PŘÍLOHA I

1. STANOVENÍ VLHKOSTI V ŽIVOČIŠNÝCH A ROSTLINNÝCH TUCÍCH A OLEJÍCH

Tato metoda umožňuje stanovit obsah vody a těkavých látek v živočišných a rostlinných tucích a olejích.

Vzorek se suší do konstantní hmotnosti při 103 ^oC. Ztráta hmotnosti se stanoví vážením.

Miska s plochým dnem z nekorozního materiálu, 8 až 9 cm v průměru a přibližně 3 cm vysoká.

Rtuťový teploměr se zesílenou baňkou a expanzní trubicí na horním konci, odstupňovaný přibližně od 80 ^oC po nejméně 110 ^oC, a přibližně 10 cm dlouhý.

Písková lázeň nebo elektrická varná plotýnka.

Exsikátor obsahující výkonné sušící činidlo.

Analytické váhy.

Odvažte s přesností na mg přibližně 20 g homogenizovaného vzorku do suché, odvážené misky (3.1) s teploměrem (3.2). Zahřejte pískovou lázeň nebo plotýnku (3.3) za stálého míchání teploměrem tak, aby teplota dosáhla 90 ^oC během asi 7 minut.

Snižte ohřev a sledujte frekvenci, se kterou vystupují bubliny ze dna misky. Teplota nesmí překročit 105 ^oC. Pokračujte v míchání ode dna nádoby, dokud se nepřestanou tvořit bubliny.

Aby bylo zajištěno úplné odstranění vlhkosti, zahřejte několikrát na 103 ^oC ± 2 ^oC, mezi následnými ohřevy ochlaďte na 93 ^oC. Potom nechejte vychladnout na pokojovou teplotu v exsikátoru (3.4) a zvažte. Opakujte tuto operaci, dokud ztráta hmoty mezi dvěma váženími již nepřekračuje 2 mg.

Poznámka: Vzestup hmotnosti vzorku po opakovaném ohřevu naznačuje oxidaci tuku, v takovém případě počítáme výsledek z vážení provedeného okamžitě před tím, než se hmotnost začala zvětšovat.

Obsah vlhkosti, jako procento vzorku, je dán následující rovnicí:

M1 – M2 · 100Mo

kde:

Výsledky nižší než 0,05 % se musejí zaznamenávat jako „nižší než 0,05 %“.

Rozdíl ve vlhkosti mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 0,05 % v absolutní hodnotě.

Tato metoda umožňuje stanovit množství hořčíku v krmivech. Je zvláště vhodná pro stanovení obsahu hořčíku nižšího než 5 %.

Vzorek je zpopelněn a rozpuštěn ve zředěné kyselině chlorovodíkové. Pokud neobsahuje organické látky, je rozpuštěn přímo ve zředěné kyselině chlorovodíkové. Roztok se rozředí a obsah hořčíku se stanoví atomovou absorpční spektrofotometrií při vlnové délce 285,2 nm.

Kyselina chlorovodíková p.a. d: 1,16.

Koncentrovaná kyselina chlorovodíková p.a. d: 1,19.

Hořčíkový pásek nebo drát, nebo MgSO₄ 7H₂O, sušený za pokojové teploty.

Roztok soli stroncia (chlorid nebo dusičnan) 2,5 % (76,08 g SrCl₂ 6H₂O p.a., nebo 60,38 g Sr(No₃)₂ p.a.).

Standardní roztok hořčíku: odvažte s přesností na mg 1 g hořčíku (3.3), u kterého byla předem opatrně odstraněna oxidační vrstva, nebo odpovídající množství (10,143 g) MgSO₄7H₂O (3.3). Vložte do 1000 ml odměrné baňky, přidejte 80 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), nechejte rozpustit a doplňte do 1000 ml vodou. 1 ml tohoto roztoku obsahuje 1,000 mg hořčíku.

Platinové, křemíkové nebo porcelánové spalovací kelímky.

Termostaticky řízená elektrická muflová pec.

Atomový absorpční spektrofotometr.

Odvažte s přesností na mg 5 g vzorku do 500 ml odměrné baňky s 250 až 300 ml vody. Přidejte 40 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), uveďte do varu a udržujte kapalinu při mírném varu po dobu 30 minut. Nechejte vychladnout, doplňte vodou na objem, promíchejte a přefiltrujte do suché kádinky přes suchý skládaný filtr. Vyřaďte prvních 30 ml filtrátu. V přítomnosti křemíku rozpusťte 5 g vzorku v dostatečném množství (15-30 ml) kyseliny chlorovodíkové (3.2), odpařte do sucha na vodní lázni a vložte na jednu hodinu do sušárny o 105 ^oC. Pokračujte, jak je uvedeno od třetí věty v 5.1.2.

Odvažte s přesností na mg 5 g vzorku do kelímku a zpopelněte při 550 ^oC v muflové peci, dokud není získán popel, který je bez uhlíkatých částic, a nechejte vychladnout. Aby byl odstraněn křemík, přidejte do popela dostatečné množství (15-30 ml) kyseliny chlorovodíkové (3.2), odpařte do sucha na vodní lázni a vložte na jednu hodinu do sušárny o 105 ^oC. Zbytek rozpusťte 10 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) a převeďte do 500 ml odměrné baňky za užití horké vody. Nechejte vychladnout a doplňte na objem vodou. Promíchejte a přefiltrujte do suché kádinky přes suchý skládaný filtr. Vyřaďte prvních 30 ml filtrátu.

Odvažte s přesností na mg 5 g vzorku do kelímku a zpopelněte při 550 ^oC v muflové peci, dokud není získán popel, který je bez uhlíkatých částic. Popel ošetřete 5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2), odpařte do sucha na vodní lázni a převeďte na jednu hodinu do sušárny o 105 ^oC, aby se sloučeniny křemíku staly nerozpustnými. Popel ošetřete 5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), převeďte do 250 ml odměrné baňky za užití horké vody, uveďte do varu, nechejte vychladnout a doplňte na objem vodou. Promíchejte a přefiltrujte do suché kádinky přes suchý skládaný filtr. Vyřaďte prvních 30 ml filtrátu.

Rozředěním standardního roztoku (3.5) vodou připravte nejméně 5 referenčních roztoků o vzrůstající koncentraci odpovídající optimálnímu rozsahu měření spektrofotometru. Přidejte do každého roztoku 10 ml roztoku soli stroncia (3.4) a potom doplňte objem do 100 ml vodou. Rozřeďte vodou jednu alikvotní část filtrátu získaného podle 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3 tak, že se získá koncentrace hořčíku, která je v úrovni limitů koncentrace referenčních roztoků. Koncentrace kyseliny chlorovodíkové tohoto roztoku nesmí překročit 0,4 N. Přidejte 10 ml roztoku soli stroncia (3.4) a potom doplňte objem do 100 ml vodou. Změřte absorpci roztoku, který má být stanoven, a referenčních roztoků při vlnové délce 285,2 nm.

Vypočtěte množství hořčíku ve vzorku porovnáním s referenčními vzorky. Výsledek vyjádřete jako procento vzorku.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 5 % rel.

Tato metoda umožňuje stanovit v krmivu obsah tukuprostých organických látek, jež jsou nerozpustné v kyselých a zásaditých médiích a jsou konvenčně označeny jako hrubá vláknina.

Vzorek, tam kde je to třeba odtučněný, je ošetřován postupně vroucími roztoky kyseliny sírové a hydroxidu draselného stanovených koncentrací. Zbytek je oddělen filtrací na sintrovém skleněném filtru, promýván, usušen, zvážen a zpopelněn při 475 až 500 ^oC. Ztráta váhy vyplývající ze zpopelnění odpovídá přítomnosti hrubé vlákniny v testovaném vzorku.

Kyselina sírová, c = 0,13 mol/l.

Protipěnící emulse (např. n-octanol).

Filtrační pomůcka (Celit 545 nebo ekvivalent), zahřátý při 500 ^oC po dobu čtyř hodin (8.6.).

Aceton.

Petrolether, rozsah varu 40 až 60 ^oC.

Kyselina chlorovodíková, c = 0,5 mol/l.

Roztok hydroxidu draselného, c = 0,23 mol/l.

Topná jednotka pro digesci s kyselinou sírovou nebo roztokem hydroxidu draselného, vybavená podpěrou pro filtrační kelímek (4.2) a vybavená výtokovou trubicí s kohoutem na kapalný výtok a vakuum, případně stlačený vzduch. Každý den před použitím, předehřejte topnou jednotku vařící vodou po dobu 5 minut.

Skleněný filtrační kelímek se zatavenou sintrovou skleněnou filtrační destičkou s póry velikosti 40-90 μm. Před prvním použitím ohřejte na 500 ^oC po několik minut a ochlaďte (8.6).

Válec nejméně 270 ml se zpětným chladičem vhodným pro var.

Sušárna s termostatem.

Muflová pec s termostatem.

Extrakční jednotka skládající se z opěrné desky pro filtrační kelímek (4.2) a s výtokovou trubicí a kohoutem na vakuum a kapalný výtok.

Spojovací kroužky ke smontování topné jednotky (4.1), kelímku (4.2) a válce (4.3) a ke spojení chladné extrakční jednotky (4.6) a kelímku.

Odvažte, s přesností na 0,001 g, 1 g připraveného vzorku a vložte jej do kelímku (4.2), (viz Poznámky 8.1, 8.2 a 8.3) a přidejte 1g filtrační pomůcky (3.3).

Smontujte topnou jednotku (4.1) a filtrační kelímek (4.2), potom připojte válec (4.3) ke kelímku. Do smontovaného válce a kelímku nalijte 150 ml vroucí kyseliny sírové (3.1) a pokud je to potřeba, přidejte několik kapek protipěnícího činidla (3.2).

Uveďte kapalinu do varu během 5 + 2 minut a vařte silně po dobu přesně 30 minut.

Otevřete kohoutek výpustní trubice (4.1) a filtrujte za vakua kyselinu sírovou přes filtrační kelímek a vymyjte zbytek třemi postupnými dávkami 30 ml vroucí vody, přičemž se přesvědčete, že je reziduum filtrováno suché po každém promytí.

Zavřete výtokový kohout a nalijte 150 ml vroucího roztoku hydroxidu draselného (3.7) do smontovaného válce a kelímku a přidejte několik kapek protipěnícího činidla (3.2). Uveďte kapalinu během 5 + 2 minut k bodu varu a vařte silně po dobu přesně 30 minut. Přefiltrujte a opakujte promývání jako v případě kyseliny sírové.

Po závěrečném vymývání a sušení odpojte kelímek a jeho obsah a připojte jej ke chladné extrakční jednotce (4.6). Použijte vakuum a vymyjte zbytek v kelímku třemi postupnými dávkami 25 ml acetonu (3.4), přičemž se přesvědčete, že je reziduum filtrováno suché po každém promytí.

Vysušte kelímek do konstantní váhy v sušárně při 130 ^oC. Po každém sušení vychlaďte v exsikátoru a rychle odvažte. Vložte kelímek do muflové pece a zpopelněte do konstantní váhy při 475 ^oC až 500 ^oC po dobu nejméně 30 minut.

Po každém ohřevu ochlaďte nejdříve v peci a potom v exsikátoru před vážením.

Proveďte slepý pokus bez vzorku. Ztráta hmoty vyplývající ze zpopelnění nesmí překročit 4 mg.

Obsah hrubé vlákniny, jako procento vzorku, je dán výrazem:

b-c × 100a

kde:

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

• 0,3 v absolutní hodnotě u obsahů hrubé vlákniny nižších než 10 %,

• 3 % vzhledem k vyšší hodnotě, u obsahů hrubé vlákniny rovnajících se nebo větších než 10 %.

Krmiva obsahující více než 10 % hrubého tuku musí být před analýzou odtučněna petroletherem (3.5.). Spojte filtrační kelímek (4.2.) a jeho obsah s chladnou extrakční jednotkou (4.6.) a použijte vakuum a vymyjte zbytek třemi postupnými dávkami 30 ml petroletheru, přičemž se přesvědčete, že je zbytek suchý. Spojte kelímek a jeho obsah s topnou jednotkou (4.1.) a pokračujte jak popsáno v 5.

Krmiva obsahující tuky, jež nemohou být extrahovány přímo petroletherem (3.5), musí být odtučněna, jak uvedeno v 8.1., a odtučněna ještě jednou po varu s kyselinou.

Po varu s kyselinou a následném promytí spojte kelímek a jeho obsah s chladnou extrakční jednotkou (4.6.) a promyjte třikrát 30 ml acetonu a následně dalšími třemi 30 ml dávkami petroletheru. Filtrujte za vakua do sucha a pokračujte v analýze, jak popsáno v 5. Začněte působením hydroxidem draselným.

Pokud obsahují krmiva více než 5 % uhličitanů, vyjádřeno jako uhličitan vápenatý, spojte kelímek (4.2) s odváženým vzorkem s topnou jednotkou (4.1). Promyjte vzorek třikrát 30 ml kyseliny chlorovodíkové (3.6). Po každém přidání nechejte vzorek stát po asi jednu minutu před filtrací. Promyjte jednou 30 ml vody, a potom pokračujte, jak popsáno v bodě 5.

Pokud je použit přístroj ve formě stojanu (několik kelímků připojených ke stejné topné jednotce), nesmí být prováděna dvě stanovení u stejného vzorku ve stejných sériích.

Pokud je obtížné filtrovat kyselé a zásadité roztoky po varu, použijte stlačený vzduch přes výstupní trubici tepelné jednotky, a potom pokračujte ve filtrování.

Teplota pro zpopelnění by neměla být vyšší než 500 ^oC, aby se prodloužila životnost skleněných filtračních kelímků. Pozornost musí být věnována vyvarování se mimořádných teplotních šoků během cyklů ohřevu a chladnutí.

PŘÍLOHA II

1. STANOVENÍ RETINOLU (VITAMÍN A)

Tato metoda umožňuje stanovit množství retinolu (vitamín A) v krmivech, koncentrátech a premixech. Limit detekce je 10000 IU/kg pro vysoce pigmentovaná krmiva a 4000 IU/kg pro ostatní(1 IU = 0,3 μg retinolu.). Produkty jsou rozděleny do dvou skupin, podle jejich předpokládaného obsahu retinolu:

Skupina A: obsahy nižší než 200000 IU/kg;

Skupina B: obsahy rovnající se nebo vyšší než 200000 IU/kg.

Vzorek je hydrolyzován za horka roztokem hydroxidu draselného v ethanolovém médiu a za přítomnosti antioxidantu nebo v dusíkaté atmosféře. Směs je extrahována 1,2-dichlorethanem. Extrakt je odpařen do sucha a ošetřen petroletherem. Roztok je chromatografován na koloně oxidu hlinitého (u produktů skupiny B je chromatografie požadována pouze v určitých případech). U produktů skupiny A je retinol stanoven spektrofotometricky při 610 nm po vytvoření barevného komplexu podle Carr-Priceovy reakce; u produktů skupiny B spektrofotometricky v UV oblasti při 325 nm.

96 % (V/V) ethanol.

10 % (váhově vzhledem k objemu) roztok askorbanu sodného p.a. nebo

čištěný dusík.

50 % (váhově vzhledem k objemu) roztok hydroxidu draselného p.a.

1 N roztok hydroxidu draselného p.a.

0,5 N roztok hydroxidu draselného p.a.

1,2-dichlorethan p.a.

Petrolether, rozsah varu: 30–50 ^oC. Pokud je to potřeba, přečistěte následujícím způsobem: míchejte 1000 ml petroletheru se 20 ml dávkami koncentrované kyseliny sírové, dokud zůstává kyselina bezbarvá. Odstraňte kyselinu a promývejte petrolether postupně 500 ml vody, dvakrát 250 ml 10 % (váhově vzhledem k objemu) roztoku hydroxidu sodného a třikrát 500 ml vody. Odstraňte vodnatou vrstvu, odsušte petrolether po dobu 1 hodiny přes aktivní uhlí a bezvodý síran sodný, přefiltrujte a destilujte.

Oxid hlinitý, standardizovaný podle Brockmanna: žíhejte po dobu 8 hodin při 750 ^oC, vychlaďte v exsikátoru a uskladněte v láhvi z hnědého skla vybavené zábrusovou skleněnou zátkou. Před použitím ve chromatografii zvlhčete následovně: do lahve z hnědého skla vložte 10 g oxidu hlinitého a 0,7 ml vody, uzavřete zátkou, zahřívejte po dobu 5 minut v lázni s vroucí vodou za současného protřepávání. Nechejte vychladnout. Ověřte aktivitu takto připraveného hliníku pomocí známého množství retinolu (3.17) (cca 500 IU) podle postupu uvedeného v 5.3 a 5.4 a kontrolním testem.

Bázický oxid hlinitý, stupeň aktivity 1 (Woelm, Merck nebo ekvivalentní).

Čistý diethylether. Odstraňte peroxidy a stopy vody chromatograficky na koloně bázického oxidu hlinitého (3.10). (25 g oxidu hlinitého na 250 ml diethyletheru.)

Roztoky petroletheru (3.8) ve 4, 8, 12, 16 a 20 % (V/V) diethyletheru (3.11).

0,5 mol/l roztok síranu sodného v 70 % (V/V) glycerinu připravený ze síranu sodného p.a.

Krystalizaceschopný benzen p.a.

Chloroform p.a. Odstraňte ethanol, fosgen a stopy vody chromatograficky na koloně bázického oxidu hlinitého (3.10) (50 g oxidu hlinitého na 200 ml chloroformu; doporučuje se chromatografovat prvních 50 ml eluátu podruhé).

Carr-Priceovo činidlo: míchejte přibližně 25 g chloridu antimonitého p.a. (udržujte v exsikátoru) se 100 ml chloroformu (3.15), dokud není roztok nasycený. Malá usazenina chloridu antimonitého nečiní problém. Přidejte 2 ml acethanhydridu p.a. Udržujte v chladničce v láhvi z hnědého skla se skleněnou zábrusovou zátkou. Roztok má trvanlivost několik týdnů.

Retinol – spektrofotometricky standardizovaný.

Isopropanol pro chromatografii.

Vodní lázeň.

Vakuová odparka s kulatými lahvemi o různém objemu.

Skleněné chromatografické trubice (délka: 300 mm; vnitřní průměr: okolo 13 mm).

Spektrofotometr s 10ml kyvetami. Měření v oblasti UV vyžadují křemenné kyvety.

UV lampy vhodné pro 365 nm.

Poznámka: Všechny postupy musejí být prováděny mimo přímé světlo, pokud je to potřeba, v zařízení z hnědého skla.

Z jemně rozmělněného vzorku odeberte testovaný vzorek v poměru k předpokládanému obsahu retinolu, takto:

0,1–1,0 g pro koncentráty (obsahy větší než 20000 IU/g);

3,0–5,0 g pro premixy (obsahy mezi 400 a 20000 IU/g);

10–20 g pro minerální směsi;

30 g pro produkty skupiny A.

Ihned umístněte testovaný vzorek do 500 ml láhve se skleněnou zábrusovou zátkou.

Přidejte postupně k testovanému vzorku 40 ml ethanolu (3.1), 2 ml roztoku askorbanu sodného (3.2)(Askorban sodný nemusí být přidán, když probíhá hydrolýza v dusíkaté atmosféře.), 10 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4) a 2 ml roztoku síranu sodného (3.13).

Zahřívejte po dobu 30 minut při 70-80 ^oC pod zpětným chladičem a potom nechejte vychladnout pod proudem vody. Přidejte 50 ml ethanolu (3.1) a 100 ml 1,2-dichlorethanu (3.7) (odebíraného pipetou). Silně protřepejte a potom přelijte kapalný supernatant do dekantační nádoby. Přidejte do nádoby 150 ml roztoku hydroxidu draselného (3.5), protřepejte po dobu 30 vteřin a nechejte stát, dokud nejsou vrstvy odděleny. Odeberte vrstvu dichlorethanu (spodní vrstva) do dekantační nádoby, přidejte 40 ml roztoku hydroxidu draselného (3.6), protřepejte po dobu 10 vteřin a nechejte stát, dokud nejsou vrstvy odděleny. Odeberte vrstvu dichlorethanu do dekantační nádoby a propláchněte 6–8 krát 40 ml dávkami vody, dokud není odstraněna zásaditost (fenolftaleinový test). Odeberte vrstvu dichlorethanu a odstraňte poslední stopy vody za použití proužků filtračního papíru.

Odpařte do sucha alikvotní část roztoku za vakua a ve vodní lázni při 40 ^oC. Rychle ošetřete zbytek 5 ml petroletheru (3.8).

Pro produkty skupiny A chromatografujte podle postupu uvedeného v 5.3.1.

Pro produkty skupiny B přeneste roztok do 50 ml odměrné baňky, doplňte na objem petroletherem (3.8), promíchejte a změřte optickou hustotu, jak je uvedeno v 5.4.2.

Naplňte chromatografickou trubici (4.3) do výše 200 mm 10 g oxidu hlinitého (3.9) předem rozmíchaného s petroletherem (3.8). Do trubice převeďte roztok získaný v 5.2 a ihned přidejte 20 ml petroletheru (3.8). Vyluhujte postupně 10 ml dávkami roztoků lehkého petroleje ve 4, 8, 12, 16 a 20 % diethyletheru (3.12) za tlaku nebo částečného vakua, úroveň průtoku je 2 až 3 kapky za vteřinu.

Nejdříve je vyluhován karoten(Obsah karotenu může být stanoven měřením optické hustoty při 450 nm; E 1 %1 cm = 2600.). Retinol je obecně vyluhován roztokem petroletheru ve 20 % diethyletheru (3.12). Vyluhování probíhá za UV osvětlení (krátké ozáření trubice rtuťovou výbojkou). Fluorescenční zóna retinolu je jasně oddělena od žlutých zón xantofylu, jež následují. Extrakční frakci obsahující retinol shromážděte do Erlenmeyerovy baňky.

Chromatografie musí být prováděna pouze, pokud měření optické hustoty získaná v 5.4.2 nesplňují požadavky dané v 5.4.2.

Pokud se ukáže být chromatografie nezbytnou, umístněte do chromatografické kolony alikvotní část roztoku v petroletheru, získaného v 5.2, obsahujícího přibližně 500 IU retinolu, a chromatografujte podle postupu uvedeného v 5.3.1.

Odpařte do sucha za vakua eluát obsahující retinol získaný v 5.3.1. Ošetřete zbytek 2 ml benzenu (3.14). Odeberte 0,3 ml tohoto roztoku a přidejte 3 ml Carr-Priceova činidla (3.16). Vytvoří se modré zbarvení. Změřte optickou hustotu spektrofotometrem při 610 nm přesně 30 vteřin poté, co reakce započala. Stanovte obsah retinolu odkazem na standardní křivku získanou z benzenových roztoků o vzrůstajících standardních retinolových koncentracích ošetřených Carr-Priceovým činidlem (2 až 16 IU standard-retinolu (3.17) na 0,3 ml benzenu (3.14) + 3 ml Carr-Priceova činidla (3.16)). Standardní křivka musí být kontrolována pravidelně a často za použití standardu a čerstvě připraveného roztoku Carr-Priceova činidla.

Odeberte alikvotní část roztoku v petroletheru, získaného v 5.2, obsahujícího přibližně 200 IU retinolu. Odpařte do sucha za vakua a ošetřete zbytek 25 ml isopropanolu (3.18) Změřte optickou hustotu ve spektrofotometru při 325, 310 a 334 nm. Maximální absorpce se nachází ve 325 nm. Obsah retinolu v roztoku se vypočítá následovně:

E₃₂₅ . 18,30 = IU retinolu/ml

Nicméně, poměr optických hustot

E₃₁₀ : E₃₂₅ a E₃₃₄ : E₃₂₅

musí být 6 : 7 = 0,857.

Pokud se jeden z těchto poměrů liší znatelně od této hodnoty (< 0,830 nebo >0,880), musí měření optické hustoty předcházet chromatografie v souladu s metodou danou v 5.3.2. Pokud měření optické hustoty provedené po chromatografii ukáže, že se uvedený poměr stále znatelně liší od hodnoty 0,857 (< 0,830 nebo > 0,880), musí být stanovení provedeno v souladu s metodou danou pro produkty skupiny A.

Vypočítejte obsah retinolu ve vzorku berouce v úvahu váhu testovaného vzorku a ředění provedená během analýzy. Výsledky vyjádřete v IU retinolu na kg krmiva nebo na kg koncentrátu nebo premixu.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

• 20 % rel. u obsahů retinolu nižších než 75000 IU/kg,

• 15000 IU u obsahů mezi 75000 a 150000 IU/kg,

• 10 % rel. u obsahů mezi 150000 a 250000 IU/kg,

• 25000 IU u obsahů mezi 250000 a 500000 IU/kg,

• 5 % rel. u obsahů větších než 500000 IU/kg.

Tato metoda umožňuje stanovit obsah thiaminu (aneurinu, vitamínu B₁) v krmivech, koncentrátech a premixech. Limit detekce je 5 ppm.

Roztok je za horka ošetřen ředěnou kyselinou sírovou a potom enzymaticky hydrolyzován. Získaný roztok je podroben alkalické oxidaci. Vzniklý thiochróm je extrahován isobutanolem a stanoven fluorimetricky.

Standardní roztok thiaminu 100 μg/ml: rozpusťte 112,3 mg thiaminu-HCL, předem usušeného za vakua na stálou váhu, v 1000 ml 0,2 N kyseliny sírové (3.2). Pokud je roztok uchováván na chladném a tmavém místě, je upotřebitelný po dobu jednoho měsíce.

0,2 N kyselina sírová.

Čistý bisulfit sodný.

20 % (váhově vzhledem k objemu) roztok hexakyanoželezitanu draselného p.a.

25 % (váhově vzhledem k objemu) roztok hydroxidu draselného p.a.

Oxidační směs: smíchejte 2 ml roztoku hexakyanoželezitanu draselného (3.4) se 48 ml roztoku hydroxidu draselného (3.5). Tato směs je upotřebitelná jen 4 hodiny.

Isobutanol p.a.

2,5 N roztok octanu sodného.

Multienzymatický přípravek obsahující proteázu, fosfatázu a amylázu (např. clarasu).

96 % (V/V) ethanol.

Vodní lázeň.

Odstředivka (3500 ot./min.) se 3 až 50 ml trubicemi vybavenými skleněnými zábrusovými zátkami.

Fluorimetr.

Do každé ze dvou 250 ml odměrných baněk A a B vložte totožné množství jemně rozmělněného vzorku obsahujícího přibližně 100 μg thiaminu a 125 ml kyseliny sírové (3.2). Přidejte rovněž, pouze do baňky A, 1,0 ml standardního roztoku (3.1) (interní standard).

Silně protřepte lahve, umístněte je do vroucí vodní lázně a udržujte je tam po dobu 15 minut a příležitostně protřepávejte. Nechejte vychladnout na přibližně 45 ^oC. Přidejte do každé lahve 20 ml roztoku octanu sodného (3.8) a 0,5 g multienzymatického přípravku (3.9), potom nechejte stát po dobu 20 minut za pokojové teploty. Přidejte 20 ml roztoku octanu sodného (3.8), doplňte na objem vodou, homogenizujte a filtrujte. Odeberte filtráty A a B poté, co jste vyloučili prvních 15 ml. Připravte následující roztoky:

Do trubice odstředivky (4.2) dejte 5 ml filtrátu A a přibližně 10 mg bisulfitu sodného (3.3). Ponořte trubici do vroucí vodní lázně na 15 minut a potom nechejte vychladnout při pokojové teplotě.

Do trubice odstředivky (4.2) dejte 5 ml filtrátu A a 5 ml filtrátu B do jiné trubice odstředivky (4.2).

Přidejte k roztokům T, A a B 5 ml oxidační směsi (3.6) a o minutu později 10 ml isobutanolu (3.7). Zazátkujte trubice a silně protřepejte 5 vteřin. Nechejte stát jednu minutu a odstřeďte tak, aby se oddělily vrstvy. Z každé trubice přeneste 5 ml supernatantu isobutanolové vrstvy do každé 25 ml odměrné baňky, doplňte na objem ethanolem (3.10) a homogenizujte (= extrakty T, A a B).

Proveďte měření při vlnové délce, pro kterou dává fluorimetr optimální odezvu na fluorescenci trichrómu. Ozařujte při přibližně 365 nm.

Nastavte přístroj na nulu za použití extraktu T. Změřte intenzitu fluorescence extraktů A a B.

Obsah thiaminu v mg/kg vzorku je dán poměrem:

d · ba – b c

kde:

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

• 10 % relativní hodnoty u obsahů nižších než 500 mg/kg a

• 5 % rel. u obsahů rovnajících se nebo větších než 500 mg/kg.

Tato metoda umožňuje stanovit celkové množství kyseliny askorbové a kyseliny dehydroaskorbové (vitamín C) v krmivech, koncentrátech a premixech. Limit detekce je 5 ppm. Produkty jsou zařazeny do dvou skupin podle jejich předpokládaného obsahu vitamínu C:

Skupina A: obsahy nižší než 10 g/kg;

Skupina B: obsahy rovnající se nebo větší než 10 g/kg.

Vzorek je suspendován ve zředěném roztoku kyseliny metafosforečné a extrahován chloroformem. Vodní fáze je ošetřena roztokem 2,6-dichlorophenol-indophenolu, aby byla kyselina askorbová převedena na kyselinu dehydroaskorbovou, a potom roztokem 2,4-dinitrophenylhydrazinu. Vzniklý hydrazon je extrahován směsí ethyl acetátu, ledové kyseliny octové a acetonu. Roztok je chromatografován na koloně silika gelu, extrakt odpařen do sucha a zbytek rozpuštěn ve zředěné kyselině sírové. Optická hustota roztoku je měřena spektrofotometrem při 509 nm.

U produktů skupiny A je extrakt vzešlý z kolonové chromatografie dále podroben tenkovrstvé chromatografii na tenké vrstvě, aby se izoloval hydrazon.

Standardní roztok 0,05 % kyseliny L-askorbové: rozpusťte 50 mg kyseliny L-askorbové p.a. v přibližně 20 ml roztoku kyseliny metafosforečné (3.2) a doplňte do objemu 100 ml vodou. Připravujte bezprostředně před použitím.

10 % (váhově vzhledem k objemu) roztok kyseliny metafosforečné: po jejím rozmělnění v moždíři rozpusťte ve vodě 200 g kyseliny metafosforečné p.a. a doplňte do 2000 ml vodou. Skladujte při 4^oC. Roztok je stabilní po dobu jednoho týdne.

Chloroform p.a.

0,5 % (váhově vzhledem k objemu) roztok 2,6-dichlorophenol-indophenolu p.a. Připravte bezprostředně před použitím.

Filtrační pomůcka (S. a S. č. 121 nebo ekvivalent)

2 % kyselý roztok (váhově vzhledem k objemu) 2,4-dinitrophenylhydrazinu: rozpusťte 2 g 2,4-dinitrophenylhydrazinu ve 100 ml zředěné kyseliny sírové (25 ml kyseliny sírové p.a., d: 1,84, ředěná doplněním do 100 ml vodou). Tento roztok, je-li skladován v chladnu, vydrží jeden týden.

Dusík nebo

Kysličník uhličitý.

Směs ethyl acetátu p.a./ledové kyseliny octové/acetonu p.a.: 96/2/2 objemově.

Směs dichloromethanu p.a./ledové kyseliny octové: 97/3 objemově.

Silika gel, velikost částic: 0,05 až 0,2 mm.

Stahl silika gel stupeň H pro tenkovrstvou chromatografii.

Zřeďte kyselinu sírovou: dejte 105 ml vody do 200 ml odměrné baňky, doplňte na objem kyselinou sírovou p.a., d: 1,84.

Extrakční rozpouštědlo pro tenkovrstvou chromatografii: smíchejte 75 ml diethyletheru p.a., 25 ml ethyl acetátu p.a. a 4,0 ml 96 % (váhově vzhledem k objemu) kyseliny sírové p.a. Obnovte po 2 až 3 chromatogafiích.

Vodní lázeň vybavená termostatem nastaveným na 20 ^oC.

Odstředivka (3500 ot./min.) se 40 až 50 ml trubicemi vybavenými skleněnými zábrusovými zátkami.

Rotační vakuová odparka s 250 ml lahvemi.

Skleněné chromatografické trubice (délka: 100 mm, vnitřní průměr: 20 mm), se sintrovým diskem (např. Allihnovy trubice).

Spektrofotometr nebo kolorimetr s filtry s 10ml kyvetami.

Přístroj pro tenkovrstvou chromatografii se silika gelovými deskami (3.12) pokrytými do hloubky 0,5 až 0,6 mm. (Vhodné jsou již vyrobené desky.) Sušte desky po 2 a půl až 3 hodiny v sušárně při 120 až 130 ^oC. Nechejte vychladnout a potom udržujte v exsikátoru po nejméně 24 hodin před použitím.

Sušárna nastavená na 120 až 130 ^oC.

Do každé ze dvou 250 ml odměrných baněk (se skleněnými zábrusovými zátkami) A a B vložte totožné množství jemně rozmělněného vzorku obsahujícího přibližně 200 μg vitamínu C. Přidejte, pouze do baňky A, 0,4 ml standardního roztoku (3.1) a promíchejte jemným protřepáním (interní standard).

Přidejte do každé lahve 30 ml chloroformu (3.3) a 25 ml roztoku kyseliny metafosforečné (3.2) při 4 ^oC. Krátce protřepte a nechejte stát 10 až 15 minut. Přidejte 25 ml vody, zazátkujte lahve, silně protřepejte po 10 vteřin a nechejte stát 10 až 15 minut ve vodní lázni (4.1). Odstřeďte, aby se oddělila vodní fáze od chloroformové fáze. Provádějte postupy simultánně, jak je popsáno níže, u vodních extraktů A (interní standard) a B.

Za použití pipety přeneste 40 ml roztoku vodního supernatantu (lehce zakalený) získaného v 5.1 do reakční trubice vybavené skleněnou zábrusovou zátkou. Přidejte 0,5 až 1 ml roztoku 2,6-dichlorophenol-indophenolu (3.4) a promíchejte. Vytvoří se červené zbarvení, které by mělo přetrvat nejméně 15 minut. Potom přidejte přibližně 300 mg filtrační pomůcky (3.5), protřepejte a filtrujte přes suchý skládaný filtr. Filtrát nemusí být nutně čistý.

Za použití pipety přeneste 10 ml filtrátu získaného v 5.2 do trubice odstředivky (4.2), přidejte 2 ml roztoku 2,4-dinitrophenylhydrazinu (3.6) a promíchejte. Zaveďte rychle proud dusíku (3.7) nebo kysličník uhličitý (3.8) do trubice, zazátkujte trubici a ponořte ji na přibližně 15 hodin (přes noc) do vodní lázně (4.1).

Potom přidejte 3 ml vody, 20 ml směsi ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9) a přibližně 800 mg filtrační pomůcky (3.5). Zazátkujte trubici, silně protřepejte po dobu 30 vteřin a odstřeďte. Do lahve odparky umístěte 15 ml supernatantu a za sníženého tlaku odpařujte na rotační odparce (4.3), dokud neobdržíte olejnatý zbytek. Rozpusťte zbytek ve 2 ml směsi ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9) za ohřevu na 50 ^oC, nechejte vychladnout, přidejte 10 ml směsi dichloromethanu/ledové kyseliny octové (3.10) a promíchejte.

Naplňte chromatografickou trubici (4.4) do úrovně 30 ml směsí dichloromethanu/ledové kyseliny octové (3.10). Suspendujte (silně protřepávaje) 5 g silika gelu (3.11) ve 30 ml směsi dichloromethanu/ledové kyseliny octové (3.10); nalijte suspenzi do trubice. Nechejte stát a potom stlačte pod dusíkem (3.7) při nízkém tlaku. Přelijte do trubice roztok získaný v 5.3, vypláchněte láhev malým množstvím směsi dichloromethanu/ledové kyseliny octové (3.10) a přelijte do trubice, potom naplňte trubici směsí (3.10) a pokračujte ve vyplachování trubice stejnou směsí (3 až 4 dávky přibližně 5 ml), dokud není získán bezbarvý eluát. Vyřaďte část eluátu, který je zbarven žlutě.

Eluujte načervenalou zónu na vrcholu trubice směsí ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9), odeberte eluát a odpařte do sucha.

U produktů skupiny A (obsah vitamínu C nižší než 10 g/kg), rozpusťte zbytek ve 2,0 ml směsi ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9) a ihned chromatografujte na tenké vrstvě, jak je uvedeno v 5.5.

U produktů skupiny B (obsah vitamínu C se rovná nebo je větší než 10 g/kg), ošetřete olejnatý zbytek 4,0 ml zředěné kyseliny sírové (3.13), silně protřepejte, aby se zbytek zcela rozpustil a změřte optickou hustotu, jak je uvedeno v 5.6.

Následující postupy provádějte duplicitně. Umístněte 0,5 ml roztoku získaného v 5.4.4 v tenké čáře na destičku (4.6). Za použití extrakčního rozpouštědla (3.14) vyvíjejte po nejméně 20 minut v tanku vyplněném výpary rozpouštědla, dokud není růžově zbarvená hydrazonová zóna jasně oddělena. Nechejte volně vysušit. Označte hranice růžové zóny, seškrabejte zónu špachtlí a prášek přeneste kvantitativně do chromatografické trubice (4.4).

Eluujte postupně jednou 2 ml a dvakrát 1,5 ml směsi ethyl acetátu/ledové kyseliny octové/acetonu (3.9). Jímejte eluát do malé lahve (poslední díl musí být bezbarvý). Odpařte do sucha, ošetřete olejnatý zbytek 4,0 ml zředěné kyseliny sírové (3.13), silně protřepejte, aby se zbytek zcela rozpustil a změřte optickou hustotu.

Změřte optickou hustotu spektrofotometrem při 509 nm 20 až 30 minut po rozpuštění zbytku v kyselině sírové. Proveďte měření porovnáním se zředěnou kyselinou sírovou (3.13).

Proveďte slepý pokus za použití stejného postupu, ale bez vzorku.

Obsah vitamínu C ve vzorku v g na kg je dán poměrem:

c – a·2b – c·10d

kde:

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

• 10 % rel. u obsahů vitamínu C nižších než 10 g/kg a

• 5 % rel. u obsahů rovnajících se nebo větších než 10 g/kg.