikace a zkušební metody

Obsah těkavých kyselin se vypočítá odečtením obsahu netěkavých kyselin od celkového obsahu kyselin.

Celkový obsah kyselin je součet titrovatelných kyselin.

Obsah netěkavých kyselin je tvořen zbytky po odpaření lihoviny do sucha.

Celkový obsah kyselin a obsah netěkavých kyselin se určí titrací či potenciometrií.

Není-li uvedeno jinak, použijí se při rozboru pouze reakční činidla o čistotě p.a. a voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696:1987.

0,01 M roztoku hydroxidu sodného (NaOH)

Směsný indikátorový roztok:

• Odváží se 0,1 g indigokarmínu a 0,1 g fenolové červeni.

• Rozpustí se ve 40 ml vody a doplní se ethanolem na 100 ml.

Laboratorní vybavení na nepřímé měření, laboratorní sklo třídy A a následující vybavení:

Před rozborem se vzorky uchovávají při pokojové teplotě.

V případě potřeby se lihovina ozáří ultrazvukovými vlnami (ultrasonikace) nebo se v případě potřeby míchá ve vakuu po dobu dvou minut, aby byla zbavena oxidu uhličitého.

25 ml lihoviny se pipetou přenese do Erlenmeyerovy baňky o obsahu 500 ml.

Přidá se přibližně 200 ml zchlazené převařené destilované vody (čerstvě připravené každý den) a 2–6 kapek směsného indikátorového roztoku (5.2).

Titruje se s 0,01 M roztokem hydroxidu sodného (5.1), dokud se v případě bezbarvé lihoviny žlutozelená barva nezmění ve fialovou a v případě hnědě zbarvené lihoviny v červenohnědou.

Je rovněž možné provést potenciometrickou titraci do pH 7,5.

Nechť n_1 ml je objem 0,01 M přidaného roztoku hydroxidu sodného.

Celkový obsah kyselin (CK) vyjádřený v miliekvivalentech na litr lihoviny je 0,4 × n₁.

Celkový obsah kyselin (CK') vyjádřený v mg kyseliny octové na litr lihoviny je 24 × n₁.

Nechá se odpařit 25 ml lihoviny do sucha:

• 25 ml lihoviny se přenese pipetou do válcové odpařovací misky o průměru 55 mm s rovným dnem. Během první hodiny odpařování je odpařovací miska umístěna na poklopu lázně s vařící vodou, aby se kapalina nevařila, protože by při vystříknutí mohlo dojít k jejím ztrátám.

• Vzorek se dosuší umístěním odpařovací misky do sušárny při 105 °C na dvě hodiny. Odpařovací miska se nechá zchladnout v exsikátoru.

Zbytek po odpařování se rozpustí pomocí zchlazené převařené destilované vody (čerstvě připravené každý den), doplňuje se až do objemu přibližně 100 ml a přidá se 2–6 kapek směsného indikátorového roztoku (5.2).

Titruje se s 0,01 M roztokem hydroxidu sodného (5.1).

Je rovněž možné provést potenciometrickou titraci do pH 7,5.

Nechť n_2 ml je objem 0,01 M přidaného roztoku hydroxidu sodného.

Obsah netěkavých kyselin (NK) vyjádřený v miliekvivalentech na litr lihoviny je 0,4 × n₂.

Obsah netěkavých kyselin (NK) vyjádřený v mg kyseliny octové na litr lihoviny je 24 × n₂.

Vyjádřeno v miliekvivalentech na litr:

Nechť:

Obsah těkavých kyselin, TK, v miliekvivalentech na litr je:

CK – NK

Vyjádřeno v mg kyseliny octové na litr:

Nechť:

Obsah těkavých kyselin, TK, v mg kyseliny octové na litr je:

CK′ – NK′

Vyjádřeno v g kyseliny octové na hl čistého alkoholu o 100 % objemových je:

kde A je objemový obsah alkoholu v lihovině

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1] [2].

Typy vzorků

Tato metoda je vhodná pro stanovení trans-anetholu v anýzových lihovinách kapilární plynovou chromatografií.

ISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

Koncentrace trans-anetholu v lihovině se stanoví plynovou chromatografií (GC). Ke zkušebnímu vzorku a k referenčnímu roztoku trans-anetholu o známé koncentraci se přidá stejné množství vnitřního standardu, např. 4-allylanisolu (estragolu), pokud vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu; zkušební roztok i referenční roztok se zředí 45 % roztokem ethanolu a přímo se nastříknou do plynového chromatografu. U likérů, které obsahují velké množství cukrů, je nezbytné provést extrakci před přípravou vzorku a rozborem.

Při rozboru se použijí pouze reakční činidla o čistotě nejméně 98 %. Použije se voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.

Referenční materiály se skladují v chladu (při 4 °C), chráněny před světlem, v hliníkových nádobách nebo tmavých (hnědých) skleněných reagenčních láhvích. Zátky by měly být překryty nejlépe hliníkovou fólií. Před použitím musí být krystalický anethol převeden táním do kapalné fáze, teplota však při tom nesmí v žádném případě překročit 35 °C.

Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).

1-methoxy-4-(prop-1-en-1-yl)benzen, (trans-anethol) (CAS 4180-23-8).

4-allylanisol, (estragol) (CAS 140-67-0), doporučený vnitřní standard (IS).

Ethanol o 45 % objemových

K 378 g ethanolu o 96 % objemových se přidá 560 g destilované vody.

Všechny standardní roztoky se skladují při laboratorní teplotě (15 až 35 °C), chráněny před světlem, v hliníkových nádobách nebo tmavých (hnědých) skleněných reagenčních láhvích. Zátka by měla být překryta nejlépe hliníkovou fólií.

trans-Anethol a 4-allylanisol jsou prakticky nerozpustné ve vodě a před přidáním ethanolu o 45 % objemových (4.4) musí být rozpuštěny v malém množství ethanolu o 96 % objemových(4.1).

Zásobní roztoky musí být každý týden čerstvě připraveny.

Zásobní roztok trans-anetholu (koncentrace: 2 g/l)

Do odměrné baňky na 20 ml se odváží 40 mg trans-anetholu (4.2) (nebo 400 mg do odměrné baňky na 200 ml, atd.). Přidá se malé množství ethanolu o 96 % objemových (4.1), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Zásobní roztok vnitřního standardu, např. estragolu (koncentrace: 2 g/l)

Do odměrné baňky na 20 ml se odváží 40 mg estragolu (4.3) (400 mg do odměrné baňky na 200 ml, atd.). Přidá se malé množství ethanolu o 96 % objemových (4.1), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Pro účely rozboru musí být kontrolována linearita odezvy FID, přičemž musí být zohledněn rozsah koncentrací trans-anetholu v lihovinách, který je 0 až 2,5 g/l. Při rozboru se neznámé vzorky lihovin, u nichž má být prováděn rozbor, ředí 10krát (8.3). Pro podmínky rozboru popsané v této metodě se následujícím způsobem připraví zásobní roztoky odpovídající těmto koncentracím trans-anetholu ve vzorku, u něhož má být prováděn rozbor: 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 a 0,25 g/l: do jednotlivých odměrných baněk na 20 ml se pipetou odměří 0,5, 1, 1,5, 2 a 2,5 ml zásobního roztoku A (4.5.1); do každé baňky se pipetou odměří 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Jako roztok o koncentraci 0 g/l se použijí roztoky určené pro slepý pokus (8.4).

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml standardního roztoku A (4.5.1), poté se přidají 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Kapilární plynový chromatograf vybavený plamenově-ionizačním detektorem (FID), integrátorem nebo jiným zařízením pro zpracování dat, které umožňuje měřit plochy píků nebo výšky píků, a automatickým dávkovačem nebo nezbytným zařízením pro ruční nástřik vzorku.

Nástřikový systém split/splitless

Kapilární kolona, například:

• Délka: 50 m

• Vnitřní průměr: 0,32 mm

• Tloušťka filmu: 0,2 μm

• Stacionární fáze: FFAP – zesítěný porézní modifikovaný TPA polyethylenglykol.

Obvyklé laboratorní vybavení: Kalibrované odměrné laboratorní sklo, analytické váhy (přesnost: ±0,1 mg).

Typ kolony, její rozměry a chromatografické podmínky se zvolí tak, aby došlo k oddělení anetholu od vnitřního standardu a od jakýchkoli rušivých látek. Typické podmínky pro kolonu uvedenou jako příklad v bodě 5.3 jsou tyto:

Nosný plyn: helium p. a.

Průtok: 2 ml/min

Teplota nástřiku: 250 °C

Teplota detektoru: 250 °C

Teplotní podmínky pece: isotermní, 180 °C, doba analýzy (běhu) 10 minut

Nastřikovaný objem: 1 μl, dělicí poměr 1: 40.

Vzorky se skladují při laboratorní teplotě, chráněny před světlem a chladem.

Pro ujištění, že vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu, se provede rozbor vzorku bez přídavku jakéhokoli vnitřního standardu. Obsahuje-li vzorek přirozené množství estragolu, musí být zvolen jiný vnitřní standard (například menthol).

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml vzorku, objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml vzorku, poté se přidají 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Před zahájením rozboru se zkontroluje linearita odezvy FID tak, že se třikrát po sobě proměří každý ze standardních roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).

Z hodnot ploch píků nebo výšek píků získaných z integrátoru pro každý nástřik se sestrojí graf závislosti poměru R na koncentraci jejich mateřského roztoku v g/l.

R; = výška nebo plocha píku trans-anetholu dělená výškou nebo plochou píku estragolu.

Měla by být získána lineární závislost.

V dále uvedeném pořadí se provede nástřik roztoku určeného pro slepý pokus (8.3), standardního roztoku C (4.5.4), jednoho ze standardních roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3), který bude sloužit jako vzorek pro řízení jakosti (může být zvolen podle pravděpodobné koncentrace trans-anetholu v neznámém vzorku) a pěti neznámých vzorků (8.2); po každých pěti neznámých vzorcích se nastříkne standard pro kontrolu linearity odezvy (řízení jakosti), aby byla potvrzena stabilita rozboru.

Změří se plochy píků (integrátorem nebo jiným systémem zpracování dat) nebo (ručně) výšky píků trans-anetholu a vnitřních standardů.

Odezvový faktor se vypočte takto:

RF_i = (C_i/(plocha_i nebo výška_i))*((plocha_is nebo výška_is)/C_is)

pri čemer je:

RF_i se vypočte z pěti vzorků roztoku C (4.5.4).

Nastříknou se roztoky pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).

Nastříkne se roztok neznámého vzorku (8.2).

Vzorec pro výpočet koncentrace trans-anetholu zní takto:

c_i=C_is*((plocha_i nebo výška_i)/(plocha_is nebo výška_is))*RF_i

kde:

Koncentrace trans-anetholu se vyjadřuje v gramech na litr na jedno desetinné místo.

Na chromatogramech musí být anethol oddělen od vnitřního standardu a od ostatních rušivých látek. Hodnota RF_i se vypočte z výsledků pro pět po sobě jdoucích nástřiků roztoku C (4.5.4). Leží-li variační koeficient (CV % = (směrodatná odchylka/průměr)*100)) v intervalu ± 1 %, je průměrná hodnota RF_i přijatelná.

Výše uvedený výpočet se použije pro výpočet koncentrace trans-anetholu ve vzorku pro řízení jakosti vybraného z roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).

Nacházejí-li se vypočtené průměrné výsledky z rozboru roztoků pro kontrolu linearity odezvy zvolených jako vzorky pro vnitřní řízení jakosti (IQC) v intervalu ± 2,5 % kolem jejich teoretické hodnoty, lze výsledky neznámých vzorků přijmout.

Extrakce alkoholu z lihovin obsahujících velké množství cukru s cílem umožnit stanovení koncentrace trans-anetholu kapilární plynovou chromatografií.

K alikvotnímu množství vzorku likéru se přidá vnitřní standard v koncentraci, která je srovnatelná s koncentrací analytu (trans-anetholu) v likéru. Poté se přidá fosforečnan sodný dodekahydrát a bezvodý síran amonný. Výsledná směs se dobře protřepe a ochladí, přičemž se vytvoří dvě fáze; horní alkoholová fáze se oddělí. Z této alkoholové fáze se odebere alikvot, který se zředí ethanolem o 45 % objemových (4.4) (Poznámka: na tomto stupni se nepřidává žádný vnitřní standard, neboť již byl přidán). U výsledného roztoku se provádí rozbor plynovou chromatografií.

Při extrakci se používají pouze reakční činidla o čistotě vyšší než 99 %.

Síran amonný bezvodý, (CAS 7783-20-2).

Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát, (CAS 10039-32-4).

Erlenmeyerovy baňky, dělicí nálevky, lednička.

Pro ujištění, že vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu, se provede extrakce roztoku pro slepý pokus (12.6.2) a rozbor se provede bez přídavku jakéhokoli vnitřního standardu. Obsahuje-li vzorek přirozené množství estragolu, musí být zvolen jiný vnitřní standard.

Do Erlenmeyerovy baňky se pipetou odměří 5 ml ethanolu o 96 % objemových (4.1), odváží se 50 mg vnitřního standardu (4.3) a přidá se 50 ml vzorku. Přidá se 12 g bezvodého síranu amonného (12.2.1) a 8,6 g hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu (12.2.2). Erlenmeyerova baňka se uzavře zátkou.

Baňka se alespoň 30 minut protřepává. Může být použita mechanická třepačka, nikoli však teflonové magnetické míchadlo, neboť teflon může adsorbovat malé množství analytu. Je třeba poznamenat, že se přidaná sůl nerozpustí beze zbytku.

Erlenmeyerova baňka uzavřená zátkou se umístí alespoň na dvě hodiny do ledničky (T < 5 °C).

Za tuto dobu se vytvoří dvě oddělené kapalné fáze a pevný zbytek. Alkoholová fáze by měla být čirá; v opačném případě se baňka opět umístí do ledničky, dokud nebude dosaženo úplného oddělení.

Poté, co se alkoholová fáze vyčeří, se opatrně odebere alikvot (např. 10 ml), aniž se poruší vodná fáze, převede se do tmavé ampulky a bezpečně se uzavře.

Extrakt se nechá (12.4.2) temperovat na laboratorní teplotu.

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml temperované alkoholové fáze extrahovaného vzorku, objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Použije se postup uvedený v bodě 8.5.

Výsledky se vypočtou pomocí následujícího vzorce:

C_i = (m_is/V)*(plocha_i/plocha_is)*RF_i

kde:

Výsledky se vyjádří v gramech na litr na jedno desetinné místo.

Použije se postup uvedený výše v bodě 11.

Statistické výsledky mezilaboratorního testu:

v následujících tabulkách jsou uvedeny hodnoty pro anethol.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.

Pastis:

Apastis, neoznačené duplikátyBpastis, neoznačené duplikátyCpastis, neoznačené duplikátyDpastis, neoznačené duplikátyEpastis, jeden vzorekFpastis, jeden vzorek.

Další anýzové lihoviny:

Gouzo, rozdělená úroveň (*)Hanýzová lihovina, neoznačené duplikátyIanýzový likér, duplikátní vzorkyJanýzový likér, duplikátní vzorky.

Tato metoda je vhodná pro stanovení glycyrrhizové kyseliny v anýzových lihovinách vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Podle nařízení (EHS) č. 1576/89 musí lihoviny aromatizované anýzem, které jsou nazývány „pastis“, obsahovat od 0,05 do 0,5 gramů glycyrrhizové kyseliny na litr.

ISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

Koncentrace glycyrrhizové kyseliny se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s UV detekcí. Standardní roztok a zkušební vzorek se zfiltrují a samostatně se přímo nastříknou do systému HPLC.

Při rozboru se použijí pouze reakční činidla čistoty pro HPLC, čistý ethanol a voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.

Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).

Glycyrrhizát amonný, C₄₂H₆₂O₁₆ • NH₄ (amonná sůl glycyrrhizové kyseliny)

(Mol. hmotnost: 839,98) (CAS 53956-04-0): čistota alespoň 90 %

(Mol. hmotnost: glycyrrhizová kyselina 822,94).

Ledová octová kyselina, CH₃COOH, (CAS 64-19-7).

Methanol, CH3OH (CAS 67-56-1).

Příprava 1000 ml při 20 °C:

• ethanol o 96 % objemových (4.1): 521 ml

• voda (2.0): 511 ml.

80 (objemových) dílů vody (2.0)

20 (objemových) dílů octové kyseliny (4.3).

Eluční roztok se nechá pět minut odplynit.

Pokud nebyla použitá voda filtrována přes mikrofiltr, doporučuje se zfiltrovat připravený eluční roztok přes filtr pro organická rozpouštědla s velikostí pórů 0,45 μm nebo menší.

Methanol (4.4).

Všechny standardní roztoky musí být každé dva měsíce čerstvě připraveny.

Do odměrné baňky na 100 ml se s přesností na 0,1 mg odváží 25 mg glycyrrhizátu amonného (4.2). Přidá se malé množství ethanolu o 50 % objemových (4.5) a glycyrrhizát amonný se rozpustí. Po jeho rozpuštění se objem doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5).

Roztok se zfiltruje přes filtr pro organická rozpouštědla.

Pro přípravu zásobního roztoku o koncentraci 1,0 g/l se do odměrné baňky na 100 ml odváží s přesností na 0,1 mg 100 mg glycyrrhizátu amonného. Přidá se malé množství ethanolu o 50 % objemových (4.5) a glycyrrhizát amonný se rozpustí. Po jeho rozpuštění se objem doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5).

Připraví se nejméně čtyři další roztoky s koncentrací glycyrrhizátu amonného 0,05, 0,1, 0,25 a 0,5 g/l: do samostatných odměrných baněk na 100 ml se pipetou odměří 5 ml, 10 ml, 25 ml a 50 ml zásobního roztoku o koncentraci 1,0 g/l. Poté se objem roztoků doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5) a roztoky se důkladně promíchají.

Všechny roztoky se zfiltrují přes filtr pro organická rozpouštědla.

Vysokoúčinný kapalinový chromatograf.

Čerpadlo umožňující s velkou přesností dosáhnout a udržet konstantní nebo programovatelný průtok.

Spektrofotometrický detekční systém s UV detekcí: nastavený na 254 nm.

Systém pro odplynění rozpouštědla.

Integrátor nebo zapisovač s výpočetním zařízením, provozně kompatibilní se zbytkem systému.

Materiál: korozivzdorná ocel nebo sklo

Vnitřní průměr: 4 až 5 mm

Délka: 100 až 250 mm

Stacionární fáze: zesítěný polymerně vázaný oktadecyl (C18) na silikagelu (přednostně sférickém), maximální velikost částic: 5 μm.

Analytické váhy s přesností na 0,1 mg

Odměrné sklo třídy A

Zařízení pro membránovou mikrofiltraci malých objemů.

Eluční charakteristiky: (příklad)

• průtok: 1 ml/min,

• eluční roztok A = 30 %,

• eluční roztok B = 70 %.

Detekce:

• UV = 254 nm.

Podle potřeby se zfiltruje přes filtr pro organická rozpouštědla (průměr pórů: 0,45 μm).

Po ustavení chromatografických podmínek se provede

• nástřik 20 μl referenčního roztoku C (4.7.1),

• nástřik 20 μl roztoku vzorku,

• a oba chromatogramy se porovnají. Píky glycyrrhizové kyseliny se identifikují podle jejich retenčních časů. Změří se jejich plochy (nebo výšky) a z následující rovnice se vypočte koncentrace v g/l na dvě desetinná místa:

kde:

Statistické výsledky mezilaboratorního testu:

v následující tabulce jsou uvedeny hodnoty pro glycyrrhizovou kyselinu.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.

Apastis, neoznačené duplikátyBpastis, rozdělená úroveň (*)Cpastis, neoznačené duplikátyDpastis, neoznačené duplikátyEpastis, neoznačené duplikáty.

Touto metodou lze zjistit, zda jsou v anýzových lihovinách přítomny chalkony. Chalkony jsou přírodní barviva ze skupiny flavonoidů přítomná v kořenu lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra).

Anýzové lihoviny mohou být nazývány „pastis“, pokud obsahují chalkony (podle nařízení (EHS) č. 1576/89).

ISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

Připraví se referenční výtažek lékořice. Přítomnost nebo nepřítomnost chalkonů se zjistí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s UV detekcí.

Při rozboru se použijí pouze činidla čistoty pro HPLC. Použije se ethanol o 96 % objemových. Použije se pouze voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.

Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).

Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8).

Hrubě nadrcené kořeny lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra). Průměrné rozměry podlouhlých částic: délka: 10 až 15 mm, tloušťka: 1 až 3 mm.

Octan sodný, CH3COONa, (CAS 127-09-3).

Ledová octová kyselina, CH3COOH, (CAS 64-19-7).

Příprava 1000 ml při 20 °C:

• ethanol o 96 % objemových (4.1): 521 ml,

• Voda (2.0): 511 ml.

Acetonitril (4.2) čistoty pro HPLC.

Odplynit

Do odměrné baňky se odváží 8,203 g octanu sodného (4.4), přidá se 6,005 g ledové octové kyseliny (4.5) a objem se doplní vodou (2) do 1000 ml.

Odváží se 10 g drceného kořene lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra) (4.3) a vpraví se do destilační baňky s kulatým dnem,

• přidá se 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1),

• vaří se pod zpětným chladičem jednu hodinu,

• zfiltruje se,

• a filtrát se uchová pro pozdější použití.

Zbytek po filtraci extraktu z lékořice se oddělí z filtru

• vpraví se do destilační baňky s kulatým dnem,

• přidá se 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1),

• vaří se pod zpětným chladičem jednu hodinu,

• zfiltruje se. Filtrát se uchová pro pozdější použití.

Extrakce kořene lékořice se provede třikrát po sobě.

Tři filtráty se spojí.

Rozpouštědlová fáze (z filtrátu v bodě 5.4) se odpaří na rotační odparce.

Zbylý extrakt (z úkonu v bodě 5.5) se rozpustí v 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1).

Vysokoúčinný kapalinový chromatograf.

Čerpadlo umožňující dosáhnout a udržet konstantní nebo programovatelný průtok při vysokém tlaku.

Spektrofotometrický detekční systém s UV/Vis detekcí nastavitelný na 254 a 370 nm.

Systém pro odplynění rozpouštědla.

Kolonový termostat nastavitelný na teplotu 40 ± 0,1 °C.

Integrátor nebo zapisovač s výpočetním zařízením, provozně kompatibilní se zbytkem separačního systému.

Materiál: korozivzdorná ocel nebo sklo

Vnitřní průměr: 4 až 5 mm

Stacionární fáze: zesítěný polymerně vázaný oktadecyl (C18) na silikagelu, velikost částic: nejvýše 5 μm (zesítěná fáze).

analytických vah (přesnost: ± 0,1 mg);

destilační aparatury se zpětným chladičem skládající se například:

• z destilační baňky s kulatým dnem na 250 ml s normalizovaným zábrusem,

• zpětného chladiče o délce 30 cm a

• zdroje tepla (pyrogenní reakci destilovaného materiálu musí být zabráněno vhodným prvkem).

Rotační odparka.

Filtrační zařízení (např. Büchnerova nálevka).

Eluční charakteristiky rozpouštědel A (4.6.2) a B (4.6.3):

• gradientová změna z 20/80 (V/V) na 50/50 (V/V) během 15 minut,

• gradientová změna z 50/50 (V/V) na 75/25 (V/V) během pěti minut,

• isokratická eluce při 75/25 (V/V) pět minut,

• stabilizace kolony mezi nástřiky,

• isokratická eluce při 20/80 (V/V) po dobu pěti minut,

Průtok: 1 ml/min.

detektor musí být nastaven na 370 nm pro detekci chalkonů a poté na 254 nm pro detekci glycyrrhizové kyseliny.

změna vlnové délky (z 370 nm na 254 nm) musí být provedena 30 sekund před začátkem eluce píku odpovídajícího glycyrrhizové kyselině.

Zfiltruje se přes filtr pro organická rozpouštědla (průměr pórů: 0,45 μm).

Extrakt se před rozborem zředí ethanolem o 50 % objemových (4.6.1) v poměru jedna ku deseti.

Nastříkne se 20 μl připraveného extraktu z lékořice (7.2). Provede se rozbor za za výše uvedených chromatografických podmínek (6.5).

Nastříkne se 20 μl vzorku (7.1) (vzorek anýzové lihoviny). Provede se rozbor za výše uvedených chromatografických podmínek (6.5).

Oba chromatogramy se porovnají. Oba chromatogramy si musí být velmi podobné v oblasti eluce chalkonů (detekce při 370 nm za výše popsaných podmínek rozboru) (viz obrázek 1).

Výsledky mezilaboratorního testu:

v následující tabulce jsou uvedeny výsledky zjišťování přítomnosti chalkonů v pastisu a v anýzových lihovinách.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.

Apastis, neoznačené duplikátyBpastis, jeden vzorekCpastis, jeden vzorekD„pastis“ (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyE„pastis“ (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyFanýzový likér (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyGanýzový likér (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyHouzo (neobsahující chalkony), jeden vzorekIouzo (neobsahující chalkony), jeden vzorekJanýzová lihovina (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyK„pastis“ (neobsahující chalkony), neoznačené duplikáty.

Ke stanovení celkového obsahu cukru (vyjádřeného jako invertní cukr) v lihovinách, s výjimkou lihovin obsahujících vaječné či mléčné produkty, je použitelná metoda HPLC–RI.

Tato metoda byla validována mezilaboratorní studií pro pastis, destilovaný anis, třešňový likér, crème de (s uvedením názvu ovoce nebo použité suroviny) a crème de cassis v množstvích od 10,86 g/l do 509,7 g/l. Linearita odezvy přístroje však byla prokázána pro rozsah koncentrace od 2,5 g/l do 20,0 g/l.

Tato metoda není určena pro stanovení nízkých hodnot obsahu cukru.

ISO 3696:1987 Jakost vody pro analytické účely – Specifikace a zkušební metody

K určení koncentrace glukózy, fruktózy, sacharózy, maltózy a laktózy v cukerných roztocích se používá vysokoúčinná kapalinová chromatografie.

Tato metoda využívá alkylaminovou stacionární fázi a diferenční refraktometrickou detekci a slouží jako příklad. Jako stacionární fázi je možné použít také aniontoměničové pryskyřice.

Glukóza (CAS 50-99-7), o čistotě alespoň 99 %.

Fruktóza (CAS 57-48-7), o čistotě alespoň 99 %.

Sacharóza (CAS 57-50-1), o čistotě alespoň 99 %.

Laktóza (CAS 5965-66-2), o čistotě alespoň 99 %.

Monohydrát maltózy (CAS 6363-53-7), o čistotě alespoň 99 %.

Čistý acetonitril (CAS 75-05-8) na rozbor pomocí HPLC.

Destilovaná nebo demineralizovaná voda, nejlépe mikrofiltrovaná.

Eluční rozpouštědlo se skládá z:

• 75 objemových částí acetonitrilu (4.6)

• 25 objemových částí destilované vody (4.7)

Před použitím se nechá roztokem po dobu 5–10 minut pomalu procházet helium, aby došlo k odplynění.

Pokud se nepoužívá mikrofiltrovaná voda, je třeba rozpouštědlo přefiltrovat pomocí filtru pro organická rozpouštědla s maximální velikostí pórů 0,45 μm.

Absolutní ethanol (CAS 64-17-5).

Roztok ethanolu (5 % obj.).

Odváží se 2 g každého cukru, který má být analyzován (4.1–4.5), a vzorky se beze ztrát přenesou do odměrné baňky o objemu 100 ml. (Poznámka: 2 g maltózy odpovídá 2,11 g monohydrátu maltózy).

Doplní se roztokem alkoholu o 5 % obj. (4.10) do 100 ml, protřepe se a uchovává při teplotě přibližně + 4 °C. Každý týden se připraví nový zásobní roztok.

Odpovídajícím způsobem se zředí zásobní roztok – 20 g/l (4.11) – roztokem alkoholu o 5 % obj. (4.10), aby se získalo pět standardních pracovních vzorků o hmotnostní koncentraci 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 a 20,0 g/l. Přefiltruje se pomocí filtru s maximální velikostí pórů 0,45 μm (5.3).

Vysokoúčinný kapalinový chromatograf s šesticestným vstřikovacím ventilem a 10 μl smyčkou nebo jiným automatickým nebo manuálním zařízením, které umožňuje spolehlivé dávkování velmi malých objemů.

Čerpací systém umožňující s velkou přesností dosáhnout stálého či programovaného průtoku a udržet jej.

Diferenciální refraktometr.

Integrátor či zapisovač, jehož výkon je kompatibilní s ostatním vybavením.

Předkolona:

Doporučuje se k analytické koloně připojit vhodnou předkolonu.

Kolona (příklad):

Podmínky chromatografie (příklad):

• Eluční rozpouštědlo (4.8.), průtok: 1 ml/minuta.

• Detekce: Diferenční refraktometrie.

Aby byla zajištěna dokonalá stabilita detektoru, měl by být zapnutý po dobu několika hodin před použitím. Referenční část musí být naplněna elučním rozpouštědlem.

Analytické váhy s přesností 0,1 mg.

Filtr na malé objemy s mikromembránou 0,45 μm.

Ihned po obdržení se vzorky umísťují do prostředí s pokojovou teplotou, kde jsou před rozborem uchovávány.

Vzorek se protřepe.

Přefiltruje se pomocí filtru s maximální velikostí pórů 0,45 μm (5.3).

Vstříkne se 10 μl standardních roztoků (4.12.) a vzorků (7.1.2.). Za vhodných podmínek pro chromatografii, například výše popsaných, se provede rozbor.

Pokud je plocha (nebo výška) některého píku vzorku větší než u nejkoncentrovanějšího standardu, příslušný vzorek je třeba zředit destilovanou vodou a zanalyzovat znovu.

Srovnají se chromatogramy získané z rozboru standardního roztoku a z rozboru lihoviny. Podle retenčních časů se určí píky. Změří se plochy (či výšky) píků a metodou vnějšího standardu se vypočítají koncentrace. Zohlední se naředění vzorku.

Výsledkem je součet obsahu sacharózy, maltózy, laktózy, glukózy a fruktózy vyjádřený jako invertní cukr v g/l.

Invertní cukr se vypočítá jako součet všech přítomných monosacharidů a redukujících disacharidů plus stechiometrické množství glukózy a fruktózy vypočítané z přítomné sacharózy.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem [1] [2].

Tabulka 1 Fruktóza, glukóza, maltóza

Tabulka 2 Sacharóza

Tabulka 3 Celkový obsah cukru

(Poznámka: tyto údaje byly vypočítány pro celkový obsah cukru, ne pro invertní cukr definovaný výše v bodu 8.)

Tato metoda je vhodná pro stanovení koncentrace vaječného žloutku v rozsahu od 40 do 250 g/l ve vaječném likéru a v likéru s přídavkem vajec.

ISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

Extrahují se sloučeniny fosforu obsažené ve vaječném žloutku, které jsou rozpustné v ethanolu, a stanoví se fotometricky jako fosfato-molybdenanový komplex.

Redestilovaná voda.

Křemelina.

Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).

15 % roztok octanu hořečnatého (CAS 16674-78-5).

10 % kyselina sírová (CAS 7664-93-9).

1N kyselina sírová.

Roztok dihydrogenfosforečnanu draselného (CAS 778-77-0), KH₂PO₄ o koncentraci 0,16 g/l.

20 g molybdenanu amonného (CAS 12054-85-2), (NH₄)₆Mo₇O₂₄ • 4H₂O se rozpustí ve 400 ml vody při 50 °C;

v jiné nádobě se rozpustí 1 g vanadičnanu amonného (CAS 7803-55-6), NH4VO3, v 300 ml horké vody, roztok se nechá vyhladnout a poté se přidá 140 ml koncentrované kyseliny dusičné (CAS 7697-37-2). Vychladlé roztoky se spojí v odměrné baňce na 1000 ml a objem se doplní po rysku 1000 ml.

Erlenmeyerova baňka na 100 ml

Ultrazvuková lázeň (nebo magnetická míchačka)

Odměrná baňka na 100 ml

Vodní lázeň temperovaná na 20 °C

Filtr (Whatman č. 4 nebo rovnocenný)

Porcelánový (nebo platinový) kelímek

Vroucí vodní lázeň

Topná deska

Muflová pec

Odměrná baňka na 50 ml

Odměrná baňka na 20 ml

Spektrofotometr nastavený na 420 nm

1cm kyveta.

Vzorky se před rozborem uchovávají při laboratorní teplotě.

Do Erlenmeyerovy baňky (5.1) na 100 ml se odváží 10 g vzorku.

Postupně po malých dávkách se přidá 70 ml ethanolu (4.3), přičemž se při každém přídavku intenzivně míchá, a roztok se umístí na 15 minut do ultrazvukové lázně (5.2) (nebo se při laboratorní teplotě míchá 10 minut na magnetické míchačce (5.2)).

Obsah Erlenmeyerovy baňky se převede za současného vyplachování ethanolem (4.3) do odměrné baňky na 100 ml (5.3). Objem se doplní ethanolem (4.3) po rysku a baňka se umístí do vodní lázně temperované na 20 °C (5.4). Objem se doplní po rysku při 20 °C.

Přidá se malé množství křemeliny (4.2) a roztok se zfiltruje (5.5); prvních 20 ml se odstraní.

25 ml filtrátu se převede do porcelánového (nebo platinového) kelímku (5.6). Filtrát se poté musí za přídavku 5 ml 15 % roztoku octanu hořečnatého (4.4) zkoncentrovat opatrným odpařováním na vroucí vodní lázni (5.7).

Kelímky se umístí na topnou desku (5.8) a zahřívají se, dokud se obsah neodpaří právě do sucha.

Zbytek se zpopelní a žíhá v muflové peci (5.9) při 600 °C do bílého popela nejméně jednu a půl hodiny, může se však také žíhat přes noc.

Popel se spolu s oplachovou destilovanou vodou převede pomocí 10 ml 10 % kyseliny sírové (4.5) do odměrné baňky na 50 ml (5.10) a objem se při laboratorní teplotě doplní po rysku destilovanou vodou (4.1). 5ml alikvot tohoto roztoku popela se použije k přípravě roztoku pro stanovení fosforečnanů fotometricky.

Do odměrné baňky na 50 ml (5.10) se odměří 10 ml 10 % kyseliny sírové (4.5) a objem se doplní po rysku destilovanou vodou (4.1).

K 5ml alikvotu tohoto roztoku (7.2.1.1) se v odměrné baňce na 20 ml (5.11) přidá 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní do 20 ml destilovanou vodou (4.1).

Baňka se volně uzavře zátkou, protřepe a zahřívá se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4).

Tímto srovnávacím roztokem se naplní 1cm kyveta (5.13).

K 5ml alikvotu roztoku popela (7.1.8) se v odměrné baňce na 20 ml (5.11) přidá 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní do 20 ml destilovanou vodou (4.1).

Baňka se volně uzavře zátkou, protřepe a zahřívá se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4).

Vznikne žlutý roztok, který se ihned proměří spektrofotometricky (5.12) v 1cm kyvetě (5.13) při 420 nm proti srovnávacímu roztoku (7.2.1.4).

Za účelem sestrojení kalibrační křivky se do odměrných baněk na 20 ml (5.11) obsahujících po 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a jednotlivě 0, 2, 4, 6, 8, 10 ml dihydrogenfosforečnanu draselného (4.7) přidá po 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní po 20ml rysku destilovanou vodou (4.1).

Baňky se volně volně uzavřou zátkou, protřepou se a zahřívají se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4) a proměří se spektrofotometricky (5.12) v 1cm kyvetě (5.13) při 420 nm proti srovnávacímu roztoku (7.2.1.4).

Obsah vaječného žloutku v g/l se vypočte pomocí tohoto vzorce:

kde:

Statistické výsledky mezilaboratorního testu:

v následující tabulce jsou uvedeny hodnoty pro vaječný žloutek.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.

AAdvocaat, neoznačené duplikátyBAdvocaat, neoznačené duplikátyCAdvocaat, neoznačené duplikátyDAdvocaat (zředěný), rozdělená úroveň (*)EAdvocaat, neoznačené duplikáty

Tato metoda umožňuje pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie stanovit furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanilin, syringaldehyd, koniferaldehyd, sinapaldehyd, kyselinu gallovou, kyselinu ellagovou, kyselinu vanilovou, kyselinu syringovou a skopoletin.

Analytická metoda uznaná valným shromážděním Mezinárodní organizace pro révu a víno (OIV) a zveřejněná touto organizací pod číslem OIV-MA-BS-16: R2009.

Stanovení pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a detekce ultrafialovou spektrofotometrií na několika vlnových délkách a spektrofluorimetrií.

Reakční činidla musí mít analytickou jakost. Je třeba použít destilovanou vodu nebo vodu přinejmenším srovnatelné čistoty. Doporučuje se použít mikrofiltrovanou vodu s měrným odporem 18,2 ΜΩ.cm.

Roztok alkoholu o 96 % obj.

Methanol jakosti vhodné pro metodu HPLC (rozpouštědlo B).

Kyselina octová o koncentraci 0,5 % obj. (Rozpouštědlo A).

Mobilní fáze: (pouze jako příklad).

Rozpouštědlo A (0,5 % kyselina octová) a rozpouštědlo B (čistý methanol). Přefiltrujte přes membránu (porozita 0,45 μm). Pokud nutno, odplyňte v ultrazvukové lázni.

Referenční standardy o minimálně o 99 % čistotě: furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanilin, syringaldehyd, koniferaldehyd, sinapaldehyd, kyselina gallová, kyselina ellagová, kyselina vanilová, kyselina syringová a skopoletin.

Referenční roztok: standardní látky jsou rozpuštěny v 50 % obj. roztoku alkoholu a vody. Výsledné koncentrace v referenčním roztoku by měly být řádově:

furfural: 5 mg/l; 5-hydroxymethyl furfural: 10 mg/l; 5-methylfurfural 2 mg/l; vanilin: 5 mg/l; syringaldehyd: 10 mg/l; koniferaldehyd: 5 mg/l; sinapaldehyd: 5 mg/l; kyselina gallová: 10 mg/l; kyselina ellagová: 10 mg/l; kyselina vanilová: 5 mg/l; kyselina syringová: 5 mg/l; skopoletin: 0,5 mg/l.

Vysoce účinný kapalinový chromatograf podporující binární gradient, který obsahuje:

Stříkačky na vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC).

Zařízení na membránovou filtraci malých objemů.

Integrátor či zapisovač, jehož výkon je kompatibilní s celou aparaturou; především musí mít několik přijímacích kanálů.

V případě potřeby jsou referenční roztok a lihovina přefiltrovány přes membránu s póry o průměru nejvýše 0,45 μm.

Podmínky pro provedení chromatografie: provede se rozbor při teplotě okolního prostředí pomocí vybavení popsaného v bodě 5.1 a za použití mobilních fází (4.4) s průtokem přibližně 0,6 ml za minutu podle níže uvedeného gradientu (pouze jako příklad).

Čas: 0 min. 50 min. 70 min. 90 min.

rozpouštědlo A (voda–kyselina): 100 % 60 % 100 % 100 %

rozpouštědlo B (methanol) 0 % 40 % 0 % 0 %

Je třeba mít na paměti, že v některých případech je třeba gradient upravit, aby nedošlo ke koeluci.

Referenční standardy se vstříknou odděleně, poté smíchané.

Provozní podmínky se upraví tak, aby separační faktor píků všech sloučenin byl přinejmenším 1.

Vzorek připravený v bodě 6.1 se vstříkne do aparatury.

Změří se plocha píků pro referenční roztoky a lihoviny a vypočítají se koncentrace.

Koncentrace každé složky se vyjádří v mg/l.

Následující údaje byly získány v roce 2009 při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody, který zkoumal množství lihovin a byl prováděn mezinárodně dohodnutým postupem [1] [2].

Stanovení obsahu ¹⁴C v ethanolu umožňuje rozlišit alkohol získaný z fosilních pohonných hmot (syntetický alkohol) a alkohol ze současných surovin (fermentační alkohol).

Obsah ¹⁴C v ethanolu se považuje za obsah ¹⁴C stanovený zde popsanou metodou nebo metodou popsanou v normě EN 16640, metoda C.

Přirozený obsah ¹⁴C v atmosféře (referenční hodnota), která je absorbována živou vegetací prostřednictvím asimilace, není konstantní hodnotou. Referenční hodnota se v ethanolu proto určuje ze surovin získaných v posledním vegetačním období. Tato roční referenční hodnota se stanoví podle normy EN 16640. Lze však přijmout i jinou referenční hodnotu, je-li certifikována akreditovaným subjektem.

Obsah ¹⁴C ve vzorku obsahujícím ethanol o nejméně 85 % hmotnostních se zjišťuje přímým odčítáním scintilace roztoku.

5,0 g 2,5-difenyloxazolu (PPO)

0,5 g p-bis-[4-methyl-5-fenyloxazolyl(2)]-benzenu (dimethyl-POPOPu) v jednom litru toluenu analytického stupně jakosti.

Mohou se též použít hotové obchodní toluenové scintilátory téhož složení.

n-hexadekanový ¹⁴C s aktivitou kolem 1 × 10⁶ dpm/g (přibližně 1,67 × 10⁶ cBq/g) a se zaručenou přesností určené aktivity ± 2 % rel.

Syntetický alkohol ze surovin fosilního původu obsahující alespoň 85 % hmotnostních ethanolu pro určení pozadí.

Přístroje musí být seřízeny podle pokynů výrobce. Podmínky pro měření jsou optimální, když hodnota indexu jakosti E₂/B dosahuje svého maxima.

E = účinnost,

B = pozadí.

Optimalizovány jsou jen dva měřicí kanály. Třetí je ponechán plně otevřený pro účely kontroly.

Každá z většího počtu počítacích trubic, než který bude později potřebný, se naplní 10 ml syntetického ethanolu neobsahujícího ¹⁴C a 10 ml toluenového scintilátoru. Každá trubice se měří po dobu nejméně 4 cykly × 100 minut. Trubice, jejichž pozadí se liší o více než ± 1 % rel. od průměru, se vyloučí. Mohou se použít jen nové trubice z továrny a ze stejné šarže.

Během procesu nastavování kanálů (bod 6.1) se ESCS určuje pomocí vhodného počítačového programu, kde se stanoví účinnost. Jako vnější standard se používá ¹³⁷cesium, které již vestavěl výrobce.

Je možné měřit vzorky o obsahu ethanolu nejméně 85 % hmotnostních a bez nečistot, které absorbují vlnové délky kratší než 450 nm. Malý zbytek esterů a aldehydů není na závadu. Předem se stanoví obsah alkoholu ve vzorku s přibližnou hodnotou 0,1 %.

10 ml každého ze vzorků připravených podle bodu 6.4 se napipetuje do vybrané počítací trubice se zkontrolovaným pozadím a pomocí automatického dávkovacího zařízení se přidá 10 ml toluenového scintilátoru. Vzorky v trubicích se vhodnými rotačními pohyby homogenizují; nesmí se připustit, aby kapalina navlhčila polyethylenovou vložku ve šroubovacím uzávěru. Stejným způsobem se připravuje trubice obsahující fosilní ethanol bez ¹⁴C k měření pozadí. Pro kontrolu příslušné každoroční hodnoty ¹⁴C se připravuje duplikát ze současného ethanolu získaného z posledního vegetačního období, přičemž se obsah trubice směšuje s vnitřním standardem podle bodu 8.

Kontrolní vzorek a vzorek pro určení pozadí se umístí na počátek měřicí série, která obsahuje nejvýše 10 vzorků pro rozbor. Celková doba měření na vzorek činí nejméně 2 × 100 minut, přičemž se jednotlivé vzorky měří v dílčích 100minutových etapách, tak aby se žádné zařízení neposunulo, nebo se neprojevil jiný vliv. (Jeden cyklus tedy odpovídá měřicímu intervalu 100 minut na vzorek).

Vzorek pro měření pozadí a kontrolní vzorek se musí připravovat jako čerstvé každé čtyři týdny.

V případě vzorků se slabou absorbancí (s ESCR kolem 1,8) změna této hodnoty jen bezvýznamně ovlivňuje účinnost. Pokud se změna nachází v pásmu ± 5 % rel., lze očekávat stejnou účinnost. U vzorků se silnější absorbancí, jako jsou denaturované alkoholy, je možné účinnost zabezpečit pomocí korekčního grafu. Není-li k dispozici vhodný počítačový program, je nutné použít vnitřní standard, tato metoda pak poskytuje jednoznačný výsledek.

Každý kontrolní vzorek, vzorek pro měření pozadí (současný a fosilní ethanol) a neznámý materiál jsou měřeny dvojmo. Jeden vzorek duplikátu se připravuje v nevybrané trubici a jako vnitřní standard se k němu přidává přesně dávkované množství (30 ml) hexadekanu ¹⁴C (přidaná aktivita činí kolem 26269 dpm/gC, tedy přibližně 43782 cBq/gC). Příprava vzorku a doba měření jsou popsány v bodě 7.2, avšak doby měření vzorků obsahujících vnitřní standard je možné zkrátit asi o pět minut přednastavením asi 10⁵ pulzů. V jedné měřicí sérii se používá jeden duplikát každého ze vzorků pro měření pozadí a každého z kontrolních vzorků; tyto se umisťují na začátek měřicí série.

Aby se zabránilo znečištění vnitřním standardem při měření, je nutné standard skladovat a manipulovat s ním mimo prostor, kde se připravují a měří vzorky pro rozbor. Po měření je možné opětovně použít trubice kontrolované z hlediska pozadí. Šroubovací uzávěry a trubice obsahující vnitřní standard se odstraní.

Míra specifické radioaktivity se vyjadřuje v becquerelech na jeden gram uhlíku = Bq/gC.

Pro získání praktičtějších výsledků se tyto výsledky vyjádří v centibequerelech = cBq/gC.

V současné době je možné uplatnit popisy a vzorce používané v literatuře, které vycházejí z dpm. Za účelem získání odpovídajících hodnot v cBq stačí hodnoty uvedené v dpm vynásobit zlomkem 100/60.

r = 0,632 cBq/gC; S_(r) = ± 0,223 cBq/g C

R = 0,821 cBq/gC; S₍R₎ = ± 0,290 cBq/g C.