PŘÍLOHA STANOVENÍ AFLATOXINU B1

A. METODA JEDNOROZMĚRNÉ TENKOVRSTVÉ CHROMATOGRAFIE

Tato metoda umožňuje stanovit obsah aflatoxinu B1 v těchto surovinách a krmných surovinách. Tuto metodu nelze použít, je-li přítomna citrusová pulpa. Dolní mezní hodnota stanovitelnosti je 0,01 mg/kg (10 ppb).

Pokud jsou přítomny rušivé látky, je nutné analýzu opakovat podle metody B (vysokoúčinné kapalinové chromatografie).

Vzorek se extrahuje chloroformem. Extrakt se filtruje a jeho alikvotní část se odebere a přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu. Eluát se odpaří a reziduum se rozpustí ve stanoveném objemu chloroformu nebo ve směsi benzenu a acetonitrilu. Alikvotní část tohoto roztoku se podrobí tenkovrstvé chromatografii. Množství aflatoxinu B₁ se stanoví z chromatogramu pod UV světlem buď vizuálně nebo fluorimetricky srovnáním se známými množstvími standardu aflatoxinu B₁. Identita aflatoxinu B₁ extrahovaného z krmiv musí být potvrzena stanoveným postupem.

Poznámka: Pokud není stanoveno jinak, všechna činidla musí být čistoty „p. a“.

Aceton.

Chloroform stabilizovaný 0,5 až 1,0 procentem 96 % (V/V) ethanolu.

N–hexan.

Methanol.

Diethylether, bezvodý, neobsahující peroxidy.

Směs benzenu a acetonitrilu: 98/2 (V/V).

Směs chloroformu (3.2) a methanolu (3.4): 97/3 (V/V).

Silikagel pro kolonovou chromatografii, velikost částic 0,05 až 0,20 mm.

Absorbent – vata, předem odtučněná chloroformem, nebo skelná vata.

Síran sodný, bezvodý, granulovaný.

Inertní plyn, např. dusík.

Kyselina chlorovodíková 1 N.

50 % (V/V) kyselina sírová.

Křemelina (hyflosupercel), promytá kyselinou.

Silikagel G–HR nebo ekvivalent, pro tenkovrstvou chromatografii.

Standardní roztok obsahující asi 0,1 μg aflatoxinu B₁ na 1 ml chloroformu (3.2) nebo směsi benzenu a acetonitrilu (3.6), připravený a zkontrolovaný, jak je uvedeno v bodu 7.

Standardní roztok pro testování jakosti obsahující asi 0,1 μg aflatoxinu B₁ a B₂ na 1 ml chloroformu (3.2) nebo směsi benzenu a acetonitrilu (3.6). Tyto koncentrace jsou orientační. Musí být upraveny tak, aby se získala stejná intenzita fluorescence u obou aflatoxinů.

Chloroform (3.2)/aceton (3.1): 9/1 (V/V), chromatografický tank s nenasycenou atmosférou;

Diethylether (3.5)/methanol (3.4)/voda: 96/3/1 (V/V), chromatografický tank s nenasycenou atmosférou;

Diethylether (3.5)/methanol (3.4)/voda: 94/4.5/1.5 (V/V), chromatografický tank s nasycenou atmosférou;

Chloroform (3.2)/methanol (3.4): 94/6 (V/V), chromatografický tank s nasycenou atmosférou;

Chloroform (3.2)/methanol (3.4): 97/3 (V/V), chromatografický tank s nasycenou atmosférou.

Drtič – mixer.

Třepačka nebo magnetická míchačka.

Skládané filtrační papíry, Schleicher a Schüll č. 588 nebo ekvivalentní, průměr 24 cm.

Skleněná chromatografická trubice (vnitřní průměr 22 mm, délka 300 mm) s teflonovým kohoutem a 250 μl zásobníkem.

Rotační vakuová odparka, s baňkou o objemu 500 ml a kulatým dnem.

Erlenmeyerovy baňky o objemu 500 ml, se zábrusovými zátkami.

Zařízení pro tenkovrstvou chromatografii.

Skleněné desky pro tenkovrstvou chromatografii, 200 x 200 mm, se připraví takto (uvedená množství stačí pro pět desek): dát 30 g silikagelu G-HR (3.15) do Erlenmeyerovy baňky, přidat 60 ml vody, zazátkovat a protřepávat 1 minutu. Rozprostřít suspenzi na desky takovým způsobem, aby se vytvořila stejnoměrná vrstva o tloušťce 0,25 mm. Nechat uschnout na vzduchu a poté uchovat v desikátoru obsahujícím silikagel. Před použitím aktivovat desky jednu hodinu v sušárně při 110 °C.

Desky připravené k použití jsou vyhovující, pokud vykazují podobné výsledky jako desky připravené podle uvedeného postupu.

UV lampa dlouhovlnná (360 mm). Intenzita záření musí být dostatečná, aby skvrna 1 ng aflatoxinu B₁ na desce pro tenkovrstvou chromatografii byla na vzdálenost 10 cm od lampy ještě jasně rozeznatelná.

Odměrné zkumavky o objemu 10 ml, s polyethylenovými zátkami.

UV spektrofotometr.

Fluorimetr (volitelný).

Rozmělnit vzorek takovým způsobem, aby celý prošel sítem s oky o velikosti 1 mm (v souladu s doporučením ISO R 565).

Do Erlenmeyerovy baňky o objemu 500 ml dát 50 g rozemletého a homogenizovaného vzorku. Přidat 25 g křemeliny (3.14), 25 ml vody a 250 ml chloroformu (3.2). Zazátkovat, protřepávat nebo promíchávat 30 minut třepačkou (4.2) a přefiltrovat přes skládaný filtrační papír (4.3). Odstranit prvních 10 ml filtrátu, poté sebrat 50 ml.

Do spodní části chromatografické trubice (4.4) vložit zátku z vaty nebo ze skelné vaty (3.9), naplnit trubici se do dvou třetin chloroformem (3.2), a poté přidat 5 g síranu sodného (3.10).

Ověřit, že horní povrch vrstvy síranu sodného je zcela rovný, a poté přidat po malých dávkách 10 g silikagelu (3.8). Po každém přidání opatrně zamíchat, aby se odstranily vzduchové bubliny. Nechat 15 minut stát, a poté opatrně přidat 15 g síranu sodného (3.10). Nechat kapalinu klesnout až k hornímu povrchu vrstvy síranu sodného.

Smíchat 50 ml extraktu získaného podle bodu (5.2) se 100 ml n-hexanu (3.3) a směs kvantitativně přelít do kolony. Nechat kapalinu klesnout až k hornímu povrchu vrstvy síranu sodného. Přidat 100 ml diethyletheru (3.5) a znovu nechat kapalinu klesnou až k hornímu povrchu vrstvy síranu sodného. Během tohoto postupu dbát na to, aby rychlost průtoku byla 8 až 12 ml za minutu a aby kolona nevyschla. Odstranit vytečenou kapalinu. Poté eluovat 150 ml směsi chloroformu a methanolu (3.7) a sebrat celý eluát.

Odpařit eluát do sucha pod proudem inertního plynu (3.11) v rotační vakuové odparce (4.5) při teplotě nižší než 50 °C. Reziduum kvantitativně převést za použití chloroformu (3.2) nebo směsi benzenu a acetonitrilu (3.6) do odměrné zkumavky o objemu 10 ml (4.10). Koncentrovat roztok pod proudem inertního plynu (3.11), a poté doplnit objem na 2 ml za použití chloroformu (3.2) nebo směsi benzenu a acetonitrilu (3.6).

Na desku pro tenkovrstvou chromatografii (4.8) nanést 2 cm od spodní hrany a v odstupech po 2 cm tyto objemy standardních roztoků a extraktu:

• 10, 15, 20, 30 a 40 μl standardního roztoku alfatoxinu B₁ (3.16),

• 10 μl extraktu získaného podle bodu 5.3 a k tomu 20 μl standardního roztoku (3.16),

• 10 a 20 μl extraktu získaného podle bodu 5.3.

Chromatogram se vyvíjí ve tmě za použití jednoho z vyvíjecích rozpouštědel (3.18). Výběr rozpouštědla se musí provést předem nanesením 25 μl jakostního standardního roztoku (3.1) na desku a musí se ověřit, zda jsou aflatoxiny B₁ a B₂ při vyvíjení zcela odděleny.

Nechat rozpouštědla odpařit ve tmě a poté ozářit desku UV paprsky ze vzdálenosti 10 cm od lampy (4.9). Skvrny aflatoxinu B₁ modře fluoreskují.

Stanovení se provádí buď vizuálně nebo fluorimetricky podle těchto pokynů:

Množství aflatoxinu B₁ v extraktu se stanoví porovnáním intenzity fluorescence skvrn extraktu s intenzitou fluorescence skvrn standardního roztoku. V případě potřeby se interpoluje. Fluorescence získaná překrytím extraktu přes standardní roztok musí být silnější než fluorescence 10 ml extraktu a nesmí být viditelná více než jedna skvrna. Pokud je intenzita fluorescence 10 μl extraktu silnější než intenzita fluorescence 40 μl standardního roztoku, rozředit extrakt 10 krát nebo 100 krát chloroformem (3.2) nebo směsí benzenu a acetonitrilu (3.6) a poté znovu podrobit tenkovrstvé chromatografii.

Intenzita fluorescence skvrn aflatoxinu B₁ se měří fluorimetrem (4.12) při excitační vlnové délce 365 nm a emisní délce 443 nm. Množství aflatoxinu B₁ ve skvrnách extraktu se stanoví porovnáním jejich intenzit fluorescence s intenzitami skvrn standardního roztoku aflatoxinu B₁.

Potvrzení identity aflatoxinu B₁ v extraktu se provede takto:

Na chromatogram získaný podle bodu 5.4 nastříkat kyselinu sírovou (3.13). Fluorescence skvrn aflatoxinu B₁ se musí pod UV zářením změnit z modré na žlutou.

Níže popsané pracovní postupy se musí provádět přesně podle schématu uvedeném na obrázku 3.

Nanesení roztoků

Narýsovat na desku (4.8) dvě přímky rovnoběžné se dvěma přilehlými stranami (6 cm od každé strany), určené k vymezení migrace čel rozpouštědel. Nanést na desku pomocí kapilárních pipet nebo injekčních mikrostříkaček tyto roztoky:

• v bodu A: objem vyčištěného extraktu vzorku získaného podle bodu 5.3, který obsahuje asi 2,5 nm aflatoxinu B₁,

• v bodech B a C: 25 μl standardního roztoku (3.16).

Chromatogram se vyvíjí za použití vyvíjecího rozpouštědla (3.18.1) [vrstva o tloušťce 1 cm v chromatografickém tanku s nenasycenou atmosférou] ve tmě ve směru I, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne k vymezující linii.

Vyjmout desku z tanku a nechat oschnout pět minut ve tmě a při pokojové teplotě. Poté stříkat kyselinu chlorovodíkovou (3.12) na pásek o šířce 2,5 cm, který pokrývá body A a B (na obrázku 3 vyznačeno šrafovaně), dokud pásek neztmavne, přičemž zbytek desky je chráněn skelným papírem. Nechat působit 10 minut ve tmě, a poté vysušit desku proudem vzduchu při pokojové teplotě.

Poté se chromatogram vyvíjí za použití vyvíjecího rozpouštědla (3.18.1) [vrstva o tloušťce 1 cm v chromatografickém tanku s nenasycenou atmosférou] ve tmě ve směru II, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne k vymezující linii. Vyjmout desku z chromatického tanku a nechat oschnout pět minut ve tmě a při pokojové teplotě.

Pozorovat chromatogram pod UV světlem (4.9) a ověřit tyto znaky:

• a) Objevení se modré fluoreskující skvrny aflatoxinu B₁ pocházející ze standardního roztoku naneseného v bodu C (migrace ve směru I).

Obsah aflatoxinu B₁ v mikrogramech na 1 kg vzorku (ppb) se vypočítá pomocí vzorce:

S·Y·VW·X

kde:

X a Y jsou příslušné objemy standardního roztoku aflatoxinu B₁ v mikrolitrech (3.16) a extraktu, který má stejnou intenzitu fluorescence;

Obsah aflatoxinu B₁ v mikrogramech na 1 kg vzorku (ppb) se vypočítá pomocí vzorce:

S·VW·Y

kde:

Připravit standardní roztok aflatoxinu B₁ v chloroformu (3.2) nebo směsi benzenu a acetonitrilu (3.6), jehož koncentrace je od 8 do 10 μg/ml. Stanovit absorpční spektrum mezi 330 a 370 nm za použití spektrofotometru (4.11).

Změřit optickou hustotu (A) při 363 nm v případě chloroformového roztoku nebo při 348 nm v případě roztoku směsi benzenu a acetonitrilu.

Vypočítat koncentraci aflatoxinu B₁ v mikrogramech na 1 ml roztoku pomocí tohoto vzorce:

pro chloroformový roztok;

pro roztok ve směsi benzenu a acetonitrilu..

Ve tmě provést příslušná ředění s cílem získat standardní pracovní roztok, jehož koncentrace aflatoxinu B₁ je asi 0,1 μg/ml. Pokud se roztok skladuje v chladničce při 4 °C, je stálý po dobu dvou týdnů.

Nanést na desku (4.8) 5 μl standardního roztoku obsahujícího 8 až 10 μl aflatoxinu B₁ na 1 ml (7.1). Vyvinout chromatogram, jak je uvedeno v bodu 5.4. Při UV světle by měla být viditelná pouze jedna skvrna a v místě původního nanesení by neměla být znatelná žádná fluorescence.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení, které u jednoho vzorku provedl stejný analytik, nesmí překročit:

• 25 % nejvyššího výsledku pro obsahy aflatoxinu B₁ od 10 do 20 μg/kg,

• 5 μg absolutní hodnoty pro obsahy od 20 do 50 μg/kg,

• 10 % nejvyššího výsledku pro obsahy vyšší než 50 μg/kg.

Viz „Poznámky“, část C bod 2.

Tato metoda slouží ke stanovení aflatoxinu B1 v krmivech včetně takových, která obsahují citrusovou pulpu. Dolní mezní hodnota stanovitelnosti je 0,001 mg/kg (1 ppb).

Vzorek se extrahuje chloroformem. Extrakt se filtruje a jeho alikvotní část se čistí na patroně s Florsilem a následně na patroně s C18. Konečného rozdělení a stanovení se dosáhne vysokoúčinnou kapalinou chromatografií (HPLC) s použitím kolony s reverzní fází C18 a s následnou postkolonovou derivatizací vodným roztokem jódu a fluorescenční detekcí.

Mykotoxiny jsou mimořádně toxické látky. Manipulace s nimi by se měla provádět v určených digestořích. Zvláštní opatření je třeba přijmout v případě, kdy toxiny jsou v suchém stavu, protože jsou elektrostatické a mohou se rozptylovat do pracovního prostředí.

Chloroform, stabilizovaný 0,5–1,0 % ethanolu (hmotnostně). Viz poznámku 10.2.

Methanol, čistoty HPLC, pro přípravu podle bodu 3.6.

Aceton

Acetonitril, čistoty HPLC

Eluční roztoky – připravují se jeden den před použitím nebo se z nich odstraní vzduch ultrazvukem.

Směs acetonu (3.3) a vody 98 + 2 (v/v)

Směs vody a methanolu (3.2), 80 + 20 (v/v)

Směs vody a acetonu (3.3), 85 + 15 (v/v)

Mobilní fáze pro HPLC

Směs vody, methanolu (3.2) a acetonitrilu (3.4), 130 + 70 + 40 (v/v/v).

Poznámka: Složení mobilní fáze může být potřeba upravit v závislosti na vlastnostech použité kolony HPLC.

Nasycený roztok jódu: Do 400 ml vody se přidá 2 g jódu. Míchá se nejméně 90 minut a potom se přefiltruje přes membránový filtr (4.15). Připravený roztok se musí chránit před světlem, aby nedocházelo k fotodegradaci.

Kyselinou promytý Celit 545 nebo ekvivalentní

Florisilová patrona (Waters SEP-PAK) nebo ekvivalent

Patrona s C18 (Waters SEP-PAK) nebo ekvivalent

Inertní plyn, např. dusík

Aflatoxin B1, standardní roztok v chloroformu, koncentrace 10 μg/ml Koncentrace roztoku se zkontroluje takto: na spektrofotometru (4.23) se stanoví absorpční spektrum při 330 až 370 nm. Změří se absorbance (A) maxima v oblasti kolem 363 nm. Vypočítá se koncentrace aflatoxinu B1 (X) v mikrogramech na mililitr roztoku podle tohoto vzorce:

Koncentraœ (μg/ml) = 312 × A × 100022300 = 13,991 × A

Aflatoxin B1, zásobní standardní roztok v chloroformu

Do 50 ml odměrné baňky se kvantitativně převede 2,5 ml standardního roztoku aflatoxinu B1 (3.12) a doplní se po značku chloroformem (3.1). Roztok se skladuje v chladu (4 °C) a temnu v dobře uzavřené nádobě, obalené fólií z hliníku.

Aflatoxin B1, kalibrační roztoky pro HPLC

Na přípravu těchto roztoků se používá sklo předem umyté v kyselině (viz odstavec 4, Přístroje)

Kalibrační roztok 4 ng/ml

Odměrná baňka se standardním zásobním roztokem (3.12.1) zabalená ve fólii z hliníku se nechá zahřát na pokojovou teplotu (několik hodin). Do 50 ml odměrné baňky se kvantitativně převede 400 μl standardního zásobního roztoku (200 ng aflatoxinu B1) a rozpouštědlo se odpaří do sucha v proudu inertního plynu.

Zbytek po odpaření se rozpustí v asi 20 ml směsi voda-aceton (3.5.3), doplní se touto směsí po značku a dobře se promíchá.

Kalibrační roztok 3 ng/ml

Do 10 ml odměrné baňky se kvantitativně převede 7,5 ml kalibračního roztoku (3.13.1), doplní se směsí voda-aceton (3.5.3) po značku a dobře se promíchá.

Kalibrační roztok 2 ng/ml.

Do 50 ml odměrné baňky se kvantitativně převede 25 ml kalibračního roztoku (3.13.1), doplní se směsí voda-aceton (3.5.3) po značku a dobře se promíchá.

Tímto roztokem se použije jako referenční standard používaný pro opakovaný nástřik během HPLC (5.5.)

Kalibrační roztok 1 ng/ml

Do 10 ml odměrné baňky se kvantitativně převede 2,5 ml kalibračního roztoku (3.13.1), doplní se směsí voda-aceton (3.5.3) po značku a dobře se promíchá.

Ampule obsahující směs aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 v koncentracích přibližně 1, 0,5, 1 a 0,5 μg/ml, v 1 ml chloroformu

Roztok pro chromatografický test

Obsah ampule (3.14) se kvantitativně převede do zkumavky se skleněnou zátkou nebo do lahvičky se šroubovacím uzávěrem. Potom se 40 μl tohoto roztoku kvantitativně převede do zkumavky předem vymyté v kyselině, která má skleněnou zátku (4.22). Chloroform se odpaří v proudu inertního plynu (3.11) a zbytek po odpaření se rozpustí v 10 ml směsi voda-aceton (3.5.3).

Činidla pro potvrzující test (6)

Chlorid sodný, nasycený roztok

Síran sodný, bezvodý, granulovaný

Upozornění: Používání skla pro vodné roztoky aflatoxinů, které nebylo umyto v kyselině, může způsobit ztráty. Zvláštní péče musí být věnována novému sklu a sklu na jedno použití, jako jsou např. lahvičky do autosampleru a Pasteurovy pipety. Z tohoto důvodu se laboratorní sklo, které přichází do styku s vodnými roztoky aflatoxinů, ponoří na několik hodin do zředěné kyseliny (např. kyseliny sírové o koncentraci 2 mol/l), potom se dobře opláchne destilovanou vodou, aby se odstranily veškeré zbytky kyseliny (např. třikrát a kontroluje se pH papírkem). V praxi je tento postup nezbytný pro baňky s kulatým dnem (4.4), odměrné baňky, odměrné válce, lahvičky nebo zkumavky používané na kalibrační roztoky a konečné extrakty (zejména lahvičky do autosampleru) a Pasteurovy pipety, pokud se používají pro přelití kalibračních roztoků nebo extraktů.

Drtič – mixér.

Síto s oky o velikosti 1,0 mm (ISO R 565)

Mechanická třepačka

Rotační vakuová odparka sabaňka s kulatým dnem o objemu 150 až 250 ml

Vysokoúčinný kapalinový chromatograf, vstřikovací systém se smyčkou vhodnou pro nástřik 250 ml. Viz návod k použití od výrobce pro částečnou nebo úplnou náplň smyčky.

Analytická kolona pro HPLC: náplň C18 3 μm nebo 5 μm

Bezpulzní čerpadlo pro jodové postkolonové činidlo

T-spojka s nulovým mrtvým objemem Valco, korozivzdorná ocel, (1/16 × 0,75 mm)

Spirálová reakční smyčka; z teflonu nebo korozivzdorné oceli. Rozměry 3000×0,5 mm až 5000×0,5 mm jsou vhodné v kombinaci s HPLC kolonami s náplní 3 μm nebo 5 μm.

Termostatem řízená vodní lázeň nastavená na 60 °C, schopná regulace teploty v rozmezí ± 0,1 °C.

Fluorescenční detektor s excitační vlnovou délkou 365 nm a emisní vlnovou délkou 435 nm. (Pro detektory s filtry: emisní vlnová délka >400 nm). Detektor musí být schopný detekce nejméně 0,05 ng aflatoxinu B1. Doporučuje se určitý zpětný tlak (např. restriktor, teflonová nebo nerezová smyčka připojená k výstupu detektoru), aby se potlačily vzduchové bubliny v průtočné kyvetě.

Zapisovač

Elektronický integrátor (nepovinné)

Skládaný filtrační papír o průměru 24 cm, Macherey-Nagel 617 ¼ nebo ekvivalent

Membránový filtr s póry 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 nebo ekvivalent

Erlenmayerova baňka o objemu 500 ml se zábrusovou zátkou

Skleněná kolona (vnitřní průměr přibližně 1 cm, délka přibližně 30 cm) se zakončením Luer

Chloroformu odolný uzavírací kohout Luer (např. Bio-Rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514) nebo ekvivalent

Chemicky odolné injekční stříkačky, 10 ml Luer konektor

Injekční stříkačky vhodné pro dávkování 250 μl do přístroje HPLC (4.5)

Injekční mikrostříkačky 100 μl na přípravu kalibračních roztoků (zajistí se, aby přesnost byla nejméně 2 % hmotnostní)

Kalibrované zkumavky o obsahu 10 ml se zábrusovými zátkami

Spektrofotometr vhodný pro měření v UV oblasti spektra

Vybavení pro potvrzovací test (6)

Kyselinou vypláchnutá dělicí nálevka o objemu 100 ml s teflonovým uzavíracím kohoutem

Tepelný blok, 40–50 °C

Vzorek se rozmělní takovým způsobem, aby prošel sítem (4.2).

Do Erlenmayerovy baňky se naváží 50 g připraveného zkušební vzorku (4.16).

Ke zkušební navážce (5.2) v Erlenmayerově baňce se přidá 25 g Celitu (3.8), 250 ml chloroformu (3.1) a 25 ml vody. Baňka se zazátkuje a třepe se 30 minut na mechanické třepačce (4.3). Přefiltruje se přes skládaný filtrační papír (4.14) a jímá se 50 ml filtrátu. Je-li to nezbytné, odebere se alikvotní část filtrátu a rozředí se do 50 ml chloroformem (3.1), aby koncentrace aflatoxinu B1 nebyla vyšší než 4 ng/ml.

Upozornění:

• laboratoř, kde se provádí analýzy, se náležitě chrání před denním světlem. Účinně se toho dosáhne použitím např.:

  • (i) fólií absorbující UV záření na oknech v kombinaci s tlumeným světlem (ne přímé sluneční světlo),
  • (ii) záclonami nebo roletami v kombinaci s umělým osvětlením (vhodné jsou zářivky).

• Roztoky obsahující aflatoxiny se musí co nejvíce chránit před světlem (uchovávat v temnu, chránit fólií z hliníku).

Uzavírací kohout (4.18) se spojí s kratší stopkou Florisilové patrony (3.9) (viz obr. 1). Patrona se promyje a odstraní se z ní vzduch 10 ml chloroformu (3.1) tak, že se 8 ml pomocí injekční stříkačky (4.19) protlačí rychle patronou přes uzavírací kohout. Delší stopka patrony se připojí ke skleněné koloně (4.17) a zbývající 2 ml chloroformu se protlačí přes patronu do kolony. Uzavírací kohout se uzavře. Injekční stříkačka se odpojí.

Filtrát, který se získá podle odstavce 5.3. se přidá na spojenou kolonu a patronu a nechá se stéci. Kolona s patronou se propláchne 5 ml chloroformu (3.1) a poté 20 ml methanolu (3.2) a spojené eluáty se odstraní. Během těchto úkonů se zajistí, aby kolona s patronou nevyschla.

Aflatoxin B1 se eluuje 40 ml směsi aceton-voda (3.5.1) a celý eluát se jímá do odpařovací baňky rotační odparky (4.4). Na rotační odparce při teplotě 40–50 °C se koncentruje eluát, než se dokončí destilace acetonu. (Pozn.: V baňce zůstane asi 0,5 ml kapaliny. Testy ukázaly, že další odpařování není škodlivé a že pokud zbude asi 0,5 ml kapaliny, již tam není významné množství acetonu. Zbytky acetonu by mohly vést ke ztrátám aflatoxinu B1 na patronce s náplní C18.) Přidá se 1 ml methanolu (3.2), intenzivním mícháním se rozpustí aflatoxin B1 na stěnách baňky, přidají se 4 ml vody a promíchá se. Patrona se sejme a oddělí od kolony. Skleněná kolona se opláchne vodou a použije se pro čištění s C18.

Uzavírací kohout (4.18) se spojí s kratší stopkou patrony s C18 (3.10) (viz obr. 1). Patrona se zaplní a odstraní se z ní vzduch rychlým protlačením 10 ml methanolu (3.2) pomocí injekční stříkačky (4.19) přes uzavírací kohout. (Bubliny vzduchu jsou v patroně viditelné jako světlé skvrny na jinak šedavém pozadí.) Nanese se 10 ml vody a 8 ml se nechá volně protéct přes patronu. (Při přechodu methanolu na vodu je třeba vyhnout se pronikání vzduchu do patrony.) Delší stopka patrony se připojí ke skleněné koloně (4.17) a zbývající 2 ml vody se protlačí přes patronu v koloně. Uzavírací kohout se uzavře. Injekční stříkačka se odpojí.

Extrakt, který se získá podle odstavce 5.4.1.2, se kvantitativně převede do skleněné kolony (4.17), přičemž odpařovací baňka se dvakrát vypláchne 5 ml směsi voda-methanol (3.5.2), a nechá se stéci. Během těchto úkonů se zajistí, aby kolona s patronou nevyschla. (Pokud se vytvoří vzduchové bubliny v zúžení blízko patrony, zastaví se průtok a poklepáváním na skleněnou kolonu se vzduchové bubliny odstraní. Poté se pokračuje.) Kolona s patronou se dále promyjí 25 ml směsi voda-methanol (3.5.2), eluát se vylije. Aflatoxin B1 se eluuje 50 ml směsi voda-aceton (3.5.3.) a celý eluát se jímá do 50 ml odměrné baňky. Baňka se doplní vodou po značku a promíchá se. Výsledný roztok se použije k chromatografii.

Obvykle není filtrace konečného extraktu před HPLC nutná. Pokud je považována za nutnou, nesmí se používat celulózový filtr, protože by to mohlo vést ke ztrátám aflatoxinu B1. Vhodný je teflonový filtr.

(viz obrázek 2 pro sestavení zařízení.) Poskytne se dostatek času pro kondicionování a stabilizování přístrojů.

Rychlost průtoku mobilní fáze a postkolonového činidla je pouze informativní. Může se upravit podle vlastností kolony HPLC.

Odezva detektoru na aflatoxin B1 závisí na teplotě, proto je třeba vyrovnat posun (viz obr. 3). Pravidelným (např. každý třetí vstřik) nástřikem stanoveného množství referenčního standardu aflatoxinu B1 (3.13.3) lze napravit vrcholové hodnoty aflatoxinu B1 mezi těmito referenčními standardy použitím střední hodnoty odezvy za předpokladu, že rozdíl mezi dvěma odezvami po sobě následujících referenčních standardů je velmi malý (<10 %). Proto je nutné provádět nástřik bez přerušení. Pokud je nutné přerušení, poslední a první nástřik před přerušením musí být referenční standard (3.13.3). Protože kalibrační křivka je lineární a prochází počátkem, je možné přímo stanovit obsah aflatoxinu B1 v extraktu vzorku s ohledem na přilehlý standard.

Čerpadlo přístroje HPLC (4.5) se nastaví tak, aby průtok mobilní fáze (3.6) pro HPLC kolonu (4.6) s náplní 5 μm byl 0,5 ml/min a s náplní 3 μm byl 0,3 ml/min.

Čerpadlo (4.7) se nastaví tak, aby průtok nasyceného vodného roztoku jódu (3.7) byl 0,2 až 0,4 ml/min. Jako hrubé vodítko: průtok nastavený na 0,4 ml/min je žádoucí v kombinaci s průtokem mobilní fáze (3.6) 0,5 ml/min a průtok 0,2 ml/min pro průtok mobilní fáze 0,3 ml/min.

Fluorescenční detektor (4.11) se nastaví na excitační vlnovou délku 365 nm a emisní délku 435 nm (přístroje s filtry > 400 nm). Citlivost detektoru pro 1 ng aflatoxinu B1 se nastaví asi na 80 % celkového rozsahu stupnice pera.

Pro všechny roztoky se nastřikuje množství 250 μl podle návodu k použití od výrobce vstřikovacího systému.

Provede se nástřik roztoku pro chromatografický test (3.14.1). Sedla by měla být méně než 5 % součtu výšek píků přilehlých píků.

Před každým souborem analýz se opakovaně nastřikuje referenční standard (3.13.3), dokud se nezískají stabilní plochy píků. (Pozn.: Odezva aflatoxinu B1 mezi po sobě následujícími vstřiky se nesmí lišit o více než 6 %). Po kontrole stability systému se bezodkladně provede kontrola linearity (5.5.7).

Provede se nástřik kalibračních roztoků aflatoxinu B1 (3.13.1 až 3.13.4). Po každém třetím nástřiku se dávkuje referenční standard (3.13.3) pro nápravu posunu v odezvě. (Pozn.: Rozdíl mezi odezvami referenčních standardů se v průběhu 90 minut nesmí lišit o více než 10 %). Posun se napraví podle vzorce v odstavci 7. Kalibrační graf by měl být lineární a procházet počátkem v rozsahu dvojnásobné směrodatné chyby odhadu Y. Zjištěné hodnoty se nesmí lišit o více než 3 % nominální hodnoty. Pokud jsou splněny tyto podmínky, pokračuje se bezodkladně. Pokud tomu tak není, než se pokračuje, musí se určit a napravit zdroje problému.

Provede se nástřik přečištěného extraktu (5.4.2.2). Vždy po dvou vzorcích se provede nástřik referenčního standardu (3.13.3) podle následujícího pořadí: referenční standard – extrakt – extrakt – referenční standard – extrakt – extrakt – referenční standard atd.

Ke konečnému extraktu získanému podle odstavce 5.4.2.2 se přidá 5 ml roztoku chloridu sodného (3.15.1). Extrahují se třikrát 2 ml chloroformu (3.1) v dělicí nálevce (4.24.1) po dobu 1 minuty. Spojené chloroformové extrakty se převedou přes asi 1 g síranu sodného (3.15.2) do 10 ml zkumavky. Může být použita např. malá dělicí nálevka (o průměru 4 cm) s kouskem vaty v zúžení, pokrytým síranem sodným.

Vrstva síranu sodného se propláchne několika ml chloroformu a eluát se jímá do stejné zkumavky. Chloroformový extrakt se odpaří do sucha v té samé zkumavce za použití tepelného bloku (4.24.2) a znovu se rozpustí v 1 ml chloroformu.

Viz metoda A v příloze směrnice Rady 76/372/EHS bod 5.6.2.

Obsah aflatoxinu B1 (μg/kg) vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

aflatoxin B1 (μg/kg)= m × VextVm × M × VfVc

kde:

množství aflatoxinu B1 v ng, vypočtené z píku aflatoxinu B1 ve vzorku vypočtené takto:

m = P P_(vz)P st1 + Pst2 × 2 rst

Pokud je dodržen postup, změní se vzorec takto:

• aflatoxin B1 (μg/kg) = 20 × m

Výpočty výsledků mohou být také provedeny z výšek píků.

Viz odstavec 10.1.

Viz odstavec 10.1.

Na mezinárodní úrovni byla provedena společná studie(Egmond, H. P. van, Heisterkamp, S. H. a Paulsch, W. E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29.) pro krmné směsi, jejíž výsledky opakovatelnosti a reprodukovatelnosti jsou uvedeny v tabulce 1. Výraz opakovatelnost (r) je zde definován jako největší poměr, který není významný na úrovni pravděpodobnosti 95 % pro porovnání dvou měřených údajů stejného vzorku v téže laboratoři a za podobných podmínek. Výraz reprodukovatelnost (R) je zde definován podobně pro porovnání dvou různých laboratoří. V souladu s normou ISO(ISO 3534–1977.) a s rozhodnutím Komise 89/610/EHS(Úř. věst. L 351, 2.12. 1989, s. 39.) jsou hodnoty r a R v tabulce uváděny také v podobě variačního koeficientu.

Tabulka 1 Opakovatelnost (r) a reprodukovatelnost (R) vyjádřené jako poměr odpovídajících variačních koeficientů (15 laboratoří)

Pokud se ke stabilizaci chloroformu používá jiný stabilizátor než ethanol, může docházet ke změně adsorpční charakteristiky florisilové patrony. Pokud není popsaný chloroform dostupný, musí se to ověřit v souladu s odstavcem 10.3.

Správné použití metody se ověřuje opakovanými měřeními schválených referenčních materiálů. Pokud nejsou k dispozici, provedení metody se ověřuje testem výtěžnosti na fortifikovaných slepých vzorcích. Standardní odchylka od skutečné hodnoty vyjádřená v % skutečné hodnoty musí být v rozmezí –20 až +10 %.

Vzorky obsahující více než 5 % tuků musí být odtučněny petroletherem (bod varu 40 – 60 ^oC) po přípravách uvedených v 5.1.

V takových případech musí být výsledky analýzy vyjádřeny na hmotnost původního neodtučněného vzorku.

Reprodukovatelnost výsledků, tj. odchylky mezi výsledky získanými dvěma nebo více laboratořemi u téhož vzorku, byla vyhodnocena takto:

± 50 % střední hodnoty výsledků pro střední hodnoty aflatoxinu B₁, od 10 do 20 μg/kg;

± 10 μg/kg na základě střední hodnoty pro střední hodnoty od 20 do 50 μg/kg;

± 20 % střední hodnoty pro střední hodnoty nad 50 μg/kg.