V Bruselu dne 12. června 2006.

Za Komisi

Markos Kyprianou

člen Komise

PŘÍLOHA I SCHÉMA TESTU PRO DIAGNÓZU, ZJIŠTĚNÍ A IDENTIFIKACI BAKTERIÁLNÍ KROUŽKOVITOSTI BRAMBORU, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. subsp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al. OBLAST PŮSOBNOSTI SCHÉMATU TESTU

OBECNÉ ZÁSADY

Předložené schéma popisuje různé postupy, které jsou součástí:

Optimalizované protokoly pro různé metody, validovaná činidla a podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku 1.

Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a budou zahrnovat použití životaschopných kultur C. m. subsp. sepedonicus jako kontrolních materiálů, bude nutné provádět postupy za vhodných karanténních podmínek s odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek příslušných povolení vydaných úředními orgány pro karanténu rostlin.

Testovací parametry musí zajistit stálé a reprodukovatelné zjištění úrovní C. m. subsp. sepedonicus jako stanovené prahy vybraných metod.

Zcela nezbytná je přesná příprava pozitivních kontrol.

Testování podle požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení, údržbu a kalibraci zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich uchovávání a všechna opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky, např. oddělení pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být uplatněno standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním a jiným chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.

Podezření z výskytu, jak je uvedeno v čl. 4 odst. 2 směrnice 93/85/EHS, naznačuje pozitivní výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech.

Pokud je první screeningový test (IF nebo PCR/FISH) pozitivní, existuje podezření na infekci Cms a musí být proveden druhý screeningový test. Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je podezření potvrzeno (podezření z výskytu) a musí se pokračovat v testování podle daného schématu. Pokud je druhý screeningový test negativní, pak vzorek není považován za infikovaný Cms.

Z toho důvodu je pozitivní IF test podle čl. 4 odst. 2 definován jako pozitivní výsledek IF testu potvrzený druhým screeningovým testem (PCR/FISH).

Potvrzená přítomnost podle čl. 5 odst. 1 směrnice 93/85/EHS vyžaduje izolaci a identifikaci čisté kultury C. m. subsp. sepedonicus s potvrzením patogenity.

Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z výskytu nebo typickými příznaky kroužkovitosti. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogenu z infikovaného vodivého pletiva na diagnostickém médiu a v případě pozitivního výsledku identifikaci kultury C. m. subsp. sepedonicus.

Postup testování je určen ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek z nejméně dvou screeningových testů, z nichž každý je založen na jiném biologickém principu, musí být doplněn izolací patogenu, a následně, v případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je C. m. subsp. sepedonicus. Pozitivní výsledek pouze jednoho screeningového testu není dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý.

Screeningové testy a izolační testy musí umožnit detekční práh 10³ až 10⁴ buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.

V evropských klimatických podmínkách se příznaky na poli zjistí jen zřídkakdy a často pak až na konci sezóny. Kromě toho jsou příznaky skryté nebo se zamění s příznaky jiných chorob, stáří nebo mechanických poškození. Proto mohou být příznaky při kontrole na poli snadno přehlédnuty. Příznaky vadnutí jsou velmi odlišné od příznaků hnědé hniloby; vadnutí je obvykle pomalé a zpočátku omezené na okraje listů. Mladé infikované listy často i přes infekci nadále rostou, i když růst v infikovaných místech je omezený. Tím vznikají neobvykle tvarované listy. Listy postižené ucpáním vodivých pletiv na spodní části stonku často mají chlorotické, žluté až oranžové mezižeberní partie. Infikované děložní lístky, listy a dokonce stonky mohou eventuálně odumřít. Často jsou listy a hlízy pouze menší. Příležitostně jsou rostliny zakrnělé. Barevné snímky řady příznaků naleznete na internetové stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Nejranějšími příznaky jsou slabá sklovitost nebo průsvitnost pletiva bez měknutí v okolí cévního systému, zejména blízko pupku. Prstenec svazků cévních na pupkovém konci hlízy může mít nepatrně tmavší zbarvení než obvykle. Prvním dobře identifikovaným příznakem je žlutavé zabarvení prstence cévních svazků a stav, kdy při jemném zmáčknutí hlízy vystupují z cév sloupky sýrové hmoty. Tento exsudát obsahuje miliony bakterií. Vodivá pletiva mohou zhnědnout a příznaky na hlízách jsou v tomto stádiu podobné příznakům hnědé hniloby způsobené Ralstonia solanacearum. Zpočátku mohou být tyto příznaky omezeny na jednu část prstence, nemusí se vyskytovat jen blízko pupkové části a mohou se postupně šířit na celý prstenec. S postupem infekce dochází k destrukci vodivých pletiv: vnější korová část se může oddělit od vnitřní korové části. V pokročilých stadiích infekce se objevují na povrchu hlízy praskliny, často s červenohnědými okraji. V poslední době se v Evropě objevilo několik případů, kdy střední kůra hnije s prstencem svazků cévních, čímž dochází k druhotnému poškození s vznikem vnitřních dutin a nekrózy. Druhotná houbová nebo bakteriální infekce může příznaky maskovat a může být obtížné, ne-li nemožné, rozlišit pokročilé příznaky kroužkovitosti od jiných hnilob bramboru. Možné jsou i atypické příznaky. Barevné snímky řady příznaků naleznete na internetové stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

• Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na 1 test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup však lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dispozici menší množství hlíz.

• Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.

• Níže popsaný bramborový extrakt lze použít také pro zjištění původce hnědé hniloby, Ralstonia solanacearum.

Nepovinné ošetření před přípravou vzorku:

Omyjte hlízy. Použijte vhodné dezinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění možné patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Nechte hlízy oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je obzvlášť užitečný (není však vyžadován) pro vzorky v případě, že je ve vzorku příliš zeminy a jestliže se má provádět PCR test nebo přímá izolace.

Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nože na zeleninu odstraňte slupku na pupkovém konci každé hlízy. Opatrně vyřízněte malé výkrojky vodivého pletiva z pupkové části a množství pletiva nezahrnující cévní svazky omezte na minimum (viz internetovou stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Všechny hlízy s podezřelými příznaky bakteriální kroužkovitosti dejte stranou a testujte odděleně.

Pokud jsou při vyříznutí výkrojku z pupkového konce zjištěny příznaky podezření z kroužkovitosti, mělo by se provést vizuální vyšetření této hlízy po naříznutí hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky by měly korkovatět po dobu 2 dnů při pokojové teplotě a měly by být uchovávány v karanténě (při v 4–10 °C) až do ukončení všech testů. Všechny hlízy ve vzorku (včetně hlíz s podezřelými příznaky) by měly být uchovány podle přílohy II.

Shromážděte výkrojky z pupkové části do nepoužitých nádob na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že jsou nádoby znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě, pokud to není možné, uchovávejte je v nádobě bez přidání pufru, v chladu po dobu maximálně 72 hodin nebo při pokojové teplotě maximálně 24 hodin. Schnutí a suberizace výkrojků a růst saprofytů v průběhu skladování může bránit zjištění přítomnosti bakterie způsobující kroužkovitost.

Zpracujte výkrojky z pupkového konce jedním z následujících postupů:

Při homogenizaci vzorků za použití mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Učiňte bezpečnostní opatření pro zamezení vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakce. Zajistěte, aby pro každý vzorek bylo použito čerstvě sterilizované ostří (nože) a nádoby. Pokud má být použit PCR test, zamezte přenosu DNA na nádoby nebo mlecí zařízení. Pokud má být použit PCR test, doporučuje se drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavky na jedno použití.

Dekantujte supernatant. Pokud je nadměrně zakalený, pročistěte jej buď pomalým odstředěním (při maximálně 180 g po dobu 10 minut při teplotě mezi 4–10 °C) nebo vakuovou filtrací (40–100 µm), filtr omyjte přídavkem (10 ml) extrakčního pufru (dodatek 3).

Zahustěte bakteriální frakci odstřeďováním při 7000 g po dobu 15 minut (nebo 10000 g po dobu 10 minut) při teplotě mezi 4–10 °C a odstraňte supernatant, aniž by se rozvířila peleta.

Resuspendujte peletu v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 3). Použijte 500 µl pro test na C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl pro Ralstonia solanacearum a 500 µl pro referenční účely. Přidejte sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10–25 % (v/v) k 500 µl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchejte vířením a uložte při teplotě –16 až –24 °C (týdny) nebo při teplotě -68 až –86 ° C (měsíce). Extrakty uchovávejte během testování při teplotě 4–10 °C.

Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.

Pokud je nutný transport extraktu, zajistěte přepravu v chladícím boxu do 24 až 48 hodin.

Je nezbytně nutné, aby se se všemi pozitivními kontrolami a vzorky C. m. subsp. sepedonicus zacházelo odděleně, aby se předešlo kontaminaci. To platí i pro sklíčka na IF testy a všechny testy.

Pro zjištění latentních populací C. m. subsp. sepedonicus se doporučuje kontrola kombinovaných vzorků. Postup je vhodný pro kombinované vzorky až 200 částí stonků. (Pokud se provádí podrobné průzkumy, měly by být založeny na statisticky reprezentativním vzorku rostlinné populace, která je předmětem vyšetřování.)

Pomocí čistého dezinfikovaného nože nebo zahradnických nůžek odstraňte část o velikosti 1–2 cm ze spodní strany každého stonku přímo nad povrchem země.

Části stonků krátce dezinfikujte etanolem 70 % a okamžitě osušte savým papírem.

Shromažďujte části stonků v uzavření sterilní nádobě podle následujících postupů vzorkování:

Zpracujte části stonků jedním z následujících postupů:

• a) buďto zalijte části dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3) a třepejte v rotační třepačce (50–100 ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16–24 hodin chlazené,

  anebo

• b) okamžitě zpracujte rozdrcením částí v pevném maceračním sáčku (např. Stomacher nebo Bioreba) s přiměřeným množstvím extrakčního pufru (dodatek 3) za použití gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex). Pokud to není možné, skladujte části stonků v chladu maximálně 72 hodin nebo maximálně 24 hodin při pokojové teplotě.

Po usazení, které má trvat 15 minut, dekantujte supernatant.

Další purifikace extraktu nebo koncentrace bakteriální frakce obvykle není nutná, ale lze ji dosáhnout filtrací a/nebo odstředěním podle popisu v oddílu 3.1.4–3.1.6.

Rozdělte čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt na 2 stejné části. Jednu polovinu udržujte během testování při teplotě 4–10 °C a druhou polovinu skladujte s 10–25 % (v/v) sterilního glycerolu při teplotě –16 až –24 °C (týdny) nebo při teplotě –68 až –86 °C (měsíce), pokud je nutné další testování.

Doporučuje se použít IF test jako hlavní screeningový test, protože byla prokázána jeho schopnost dosáhnout požadovaných prahů.

Použije-li se jako hlavní vyšetřovací test IF test a jeho výsledek je pozitivní, musí být jako druhý vyšetřovací test proveden test PCR nebo FISH. Jestliže se test IF použije jako druhý screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, je pro dokončení analýzy nutné další testování podle postupového diagramu.

Pokud je IF test používán jako hlavní vyšetřovací test, používejte vždy polyklonální protilátku. V případě pozitivního výsledku IF testu s polyklonální protilátkou může být další vyšetření vzorku s monoklonální protilátkou přesnější, ale méně citlivé.

Používejte protilátky proti referenčnímu kmeni C. m. subsp. sepedonicus. Doporučuje se určovat titr pro každou novou řadu protilátek. Titr je stanoven jako nejvyšší ředění, při kterém dochází k optimální reakci při testování suspenze obsahující 10⁵ až 10⁶ buněk na 1 ml homologického kmene C. m. subsp. sepedonicus a při použití vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Nezpracované polyklonální nebo monoklonální protilátky by měly mít IF titr alespoň 1:2000. Během testu by se měly protilátky používat v pracovním ředění (WD) v blízkosti titru nebo na titru. Používejte validované protilátky (viz internetovou stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Test by měl být prováděn na čerstvě připravených vzorkových extraktech. V případě potřeby může být úspěšně proveden na extraktech skladovaných při –68 až –86 °C v glycerolu. Glycerol lze ze vzorku odstranit přidáním 1 ml peletového pufru (dodatek 4), opětovným odstředěním po dobu 15 minut při 7000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. To často není nutné, zejména pokud jsou sklíčka se vzorky fixována plamenem (viz 2.2).

Připravte oddělené pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo s jiným srovnávacím kmenem C. m. subsp. sepedonicus, suspendovaném ve výluhu z brambor podle dodatku 2, a nepovinně v pufru.

Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě –16 až –24 °C) by se mělo podle možnosti použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.

Jako negativní kontroly použijte alikvotní části vzorkových extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Používejte mikroskopická sklíčka s více okénky, nejlépe s 10 okénky o průměru nejméně 6 mm.

Proveďte test kontrolního materiálu stejným způsobem jako test vzorku (vzorků).

Připravte sklíčka na test jedním z následujících postupů:

• i) Pro pelety s relativně nízkým množstvím škrobového sedimentu:

  Napipetujte měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 µl – pro větší okénka objem zvyšte) roztoku resuspendované bramborové pelety 1/100 do prvního okénka. Následně napipetujte stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 1.

• ii) Pro jiné pelety:

  Připravte desetinná ředění (1/10 a 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetujte měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 µl – pro větší okénka objem zvyšte) resuspendované pelety 1/100 a každého roztoku do řady okének. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 2.

Vysušte kapky při pokojové teplotě nebo zahřátím na teplotu 40 až 45 °C. Fixujte bakteriální buňky na sklíčko buď zahřátím (15 minut při teplotě 60 °C) nad plamenem pomocí 95 % etanolu nebo podle zvláštních pokynů dodavatelů protilátek.

V případě potřeby lze potom fixovaná sklíčka před dalším použitím skladovat zmrazená v suchém boxu po co možná nejkratší dobu (maximálně 3 měsíce).

Postup IF testu:

• i) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. i):

  Připravte sadu dvojnásobných roztoků protilátky v IF pufru. V první jamce by měl být titr 1/2 (T/2), v ostatních titr 1/4 (T/4), titr 1/2 (T/2), titr (T) a dvojnásobný titr (2T).

• ii) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. ii):

  Připravte pracovní ředění (WD) protilátky v IF pufru. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.

Obrázek 1. Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1 písm. i) a oddílu 4.3 písm. i)

Obrázek 2. Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1 písm. ii) a oddílu 4.3 písm. ii)

Uspořádejte podložní sklíčka na navlhčený papír. Pokryjte každé testovací okénko kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.

Pokud nemáte konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, řiďte se následujícím postupem:

Podložní sklíčka inkubujte na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18–25 °C).

Setřeste kapky ze všech podložních sklíček a pečlivě opláchněte pufrem IF. Umyjte ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 3) a následně v pufru IF. Zabraňte vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci. Pečlivě odstraňte přebytečnou vlhkost jemným osušením.

Umístěte sklíčka na vlhký papír. Testovací okénka pokryjte ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.

Inkubujte sklíčka zakrytá na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18–25 °C).

Setřeste kapky konjugátu ze sklíčka. Opláchněte a umyjte jako předtím (4.3.3).

Opatrně odstraňte přebytečnou vlhkost.

Napipetujte 5–10 µl 0,1M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 3) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiložte krycí sklíčko.

Vyhodnocení IF testu:

Prohlížejte testovací sklíčka epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při zvětšení 500x až 1000x. Zkoumejte okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk zkoumejte nejméně 40 polí mikroskopu.

Nejdřív zkontrolujte pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovnímu ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (oddíl 4).

Pozorujte jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií C. m. subsp. sepedonicus v testovacích okéncích sklíčka (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu.

Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

Existuje několik problémů podstatných pro přesnost imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou C. m. subsp. sepedonicus.

Uvažujte pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 4.3.

Interpretace výsledku IF testu:

• i) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií odhadněte průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítejte počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4).

  Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně 5 × 10³. Vzorek je považován za potenciálně infikovaný a je povinné další testování.

• ii) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než 5 × 10³ buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.

Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný vyšetřovací test proveden IF test. Když se FISH test provede jako druhý screeningový test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.

Používejte validované oligosondy specifické pro C. m. subsp. sepedonicus (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 10³–10⁴ buněk C. m. subsp. sepedonicus na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.

Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě –16 až –24 nebo –68 až –86 °C.

Jako negativní kontroly používejte alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na C. m. subsp. sepedonicus s negativním výsledkem.

Jako pozitivní kontroly připravte suspenzi obsahující 10⁵ až 10⁶ buněk C. m. subsp. sepedonicus na ml (např. kmen NCPPB 4053 nebo PD 406) v 0,01 M fosfátového pufru (PB) z 3–5denní kultury (příprava viz dodatek 2). Připravte samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmene nebo jiného referenčního kmene C. m. subsp. sepedonicus suspendovaného v bramborovém extraktu podle dodatku 2.

Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.

Proveďte test kontrolního materiálu stejným způsobem jako u vzorku/ů.

Následující protokol vychází z Wullings a kol. (1998):

Připravte fixační roztok (viz dodatek 7).

Napipetujte 100 µl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďujte po dobu 8 minut na 7000 g.

Odstraňte supernatant a rozpusťte peletu v 500 µl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepejte a inkubujte přes noc při teplotě 4 °C.

Alternativním fixačním činidlem je 96 % etanol. Pro jeho použití rozpusťte peletu z kroku 5.1.2 v 50 μl 0,01 M PB a 50 μl 96 % etanolu. Promíchejte protřepáním a inkubujte při teplotě 4 °C po dobu 30–60 minut.

Odstřeďujte po dobu 8 minut na 7000 g, odstraňte supernatant a resuspendujte peletu v 75 µl 0,01 M PB (viz dodatek 3).

Kápněte 16 µl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 3, přičemž použijete 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 µl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49 µl) může být uložen při teplotě –20 °C po přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraňte etanol odstředěním a přidejte stejné množství 0,01 M PB (zamíchejte protřepáním).

Obrázek 3. Rozmístění na sklíčku FISH

Nechte sklíčka uschnout na vzduchu (nebo sušičkou sklíček při teplotě 37 °C) a fixujte nad plamenem.

V této fázi je možné postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.

Připravte roztok lyzozymu obsahující 10 mg lyzozymu (Sigma L-6876) v 10 ml pufru (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Tento roztok lze skladovat, ale měl by se pouze jednou zmrazit a nechat roztát. Každý vzorek dobře pokryjte přibližně 50 μl roztoku lyzozymu a inkubujte po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Potom ponořte sklíčka do demineralizované vody, pouze jednou, a osušte filtračním papírem.

Alternativně přidejte místo lyzozymu 50 μl proteinázy K 40–400 μg.ml^–1 v pufru (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl₂, pH 7,4) do každé jamky a inkubujte při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.

Sušte buňky ve stupňovaných sériích 50 %, 80 % a 96 % etanolu pokaždé po dobu 1 minuty. Nechte sklíčka uschnout na vzduchu v držáku sklíček.

Připravte vlhkou inkubační komoru zakrytím dna vzduchotěsné krabice tkaninou nebo filtračním papírem namočeným v 1x hybmixu (dodatek 7). Předinkubujte krabici v hybridizační peci při teplotě 55 °C po dobu alespoň 10 minut.

Připravte hybridizační roztok (dodatek 7) s 45 μl na 1 sklíčko a předinkubujte po dobu 5 minut při teplotě 55 °C.

Umístěte sklíčka na horkou plotnu při teplotě 45 °C a přidejte do každého ze 4 okének na sklíčku/sklíčcích 10 μl hybridizačního roztoku.

Přikryjte každé sklíčko 2 krycími sklíčky (24 × 24 mm) tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Umístěte sklíčka do předehřáté vlhké komory a hybridizujte přes noc v peci při teplotě 55 °C v temnu.

Připravte 3 kádinky obsahující 1 l sterilní vody (Ultra pure water = UPW), 1 l 1x hybmixu (334 ml 3x hybmix a 666 ml UPW) a 1 l 1/2x hybmixu (167 ml 3x hybmix a 833 ml UPW). Předinkubujte každou z nich ve vodní lázni při teplotě 55 °C.

Sejměte krycí sklíčka a umístěte podložní sklíčka do držáku sklíček.

Spláchněte nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1x hybmixem při teplotě 55 °C.

Přemístěte držák sklíček do promývacího roztoku 1/2 hybmix a nechte inkubovat dalších 15 minut.

Ponořte sklíčka krátce do UPW a položte je na filtrační papír. Odstraňte nadbytečnou vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním papírem. Napipetujte 5–10 μl krycího roztoku (např. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každé jamky a celé sklíčko zakryjte velkým krycím sklíčkem (24 × 60 mm).

Prohlížejte sklíčka ihned s mikroskopem vhodným pro epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630x nebo 1000x pod olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou eubakteriální buňky (včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky C. m. subsp. sepedonicus obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnejte buněčnou morfologii s morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (oddíl 9.4) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlížejte okénka napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, pozorujte nejméně 40 polí mikroskopu.

Hledejte jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou pro C. m. subsp. sepedonicus v okénkách testovacích sklíček (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují slabou fluorescenci, neberte v úvahu.

Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.

Existuje několik problémů podstatných pro přesnost FISH testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou se vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou C. m. subsp. sepedonicus, ačkoli mnohem méně často než u IF testu.

V úvahu bereme pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií, viz 5.3.2.

Interpretace výsledku testu FISH:

• i) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro C. m. subsp. sepedonicus a při použití rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadněte průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítejte počet typických buněk v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň 5 × 10³ typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za pravděpodobně infikované Cms. Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než 5 × 10³ typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za negativní.
• ii) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro C. m. subsp. sepedonicus, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.

Použije-li se PCR test jako hlavní screeningový test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Pokud se PCR test používá jako druhý screeningový test a je pozitivní, je pro dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.

Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10³ až 10⁴ buněk C. m. subsp. sepedonicus na 1 ml přidaných do vzorku extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem. Pro dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích můžou být vyžadovány optimalizační pokusy.

Používejte validovaná PCR činidla a protokoly. Dávejte přednost metodě s interní kontrolou.

Používejte vhodná bezpečnostní opatření, abyste zabránili kontaminaci vzorku cílovou DNA. PCR test by měli provádět zkušení laboranti v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.

S negativními kontrolami (u průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.

PRC test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:

• extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na C. m. subsp. sepedonicus s negativním výsledkem,

• kontroly pufru používaného pro extrakci bakterie a DNA ze vzorku,

• reakční směs PCR.

Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:

• alikvotní části resuspendovaných pelet, k nimž byl přidán C. m. subsp. sepedonicus (příprava viz dodatek 2),

• suspenze 10⁶ buněk na 1 ml C. m. subsp. sepedonicus ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 2140 nebo NCPPB 4053),

• pokud možno používejte při provádění PCR testu také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.

Abyste zabránili možné kontaminaci, připravte pozitivní kontroly v odděleném prostředí než vzorky, které budou testovány.

Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.

Používejte výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky.

Připravte kontrolní materiál stejným způsobem jako vzorek (vzorky).

K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR dispozici a jiných enzymatických reakcí a koncentrující cílovou DNA v extraktu vzorku.

Následující metoda byla optimalizována pro použití s validovanou metodou PCR, uvedenou v dodatku 6.

• 1. Napipetujte 220 µl lýzového pufru (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do mikrozkumavky o objemu 1,5 ml.
• 2. Přidejte 100 µl vzorkového extrakt ze vzorku a umístěte do termobloku nebo vodní lázně o teplotě 95 °C na dobu 10 minut.
• 3. Vložte mikrozkumavku na 5 min. do ledu.
• 4. Přidejte 80 µl zásobního roztoku lyzozymu (50 mg lyzozymu na 1 ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubujte při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.
• 5. Přidejte 220 µl Easy DNA^® roztok A (Invitrogen), dobře promíchejte třepáním a inkubujte při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.
• 6. Přidejte 100 µl Easy DNA^® roztok B (Invitrogen), silně míchejte třepáním, až usazenina sama poteče do mikrozkumavky a vzorek začne být stejnoměrně viskózní.
• 11. Odstřeďujte na 15000 g po dobu 20 minut při 4 °C a odstraňte z pelety etanol.
• 12. Přidejte 500 µl 80 % etanolu (–20 °C) a promíchejte převracením mikrozkumavky.
• 13. Odstřeďujte na 15000 g po dobu 10 minut při 4 °C, peletu zachovejte a odstraňte etanol.

Jiné metody extrakce DNA (např. Qiagen DNeasy Plant Kit) by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 10³ až 10⁴ patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.

Připravte testované vzorky a kontroly pro PCR podle validovaného protokolu (dodatek 6). Připravte jeden desetinný roztok vzorku DNA (1:10 ve sterilní vodě).

Připravte příslušnou reakční směs pro PCR v prostředí, kde nehrozí kontaminace, podle zveřejněného protokolu (dodatek 6). Validovaný protokol PCR je multiplexová reakce, která zahrnuje také interní kontrolu PCR.

Přidejte do sterilních PCR mikrozkumavek 5 µl extraktu DNA na 25 µl PCR reakce.

Zahrňte negativní kontrolní vzorek obsahující pouze reakční směs PCR a přidejte stejnou sterilní vodu UPW, která byla použita do směsi PCR namísto vzorku.

Umístěte PCR mikrozkumavky do stejného termocykleru, který byl použit při počátečním testování, a proveďte vhodně optimalizovaný program PCR (dodatek 6).

Rozdělte amplikony PCR elektroforézou v agarózovém gelu. Naneste nejméně 12 µl amplifikované reakční směsi DNA z každého vzorku smíchané s 3 µl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Tris-acetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5–8 V na cm. Používejte vhodný marker DNA, např. 100 bp ladder.

Detekujte proužky DNA barvením v ethidium bromidu (0,5 mg na l) po dobu 30–45 minut, za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.

V obarveném a UV (krátké vlnové délky, např. 302 nm) prosvíceném gelu hledejte amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek zdokumentujte.

U všech nových nálezů/případů zkontrolujte pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a době s vhodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Rozdělte naštěpené fragmenty elektroforézou vagarózovém gelu a pozorujte charakteristický vzor restrikčního fragmentu pod UV prosvícením po obarvení ethidiumbromidem a porovnejte s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.

Interpretace výsledku PCR testu:

PCR test je negativní, pokud amplikon typický pro C. m. subsp. sepedonicus očekávané velikosti nebyl zjištěn v daném vzorku, ale byl zjištěn ve všech pozitivních kontrolních vzorcích (v případě vícenásobné PCR s rostlinnými interními kontrolními primery: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován s daným vzorkem).

PCR test je pozitivní, pokud byl zjištěn amplikon typický pro C. m. subsp. sepedonicus očekávané velikosti a vzoru (pokud se požaduje), za předpokladu, že nebyl amplifikován žádným z negativních kontrolních vzorků. Spolehlivého potvrzení pozitivního výsledku lze dosáhnout také opakováním testu s druhou sadou PCR primerů (oddíl 9.3).

Lze mít podezření na inhibici PCR, pokud byl očekávaný amplikon získán z pozitivního kontrolního vzorku obsahujícího C. m. subsp. sepedonicus ve vodě, ale z pozitivní kontroly s C. m. subsp. sepedonicus v bramborovém extraktu byly negativní. Ve vícenásobných protokolech PCR s interními kontrolami PCR k inhibici reakce došlo, pokud nebyl získán žádný z obou amplikonů.

Lze mít podezření na kontaminaci, pokud byl očekávaný amplikon získán z jedné nebo více negativních zkoušek.

Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění 10³ až 10⁴ jednotek C. m. subsp. sepedonicus tvořících kolonie na l ml přidaný k extraktům ze vzorku, které původně byly testovány s negativním výsledkem (příprava viz dodatek 2).

Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a optimálních růstových podmínkách. Metodu však lze úspěšně použít i na extrakty, které byly uchovávány v glycerolu při teplotě –68 až –86 °C.

Některé odrůdy lilku vejcoplodého poskytují vynikající selektivní obohacující médium pro růst C. m. subsp. sepedonicus dokonce v případě nepřítomnosti příznaků a poskytují také vynikající základní konfirmační test.

Pro omezení nebezpečí falešně negativních výsledků testů by měly být vytvořeny optimální růstové podmínky.

Podrobnosti o pěstování viz dodatek 8.

Rozdělte celý zbytek testované resuspendované pelety z oddílu 3.1.6 nebo 3.2.5 mezi rostliny lilku jednou z níže uvedených metod (7.3 nebo 7.4). Používejte pouze rostliny ve fázi 2–3 listů do úplného rozvinutí třetího pravého listu. Abyste zajistili úplné využití resuspendované pelety i efektivní inokulaci, bude pro níže popsané postupy potřeba 15–25 lilků na vzorek.

Před inokulací 1 až 2 dny nezalévejte, aby se snížilo vnitřní napětí buněk.

Inokulace zářezem

Držte rostlinu mezi dvěma prsty a pipetou přeneste na stonek mezi děložními lístky a prvním pravým listem kapku (přibližně 5–10 µl) suspendované pelety.

Pomocí sterilního skalpelu proveďte šikmý zářez dlouhý asi 1,0 cm a hluboký přibližně jako 2/3 průměru stonku, řez začněte od peletové kapky.

Zakryjte zářez sterilní vazelínou z injekční stříkačky.

Inokulace injekční stříkačkou

Stonky lilku inokulujte těsně nad děložními lístky pomocí injekční stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23 G). Vzorek rozdělte mezi rostliny lilku.

Jako pozitivní kontroly inokulujte 5 rostlin vodní suspenzí 10⁵ až 10⁶ buněk na 1 ml známé kultury C. m. subsp. sepedonicus a pokud možno s i pletivem z přirozeně infikovaných hlíz bramboru (viz oddíl 4) stejnou inokulační metodou (7.3 nebo 7.4).

Jako negativní kontrolu inokulujte 5 rostlin sterilním peletovým pufrem stejnou inokulační metodou (7.3 nebo 7.4).

Inkubujte rostliny v karanténě po dobu až 4 týdnů při teplotě 18–24 °C. Inkubujte rostliny za dostatečného osvětlení a vysoké vlhkosti (70–80 %) a zalévejte je tak, aby nedošlo k nasávání vody nebo vadnutí kvůli nedostatku vody. Buňky C. m. subsp. sepedonicus odumírají při teplotách nad 30 °C a optimální teplota je 21 °C. Abyste zamezili kontaminaci, inkubujte rostliny pro pozitivní kontroly a negativní kontroly ve skleníku nebo růstové komoře na jasně oddělených policích, anebo při nedostatku místa zajistěte přísné oddělení mezi zacházením s nimi. Pokud musí být rostliny pro různé vzorky inkubovány blízko sebe, oddělte je vhodnými přepážkami. Při hnojení, zalévání, kontrole a jiné manipulaci věnujte maximální pozornost tomu, aby nedošlo ke kontaminaci. Je nezbytné, aby skleníky i růstové komory byly chráněny před veškerým hmyzem, protože by mohl přenášet bakterie z jednoho vzorku na druhý.

Pravidelně počínaje 8. dnem prověřujte přítomnost příznaků. Počítejte rostliny vykazující příznaky. C. m. subsp. sepedonicus působí u lilku vejcoplodého vadnutí listů, které může začít jako okrajová nebo mezižilková ochablost. Zvadlé pletivo může zprvu být tmavozelené nebo strakaté, ale než znekrotizuje, zesvětlí. Povadlá místa mezi žilnatinou mívají často mastně vodnatý vzhled. Nekrotická pletiva mívají často jasně žlutý okraj. Rostliny vždy neodumírají; čím déle trvá období do vyvinutí příznaků, tím větší je naděje na přežití. Rostliny mohou infekci odrůst. Mladé rostliny lilku vejcoplodého jsou vnímavější k nízkým koncentracím C. m. subsp. sepedonicus než starší rostliny, proto je nezbytné používat rostliny ve fázi tří listů a nebo krátce před ní.

Vadnutí mohou také způsobovat populace jiných bakterií nebo hub přítomných v peletě z pletiv hlízy. Patří k nim Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora a E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, jakož i populace saprofytických bakterií. Zejména Erwinia chrysanthemi může způsobit příznaky na listech a vadnutí velmi podobné příznakům C. m. subsp. sepedonicus. Jediným rozdílem je zčernání stonků v případě infekcí Erwinia chrysanthemi. Jiné případy vadnutí lze odlišit od případů způsobených C. m. subsp. sepedonicus, jelikož rychle vadnou celé listy nebo celé rostliny. Můžete také připravit Gramovo barvení: tento test rozliší C. m. subsp. sepedonicus od Erwinia spp.

Jakmile se na lilku vejcoplodém objeví příznaky, mělo by dojít k izolaci za použití částí pletiva zvadlých listů nebo stonků rostlin (macerace pletiv viz 3.1.3). Povrch listů a stonků lilku vejcoplodého dezinfikujte otřením 70 % etanolem. Proveďte test IF nebo PCR na šťávě z lilku a izolujte na vhodná (selektivní) média (viz oddíl 8). Můžete také připravit Gramovo barvení (dodatek 9). Identifikujte čisté kultury podezřelé z přítomnosti C. m. subsp. sepedonicus a potvrďte patogenitu (viz oddíl 9 a 10).

Za určitých okolností, zejména pokud nejsou růstové podmínky optimální, se může stát, že C. m. subsp. sepedonicus zůstává v rostlinách lilku vejcoplodého jako latentní infekce dokonce i po uplynutí inkubační doby až 4 týdnů. Pokud nejsou po 4 týdnech pozorovány žádné příznaky, proveďte test IF/PCR na složeném vzorku částí stonků o délce 1 cm z každé testované rostliny odebraných nad místem inokulace. Pokud je test pozitivní, měla by být provedena izolace na vhodná (selektivní) média postupem podle oddílu 8. Identifikujte čisté kultury podezřelé z přítomnosti C. m. subsp. sepedonicus a potvrďte patogenitu (viz oddíl 9 a 10).

Interpretace výsledku biotestu:

Platných výsledků biotestu je dosaženo, jestliže rostliny pozitivní kontroly vykazují typické příznaky, z těchto rostlin lze izolovat bakterie a u negativních kontrol nejsou příznaky zjištěny.

Biotest je negativní, jestliže testované rostliny nejsou infikovány C. m. subsp. sepedonicus, a za předpokladu, že C. m. subsp. sepedonicus je zjištěn u pozitivních kontrol.

Biotest je pozitivní, jestliže jsou testované rostliny infikovány C. m. subsp. sepedonicus.

Diagnóza je ukončena pouze v případě, že je C. m. subsp. sepedonicus izolována, následně identifikována (viz oddíl 9) a potvrzena zkouškou patogenity (oddíl 10). Ačkoliv je C. m.. subsp. sepedonicus náročný organizmus, je možno ji izolovat z pletiv vykazujících příznaky napadení.

Mohou ji však přerůst rychle rostoucí saprofytické bakterie, a proto je izolace přímo z pelety pletiva hlízy nebo stonku (oddíl 3.1.6 nebo 3.2.5) náročná. Přímá izolace C. m. subsp. sepedonicus může být možná za použití selektivního média a vhodného ředění resuspendované pelety z pupkové části hlízy nebo ze stonků rostliny.

Izolace se provádí ze všech hlíz bramboru nebo částí stonků a z rostlin lilku vejcoplodého, které nevykazují příznaky napadení, ale u nichž byl pozitivní výsledek v testu IF/PCR složených vzorků (viz oddíl 7.10). Pokud je třeba provést maceraci stonků lilku, měla by být provedena podle oddílu 3.1.3.

Jako pozitivní kontroly připravte desetinná ředění suspenze 10⁶ cfu na ml C. m. subsp. sepedonicus (např. NCPPB 4053 nebo PD 406). Abyste vyloučili nebezpečí kontaminace, připravujte pozitivní kontroly naprosto odděleně od vzorků, které mají být testovány.

Pro každou nově připravenou dávku selektivního média by se měla před použitím k testování obvyklých vzorků přezkoušet jeho vhodnost pro růst patogenu.

Testujte kontrolní materiál stejným způsobem jako vzorek/vzorky.

Ze 100 µl alikvotní části ze vzorku resuspendované bramborové pelety nebo šťávy z lilku vejcoplodého připravte desetinásobné ředění v peletovém pufru (dodatek 3).

Izolace z neředěné bramborové pelety se obvykle nepodaří kvůli náročným růstovým podmínkám Cms a konkurenci saprofytů. Vzhledem k tomu, že bakterie je obvykle v infikovaných pletivech přítomná ve vysokých koncentracích, lze saprofyty obvykle vypláchnout ředěním, zatímco patogen zůstává. Proto se doporučuje rozetřít 100 µl z každého vzorku, v ředění 1/100 až 1/10000 na MTNA médium nebo NCP-88 médium (dodatek 5) (pokud používáte Petriho misky o průměru 90 mm – pro jiné velikosti misky objem přizpůsobte), za použití pomůcek určených k roztěrům (hokejek) a techniky roztěrů.

Alternativním postupem je rozetření počátečních 100 µl alikvotní části bramborové pelety na první misku s agarem vhodným nástrojem a následné použití téhož nástroje na druhou misku s agarem, tento postup na závěr zopakujte s třetí miskou, a tím dosáhnete efektu zředění.

Inkubujte desky v temnu při teplotě 21–23 °C.

Počáteční kontrola misek zahrnuje porovnání s kontrolními miskami a počítání všech kolonií podobných C. m. subsp. sepedonicus se provádějí po třech dnech, s dalším počítáním po 5, 7 a nakonec 10 dnech.

Subkultury kolonií podobných C. m. subsp. sepedonicus pro inokulaci lilku vejcoplodého a/nebo následnou identifikaci by se měly pěstovat na YGM médiu; inokulace a identifikace by se měly provést dříve, než jsou média příliš přerostlá, tj. nejlépe po 3–5 dnech.

Rozetřete kolonie podobné C. m. subsp. sepedonicus na jedno z následujících médií: (složení uvedena v dodatku 5):

živný dextrózový agar (pouze pro subkultury),

agar z kvasničné peptonové glukózy,

agar z kvasničného extraktu s minerálními solemi.

Inkubujte při teplotě 21 °C–24 °C po dobu maximálně 10 dní.

C. m. subsp. sepedonicus roste pomalu, obvykle tvoří krémově zabarvené klenuté kolonie velikosti špendlíkové hlavičky během 10 dní. (Fotografie typických kolonií C. m. subsp. sepedonicus viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Znovu rozetřete pro zaručení čistoty.

U subkultur se rychlost růstu zlepšuje. Typické kolonie jsou smetanově bílé nebo barvy slonoviny, někdy žluté, okrouhlé, hladké, vyvýšené, konvexně vyklenuté, slizovitě tekuté, s rovnými okraji a obvykle mají v průměru 1–3 mm.

Jednoduché Gramovo barvení (dodatek 9) může pomoci vybrat kolonie pro další testování.

Identifikujte podezřelé kultury (viz oddíl 9) a proveďte zkoušku patogenity (viz oddíl 10).

Identifikujte čisté kultury pravděpodobné izolované kultury C. m. subsp. sepedonicus za použití nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.

V případě potřeby zahrňte pro každý provedený test známý referenční kmen.

Zjistěte následující fenotypické vlastnosti, které jsou obecně přítomné nebo nepřítomné v C. m. subsp. sepedonicus podle metod Lelliotta a Steada (1987), Klementa a kol. (1990), Schaada (2001), Anonym (1987).

Veškerá média by se měla inkubovat při 21 °C a po šesti dnech by měla být vyhodnocena. Pokud nedošlo k žádnému růstu, inkubujte po dobu nejvýše 20 dní.

Všechny testy musí zahrnovat kontrolu se známým kmenem C. m. subsp. sepedonicus. Nutriční a fyziologické testy se musí provádět za použití inokula ze subkultur živného agaru. Morfologická srovnání se musí provádět z kultur z živného dextrózového agaru.

• a) Připravte suspenzi přibližně 10⁶ buněk/ml v pufru na IF (dodatek 3).
• b) Připravte série dvojnásobného ředění vhodného antiséra.

• a) Připravte suspenzi přibližně 10⁶ buněk na ml ve sterilní vodě (Ultra pure water = UPW).
• b) Zahřívejte 100 µl suspenze buněk v uzavřených mikrozkumavkách v ohřívacím bloku nebo vřící vodní lázni při teplotě 100 °C po dobu 4 minut. V případě potřeby můžete lýzu buněk podpořit přidáním čerstvě připraveného NaOH do konečné koncentrace 0,05 M. Vzorky lze potom uložit při teplotě –16 až –24 °C až do použití.
• c) Pro amplifikaci C. m. subsp. sepedonicus specific amplicons použijte vhodné postupy PCR (např. Pastrik, 2000; viz dodatek 4; Li a de Boer, 1995; Mills a kol., 1997; Pastrik a Rainey, 1999; Schaad a kol., 1999).
• d) Identifikace C. m. subsp. sepedonicus je pozitivní, pokud jsou amplikony PCR stejné velikosti a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentu jako pozitivní kontrolní kmen.

• a) Připravte suspenzi přibližně 10⁶ buněk na ml v UPW.
• b) Proveďte postup FISH (oddíl 5).
• c) Test FISH je pozitivní, jsou-li dosaženy stejné reakce kultury a pozitivní kontroly.

• a) Pěstujte kulturu na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) po dobu 72 hodin při teplotě 21 °C (+/– 1°).
• b) Použijte vhodný postup FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).
• c) Test FAP je pozitivní, pokud je profil podezřelé kultury identický s profilem pozitivní kontroly. Přítomnost charakteristických mastných kyselin 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 a 17:0 Anteiso jasně svědčí o přítomnosti C. m. subsp. sepedonicus. Jiné rody jako Curtobacterium, Arthrobacter a Micrococcus také obsahují některé z těchto kyselin, ale 15:1 Anteiso A je pro tyto bakterie neobvyklá kyselina, která se však vyskytuje ve všech Clavibacter spp. v rozmezí 1–5 %. U C. m.subsp. sepedonicus se hodnota obvykle pohybuje kolem 5 %.

• a) Připravte suspenzi přibližně 10⁶ buněk na ml v UPW.
• b) Proveďte test postupem podle (Smith a kol., 2001).

Pro konečné potvrzení diagnózy C. m. subsp. sepedonicus a pro stanovení virulence kultur identifikovaných jako C. m. subsp. sepedonicus musí být provedena zkouška patogenity.

Připravte inokulum přibližně 10⁶ buněk na ml z 3-denních kultur testované izolované látky a vhodného pozitivního kontrolního kmene C. m. subsp. sepedonicus.

Naočkujte 5–10 stonků mladých semenáčků lilku vejcoplodého ve fázi 3 pravých listů (oddíl 7.3 nebo 7.4).

Inkubujte při teplotě 18–24 °C při dostatečném světle a vysoké relativní vlhkosti s přiměřeným zaléváním, aby nedošlo k přemokření nebo vyschnutí (oddíl 7.7). U čistých kultur by mělo během 2 týdnů nastat typické vadnutí, avšak rostliny, které po uplynutí této doby nevykazují žádné příznaky infekce (viz oddíl 7.8), by se měly inkubovat až 3 týdny při teplotách příznivých pro růst lilku vejcoplodého, ale nepřesahujících 25 °C (dodatek 8). Jestliže se po 3 týdnech příznaky infekce nevyskytují, nemůže být kultura považována za patogenní formu C. m. subsp. sepedonicus.

Izolujte z rostlin s příznaky infekce odstraněním části stonku 2 cm nad místem inokulace. Rozdrťte a suspendujte v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fostátového pufru (dodatek 3). Izolujte ze suspenze rozetřením nebo nanesením na MTNA a YPGA (dodatek 5), inkubujte po dobu 3–5 dní při teplotě 21–23 °C a sledujte vznik kolonií typických pro C. m. subsp. sepedonicus.

PŘÍLOHA II

PŘÍLOHA III

PŘÍLOHA IV

PŘÍLOHA V

Úředně schválené metody odstranění/likvidace odpadu podle přílohy IV odstavce 1 musí splňovat následující ustanovení, aby bylo vyloučeno jakékoli zjistitelné riziko šíření organismu:

Možnosti popsané v této příloze se použijí také na odpad spojený s manipulací, likvidací a zpracováním zamořených partií.