PŘÍLOHA

1. STANOVENÍ ZINKBACITRACINU— difúzí na agaru —

Metoda je určena pro stanovení obsahu zinkbacitracinu v krmivech a premixech. Dolní mez stanovitelnosti obsahu je 2 mg/kg (2 ppm)(1 mg zinkbacitracinu se rovná 42 mezinárodních jednotek (i.u).).

Vzorek se extrahuje při pH 2 se směsí methanolu/vody/kyseliny chlorovodíkové a roztokem síranu sodného. Přidání síranu sodného má urychlit rozpuštění solí mědi, které mohou být při stanovení obsahu překážkou. Extrakt upravený na pH 6,5 se koncentruje (je-li to nezbytné) a rozředí. Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze zinkbacitracinu na agaru, na nějž byl naočkován Micrococcus luteus. Difúze se projevuje vytvořením inhibičních zón mikroorganismu. Průměr těchto zón je považován za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotik pro stupnici použitých koncentrací.

Kultivační médium (4.1) v šikmých zkumavkách se naočkuje mikroorganismem Micrococcus luteus (flavus) a 24 hodin se nechá inkubovat při teplotě 30 °C. Kultura se skladuje v chladničce při teplotě okolo 4 ^oC. Očkování se obnovuje každé dva týdny.

Čerstvá kultura na agaru (3.1) v šikmé zkumavce se sklidí za pomoci 2 až 3 ml roztoku chloridu sodného (4.3). Touto suspenzí se naočkuje 250 ml kultivačního média (4.1) umístěného do Rouxovy baňky a nechá se inkubovat po dobu 18 až 20 hodin při teplotě 30 ^oC. Porost se sklidí pomocí 25 ml roztoku chloridu sodného (4.3) a zamíchá se. Suspenze se rozředí v poměru 1/10 roztokem chloridu sodného (4.3). Průchod světla suspenze musí být okolo 75 %, měřeno při 650 nm a tloušťce 1 cm ve srovnání s roztokem chloridu sodného (4.3). Tato suspenze může být uchována po dobu jednoho týdne při teplotě okolo 4 ^oC.

Roztok chloridu sodného 0,8 % (hmot./obj.): 8 g chloridu sodného se rozpustí ve vodě a rozředí se na 1000 ml; sterilizuje se.

Směs methanolu, vody a kyseliny chlorovodíkové (4.6):

80/17,5/2,5 (obj./obj./obj.).

Kyselina chlorovodíková (d: 1,18 až 1,19).

Kyselina chlorovodíková (0,1 M).

1M roztok hydroxidu sodného.

0,5 M roztok síranu sodného.

Roztok bromokrezolového nachu 0,04 % (hmot./obj.): rozpustí se 0,1 g bromokrezolového nachu v 18,5 ml roztoku hydroxidu sodného 0,01 M. Objem se dorovná vodou na 250 ml a zamíchá se se.

Standardní substance: zinkbacitracin známé aktivity (v i.u.).

Odváží se přesné množství standardního zinkbacitracinu (4.11) odpovídající 1050 i.u. (podle uvedené aktivity). Přidá se 5 ml 0,1 M kyseliny chlorovodíkové (4.7) a po dobu 15 minut se nechá usazovat. Přidá se 30 ml vody, pH se tlumivým fosfátovým roztokem (4.5) (přibližně 4 ml) upraví na 4,5 a objem se vodou dorovná na 50 ml a dobře zamíchá (1 ml = 21 i.u.).

Z tohoto zásobního roztoku se postupným ředěním fosfátovým tlumivým roztokem (4.5) připraví následující roztoky:

Odváží se 2,0 až 5,0 g vzorku se, přidá se 29,0 ml směsi (4.4) a 1,0 ml roztoku síranu sodného (4.9) a krátce se protřepává. Zkontroluje se, zda je pH přibližně 2. 10 minut se protřepává, přidá se 30 ml sulfátového tlumivého roztoku (4.5), po dobu 15 minut se protřepává a odstředí se. Odebere se vhodná alikvotní část roztoku z povrchu a pomocí 1 M roztoku hydroxidu sodného (4.8) s pH metrem nebo roztokem bromokrezolového nachu (4.10) se pH upraví na 6,5, přičemž se jako indikátor používá pH metr nebo roztok bromokrezolového nachu (4.10). Rozředí se tlumivým fosfátovým roztokem (4.5) tak, aby se získal předpokládaný obsah zinkbacitracinu 0,42 i.u./ml (= u₈).

Odváží se 10,0 g vzorku se, přidá se 49,0 ml směsi (4.4) a 1,0 ml roztoku síranu sodného (4.9) a krátce se protřepává. Zkontroluje se, zda je pH přibližně 2. 10 minut se protřepává, přidá se 30 ml sulfátového tlumivého roztoku (4.5), po dobu 15 minut se protřepává a odstředí se. Odebere se vhodná alikvotní část roztoku z povrchu a pomocí 1 M roztoku hydroxidu (4.8) se pH upraví na 6,5, přičemž se jako indikátor používá pH metr nebo roztok bromokrezolového nachu (4.10). Přibližně polovina objemu se odpařuje v rotační odparce při teplotě nepřesahující 35 ^oC.

Rozředí se tlumivým fosfátovým roztokem (4.5) tak, aby se získal předpokládaný obsah zinkbacitracinu 0,42 i.u./ml (= u₈).

Odváží se 10,0 g vzorku (20,0 g pro předpokládaný obsah zinkbacitracinu 5 mg/kg). Přidá se 24,0 ml směsi (4.4) a 1,0 ml roztoku síranu sodného (4.9) a po dobu 10 minut se homogenizuje. Přidá se 25 ml sulfátového tlumivého roztoku (4.5), po dobu 15 minut se protřepává a odstředí se. 20 ml roztoku se odebere z povrchu a pomocí 1 M roztoku hydroxidu sodného (4.8) se pH upraví na 6,5, přičemž se jako indikátor používá pH metr nebo roztok bromokrezolového nachu (4.10). Odpařuje se na přibližně 4 ml v rotační odparce při teplotě nepřesahující 35 ^oC. Rozředí se tlumivým fosfátovým roztokem (4.5) tak, aby se získal předpokládaný obsah zinkbacitracinu 0,42 i.u./ml (= u₈).

Z roztoku u₈ se připraví roztoky u₄ (předpokládaný obsah: 0,21 i.u./ml), u₂ (předpokládaný obsah: 0,105 i.u./ml) a u₁ (předpokládaný obsah: 0,0525 i.u./ml) prostřednictvím postupného rozřeďování (1 + 1) tlumivým fosfátovým roztokem (4.5).

Zkušební médium (4.2) se naočkuje bakteriální suspenzí (3.2) při teplotě přibližně 50 ^oC. Předběžnými testy na miskách se zkušebním médiem (4.2) se stanoví množství bakteriální substance umožňující získat nejrozsáhlejší a nejjasnější inhibiční zóny pro různé koncentrace zinkbacitracinu.

Difúze na agaru se provádí na miskách se čtyřmi koncentracemi standardního roztoku (s₈, s₄, s₂ a s₁) a čtyřmi koncentracemi zkušebního roztoku (u₈, u₄, u₂ a u₁). Na každé misce musí být nezbytně umístěny čtyři koncentrace standardu a čtyři koncentrace extraktu. Za tímto účelem se zvolí takový rozměr misek, který umožňuje vytvořit v prostředí agaru alespoň osm otvorů o průměru 10 až 13 mm, jejichž středy jsou od sebe vzdáleny alespoň 30 mm. Test by měl být prováděn především na miskách, které jsou vyrobeny ze skleněné desky, na kterou se umístí hliníkové nebo plastové kroužky o výšce 20 mm a průměru 200 mm.

Na misky se nalije médium (4.2) naočkované podle bodu 7.1. v takovém množství, které umožňuje získat přibližně 2 mm tlustou vrstvu (60 ml na misku o průměru 200 mm). Nechá se ztuhnout, vytvoří se otvory a do nich se umístí přesně naměřené objemy zkušebních a standardních roztoků (mezi 0,10 a 0,15 ml na otvor v závislosti na průměru). Každá koncentrace se použije alespoň čtyřikrát tak, aby se při každém stanovení obsahu hodnotilo 32 inhibičních zón.

Misky se nechají inkubovat po dobu 16 až 18 hodin při teplotě 30 ± 2 ^oC.

Průměr inhibičních zón se změří s přesností na 0,1 mm. Průměrné rozměry pro každou koncentraci se zaznamenají na semilogaritmický graf znázorňující logaritmus koncentrací v závislosti na průměrech inhibičních zón. Nejlépe vyhovující přímky standardního a extrahovaného roztoku se zaznamenají např. následovně:

„Nejlépe vyhovující bod“ pro nejnižší úroveň standardního vzorku (SL) se stanoví za použití vzorce:

„Nejlépe vyhovující bod“ pro nejvyšší úroveň standardního vzorku (SH) se stanoví za použití vzorce:

Nahrazením u₁, u₂, u₄ a u₈, za s₁, s₂, s₄ a s₈ ve výše uvedených vzorcích se podobným způsobem vypočítají „nejlépe vyhovující body“ pro nejnižší úroveň extraktu (UL) a nejvyšší úroveň extraktu (UH).

Vypočítané hodnoty SL a SH se zaznamenají na stejný grafický papír a jejich spojením se získá „nejlépe vyhovující“ přímka standardního roztoku. Podobně se zaznamenají i hodnoty UL a UH a jejich spojením se získá „nejlépe vyhovující“ přímka extraktu.

Nejsou-li přímky ničím ovlivněny, měly by být rovnoběžné. Z praktických důvodů se přímky považují za rovnoběžné, pokud se hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) neliší o více než o 10 % od své průměrné hodnoty.

Jestliže přímky nejsou rovnoběžné, je možné eliminovat buď u₁ a s₁ nebo u₈ a s₈ a hodnoty SL, SH, UL a UH se poté vypočítají za pomocí následujících vzorců:

a podobně pro hodnoty UL a UH. Při použití této alternativy by měla být dodržena stejná kritéria pro rovnoběžnost. Skutečnost, že byl výsledek vypočítán ze tří mezí, se poznamená v závěrečné zprávě.

Pokud jsou přímky považovány za rovnoběžné, vypočítá se logaritmus relativní aktivity (log A) pomocí jednoho z následujících vzorců podle toho, zda byly pro hodnocení rovnoběžnosti použity tři nebo čtyři úrovně.

Pro čtyři úrovně

Pro tři úrovně

nebo

Aktivita extraktu vzorku = aktivita odpovídajícího standardu x A

(u₈ = s₈ × A)

Jestliže se relativní aktivita nachází mimo rozmezí od 0,5 do 2,0, zkouška se zopakuje, přičemž se odpovídajícím způsobem upraví koncentrace extraktu nebo, jestliže to není nutné, standardních roztoků. Jestliže není možné dostat relativní aktivitu do požadovaného rozmezí, je třeba považovat výsledek za přibližný a tato skutečnost by měla být uvedena v závěrečné zprávě.

Pokud přímky nejsou považovány za rovnoběžné, stanovení se opakuje. Není li dosaženo rovnoběžnosti, považuje se stanovení za nevyhovující.

Výsledek se vyjádří v miligramech zinkbacitracinu na kilogram krmiva.

Rozdíl výsledků mezi dvěma paralelními stanovení prováděnými na stejném vzorku stejným laborantem nesmí být vyšší než:

• 2 mg/kg, v absolutní hodnotě, u obsahů zinkbacitracinu nižších než 10 mg/kg,

• 20 % nejvyššího výsledku pro obsahy od 10 do 25 mg/kg,

• 5 mg/kg, v absolutní hodnotě, u obsahů zinkbacitracinu od 25 do 50 mg/kg,

• 10 % nejvyššího výsledku pro obsahy nad 50 mg/kg.

Tato metoda je určena pro stanovení flavofosfolipolu v krmivech, koncentrátech a premixech. Dolní mez stanovení je 1 mg/kg (1 ppm).

Vzorek je extrahován zředěným methanolem za varu pod zpětným chladičem. Po odstředění je extrakt přečištěn (kde je to nutné) na ionexu a zředěn. Jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze flavofosfolipolu na agaru naočkovaném mikroorganizmem Staphylococcus aureus. Difúze se projevuje formací inhibičních zón mikroorganizmu. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu antibiotické koncentrace v rozsahu použitých antibiotických koncentrací.

Naočkujte Staphylococcus aureus do zkumavky se šikmým agarem (4.1). Inkubujte 24 hodin při 37 °C, skladujte v chladničce při 4 °C a znovu přeočkujte každý měsíc na šikmý agar.

Oddělte dvě zkumavky obsahující zásobní kulturu (3.1) a týdně ji přeočkovávejte. Inkubujte 24 hodin při 37 °C a skladujte v chladničce při asi 4 °C.

24 hodin před zkouškou naočkujte touto kulturou dvě až čtyři zkumavky obsahující šikmé kultivační médium (4.1). Inkubujte 16 až 18 hodin při 37 °C. Vytvořte suspenzi kultury v roztoku chloridu sodného (4.3). Světelná transmitance suspenze musí být okolo 40 %, měřeno při 578 nm v 1 cm kyvetě proti roztoku chloridu sodného (4.3).

Jako v bodě 4.1, s přídavkem 2,0 g silikonové protipěnící emulze(Např. SE 2 od Wacker Chemie Gmbh, Mnichov.).

Roztok chloridu sodného 0,4 % (hmotnostně-objemových): rozpusťte 4 g chloridu sodného p.a. ve vodě a zřeďte do 1000 ml; sterilizujte.

Methanol, čistý.

Methanol 50 % (objemových): zřeďte 500 ml methanolu (4.4) 500 ml vody.

Methanol 80 % (objemových): zřeďte 800 ml methanolu (4.4) 200 ml vody.

Tris (hydroxymetyl) aminometan p.a.

Methanolový roztok chloridu draselného 1,5 % (váhově-objemových): rozpusťte 1,5 g chloridu draselného p.a. ve 20 ml vody, doplňte methanolem (4.4) do objemu 100 ml.

Kationtový měnič: Dowex 50 Wx8, 20 až 50 mesh, Na forma (kat. Serva č. 41600) nebo ekvivalent.

Aniontový měnič: Dowex 1x2, 50 až 100 mesh, Cl forma (kat. Serva č. 41010) nebo ekvivalent. Před použitím udržujte 12 až 14 hodin v 80 % methanolu (4.6).

Skelná vlna.

pH indikátorový papírek (pH 6,06 až 8.1).

Kyselina askorbová.

Standardní látka: flavofosfolipol o známé aktivitě.

Skleněné trubice pro chromatografii, vnitřní průměr: 9 mm, délka 150 až 200 mm, vybavené zavíracím kohoutem ve zúžené části dolního konce a skleněným zábrusem (ke spojení s dávkovací nálevkou (5.2)) v horní části.

Dávkovací nálevka 250 ml, vybavená zavíracím kohoutem a skleněným zábrusem.

250 ml kónická baňka se skleněným zábrusem.

Zpětný chladič se skleněným zábrusem.

Rozpusťte přesně odvážené množství standardní látky (4.14) v 50 % methanolu (4.5) a zřeďte, abyste obdrželi zásobní roztok obsahující 100 μg flavofosfolipolu na mililitr. Pokud je tento roztok skladován v zazátkované baňce při 4 °C, je stabilní až dva měsíce.

Z tohoto zásobního roztoku připravte postupným ředěním 50 % methanolem (4.5) následující roztoky:

Odvažte množství vzorku 2,0 až 5,0 g, přidejte asi 150 mg kyseliny askorbové (4.13). Homogenizujte se 150 ml 50 % methanolu (4.5) v kónické baňce (5.3) a upravte pH na 8,1 až 8,2 asi 400 mg tris (hydroxymetyl) aminometanem (4.7). Zkontrolujte pH indikačním papírkem (4.12). Nechejte ustát 15 minut, potom znovu upravte pH na 8,1 až 8,2 tris (hydroxymetyl) aminometanem (4.7) a vařte 10 minut pod zpětným chladičem (5.4) při stálém míchání. Nechejte vychladnout, odstřeďte směs a dekantujte extrakt.

Odvažte množství 5,0 až 30,0 g vzorku obsahujícího nejméně 30 μg flavofosfolipolu. Homogenizujte se 150 ml 50 % methanolu (4.5) v kónické baňce (5.3) a upravte pH na 8,1 až 8,2 asi 400 mg tris (hydroxymetyl) aminometanem (4.7). Zkontrolujte pH indikačním papírkem (4.12). Nechejte ustát 15 minut, potom znovu upravte pH na 8,1 až 8,2 tris (hydroxymetyl) aminometanem (4.7) a vařte 10 minut pod zpětným chladičem (5.4) při stálém míchání. Nechejte vychladnout, odstřeďte směs a dekantujte extrakt.

Rozmíchejte 110 ml extraktu s 11 g kationtového měniče (4.9), vařte jednu minutu pod zpětným chladičem (5.4) při stálém míchání. Oddělte kationtový měnič odstředěním nebo filtrací. Promíchejte 100 ml extraktu se 150 ml methanolu (4.4) a skladujte roztok 12 až 15 hodin při 4 °C. Odfiltrujte vločkovitou hmotu dokud je roztok chladný.

Vložte zátku ze skelné vlny (4.11) do spodního konce skleněné trubice (5.1), vlijte do trubice 5 ml aniontového měniče (4.10) a promyjte kolonu 100 ml 80 % methanolu (4.6). S použitím nálevky (5.2), přeneste do kolony nejméně 100 ml filtrátu, u kterého se očekává, že obsahuje 16 μg flavofosfolipolu (200 ml na 30 g vzorku krmiva při 1 ppm). Kde je to nutné, zřeďte filtrát před aplikací do kolony 80 % methanolem (4.6), abyste obdrželi očekávaný obsah flavofosfolipolu 16 μg/100 ml. Průtok upravte na asi 2 ml/minutu. Odstraňte efluentvýtok. Jímejte 50 ml 80 % methanolu (4.6) a odstraňte výtok.

Eluujte flavofosfolipol methanolovým roztokem chloridu draselného (4.8) při průtoku asi 2 ml/minutu. Seberte 50 ml eluátu do odměrné baňky, přidejte 30 ml vody a promíchejte. Tento roztok by měl mít obsah flavofosfolipolu 0,2 μg/ml (= U₈).

Kde je to nutné (tj. když bylo pominuto předčištění), zřeďte extrakt získaný v bodě 7.1.1 50 % methanolem (4.5), abyste obdrželi očekávaný obsah flavofosfolipolu 0,2 μg/ml (= U₈).

Z roztoku U₈ připravte roztok U₄ (očekávaný obsah: 0,1 μg/ml), U₂ (očekávaný obsah: 0,05 μg/ml) a U₁ (očekávaný obsah: 0,025 μg/ml) s použitím postupného ředění (1 + 1) 50 % methanolem (4.5).

Očkujte zkušební médium (4.2.2) bakteriální suspenzí (3.2) při asi 50 °C. Předběžnými pokusy na miskách se zkušebním médiem (4.2.2) stanovte množství požadované bakteriální suspenze, které poskytne největší a nejjasnější inhibiční zóny s různými koncentracemi flavofosfolipolu (asi 30 ml/litr).

Difúze na agaru je prováděna v miskách za použití čtyřech koncentrací standardního roztoku (S₈, S₄, S₂, S₁) a čtyřech koncentrací zkušebního roztoku (U₈, U₄, U₂, U₁). Tyto čtyři koncentrace extraktu a standardu musí být nezbytně umístěny do každé plotny. Pro tento účel vyberte plotny, které jsou dostatečně velké, aby umožnily udělat v agaru nejméně 8 otvorů o průměru 10 až 13 mm a nejméně 30 mm mezi jejich středy. Pokus může být prováděn na miskách sestávajících z plochých skleněných ploten vybavených dokonale rovným hliníkovým nebo plastovým rámem 200 mm v průměru a 20 mm výšky.

Rozlijte na plotny množství média (4.2.1), aby vytvořilo vrstvu asi 1,5 mm silnou (45 ml na misku o průměru 200 mm). Nechejte ustát ve vodorovné pozici a potom přelijte množstvím média (4.2.2) naočkovaného jako v bodě 8.1, aby vytvořilo vrstvu 1 mm silnou (30 ml na misku o průměru 200 mm). Nechejte znovu ustát v rovnovážné pozici, vytvořte otvory a umístěte do nich přesně odměřené objemy zkušebních a standardních roztoků (mezi 0,10 a 0,15 ml na díru, podle průměru).

Každou koncentraci použijte nejméně čtyřikrát tak, že každému stanovení podléhá vyhodnocení 32 inhibičních zón.

Inkubujte plotny 16 až 18 hodin při 28 až 30 °C.

Změřte průměr inhibičních zón s přesností na 0,1 mm. Zaznamenejte střední hodnotu pro každou koncentraci na semilogaritmickém grafickém papíře, znázorňujíc logaritmus koncentrací ve vztahu k průměrům inhibičních zón. Narýsujte nejvhodnější křivky standardního roztoku a extraktu, například jako je to uvedeno níže.

Stanovte „nejvhodnější“ bod pro nejnižší úroveň standardu (SL) s použitím rovnice:

Podobně vypočtěte „nejvhodnější“ body pro nejnižší úroveň extraktu (UL) a nejvyšší úroveň extraktu (UH) nahrazením U₁, U₂, U₄ a U₈ za S₁, S₂, S₄ a S₈ ve výše uvedených rovnicích.

Zaznamenejte vypočítané hodnoty SL a SH na stejný grafický papír a spojte je, abyste obdrželi „nejvhodnější“ křivku pro roztok standardu. Podobně zaznamenejte UL a UH a spojte je, abyste obdrželi „nejvhodnější“ křivku pro extrakt.

V nepřítomnosti jakýchkoli ovlivnění by měly být křivky paralelní. Pro praktické účely mohou být křivky považovány za paralelní, pokud se hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) neliší o více než 10 % od jejich střední hodnoty.

Pokud jsou křivky shledány jako neparalelní, může být pominuto buď U₁ a S₁ nebo U₈ a S8 a SL, SH, UL a UH vypočteny za použití alternativních rovnic, které poskytují alternativní „nejvhodnější“ křivky:

a podobně pro UL a UH. Alternativní nejvhodnější křivky musí být kontrolovány na paralelnost jako předtím. Skutečnost, že byl výsledek počítán ze tří úrovní, musí být uvedena v závěrečné zprávě.

Když jsou křivky považovány za paralelní, vypočtěte logaritmus relativní aktivity (log. A) pomocí jedné s následujících rovnic.

Pro čtyři úrovně

Pro tři úrovně

nebo

Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita x relativní aktivita.

Když jsou křivky považovány za neparalelní, opakujte stanovení. Pokud není paralelnost stále docílena, vypočítejte logaritmus relativní aktivity (log. A) prostřednictvím rovnice c). Nicméně, obdržený výsledek musí být považován za přibližný a toto musí být uvedeno v závěrečném hlášení.

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u stejného vzorku stejným analytikem nesmí překročit:

0,5 mg/kg v absolutní hodnotě pro obsahy flavofosfolipolu od 1 do 2 mg/kg;

25 % rel. z vyšší hodnoty pro obsahy větší než 2 do10 mg/kg;

20 % rel. z vyšší hodnoty pro obsahy větší než 10 do 25 mg/kg;

5 mg/kg v absolutní hodnotě pro obsahy větší než 25 do 50 mg/kg;

10 % rel. z vyšší hodnoty pro obsahy nad 50 mg/kg.

Tato metoda umožňuje stanovit stopové prvky železo, měď, mangan a zinek v krmivech. Dolní meze stanovení jsou:

• železo (Fe): 20 mg/kg

• měď (Cu): 10 mg/kg

• mangan (Mn): 20 mg/kg

• zinek (Zn): 20 mg/kg

Vzorek je převeden do roztoku kyselinou chlorovodíkovou po destrukci organické hmoty, pokud je obsažena. Prvky železo, měď, mangan a zinek jsou stanoveny po příslušném zředění atomovou absorpční spektrofotometrií.

Pro přípravu chemikálií a analytických roztoků používejte vodu, u které bylo stanoveno, že je bez kationtů, získanou buď dvounásobnou destilací vody v borosilikátovém nebo křemíkatém destilačním přístroji nebo dvounásobným působením ionexu.

Chemikálie musí být nejméně analytické kvality (p.a.). Nepřítomnost prvků, které mají být stanoveny, musí být kontrolována slepým pokusem. Pokud je to nutné, musí být chemikálie dále přečištěny.

Namísto standardních roztoků popsaných níže, mohou být použity komerční standardní roztoky za předpokladu, že jsou garantovány a před použitím byly překontrolovány.

Kyselina chlorovodíková p.a. (d: 1,19).

Kyselina chlorovodíková p.a. (6 N).

Kyselina chlorovodíková p.a. (0,5 N).

Kyselina fluorovodíková 38 až 40 % (objemových) mající obsah železa menší než 1 mg Fe/litr a zbytek po odpaření menší než 10 mg (jako sulfát)/litr.

Kyselina sírová p.a. (d: 1,84).

Peroxid vodíku p.a. (přibližně 100 objemů kyslíku (30 % hmotnostně)).

Standardní roztok železa (1000 μg Fe/ml) připravený následovně: rozpusťte 1 g železného drátu p.a. ve 200 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2), přidejte 16 ml peroxidu vodíku (3.6) a doplňte do jednoho litru vodou.

Pracovní standardní roztok železa (100 μg Fe/ml) připravený zředěním standardního roztoku (3.7) 1 + 9 vodou.

Standardní roztok mědi (1000 μg Cu/ml) připravený následovně: rozpusťte 1 g mědi v práškové formě (p.a.) ve 25 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2), přidejte 5 ml peroxidu vodíku (3.6) a doplňte do jednoho litru vodou.

Pracovní standardní roztok mědi (10 μg Cu/ml) připravený zředěním standardního roztoku (3.8) 1 + 9 vodou a potom zředěním výsledného roztoku 1 + 9 vodou.

Standardní roztok manganu (1000 μg Mn/ml) připravený následovně: rozpusťte 1 g manganu v práškové formě (p.a.) ve 25 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2), přidejte 5 ml peroxidu vodíku (3.6) a doplňte do jednoho litru vodou.

Pracovní standardní roztok manganu (10 μg Mn/ml) připravený zředěním standardního roztoku (3.9) 1 + 9 vodou a potom zředěním výsledného roztoku 1 + 9 vodou.

Standardní roztok zinku (1000 μg Zn/ml) připravený následovně: rozpusťte 1 g zinku ve formě pásku nebo plátku (p.a.) ve 25 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2) a doplňte do jednoho litru vodou.

Pracovní standardní roztok zinku (10 μg Zn/ml) připravený zředěním standardního roztoku (3.10) 1 + 9 vodou a potom zředěním výsledného roztoku 1 + 9 vodou.

Roztok chloridu lanthanitého připravený následovně: rozpusťte 12 g kysličníku lanthanitého ve 150 ml vody, přidejte 100 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové (3.2) a doplňte do jednoho litru vodou.

Muflová pec s regulací teploty a záznamníkem.

Skleněné nádobí musí být rezistentního borosilikátového typu a doporučuje se používat přístroje, které jsou výlučně rezervovány pro stanovení stopových prvků.

Platinové kelímky a (volitelně) křemenné kelímky.

Atomový absorpční spektrofotometr splňující požadavky metody, co se týče citlivosti a přesnosti v požadovaném rozsahu.

• a) Při stanovení stopových prvků je důležité být ostražitý vůči rizikům kontaminace, zejména zinkem, mědí a železem. Z tohoto důvodu musí být vybavení používané při přípravě vzorků bez těchto kovů.

  Ke snížení obecného rizika kontaminace, pracujte v bezprašné atmosféře s úzkostlivě čistým vybavením a pečlivě umývaným nádobím. Stanovení zinku je zvláště citlivé na mnoho typů kontaminace, např. z nádobí, chemikálií, prachu, atd.

• b) Váha vzorku, který má být žíhán, je počítána z přibližného obsahu stopového prvku v krmivu ve vztahu k citlivosti použitého spektrofotometru. U určitých krmiv s nízkým obsahem stopových prvků může být nezbytné začít s 10 až 20 g vzorku a doplnit konečný roztok na pouze 100 ml.
• c) Žíhání musí být prováděno v zavřené peci bez vhánění vzduchu nebo kyslíku.
• d) Teplota ukazovaná pyrometrem nesmí překročit 475 °C.

Příprava kalibračních roztoků

Pro každý prvek, který má být stanoven, připravte z pracovních standardních roztoků získaných dle bodů 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 a 3.10.1 řadu kalibračních roztoků, každý kalibrační roztok s koncentrací HCL okolo 0,5 N a (v případě železa, manganu a zinku) koncentrací chloridu lanthanitého ekvivalentní 0,1 % La (hmotnostně-objemových). Koncentrace vybraných stopových prvků musí ležet v rozsahu citlivosti použitého spektrofotometru. Tabulky uvedené níže ukazují příkladně složení typických řad kalibračních roztoků; v závislosti na typu a citlivosti použitého spektrofotometru může být nicméně nutno vybrat další koncentrace.

Železo

Měď

Mangan

Zinek

Příprava roztoku pro analýzy

U stanovení mědi může být roztok připravený z bodu 5.1.1 normálně použit přímo. Pokud je nezbytné přivést jeho koncentraci na úroveň kalibračních roztoků, může být alikvotní část pipetována do 100 ml odměrné baňky a doplněna po značku 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou (3.3).

U stanovení železa, manganu a zinku odpipetujte alikvotní podíl roztoku připraveného podle bodu 5.1.1 do 100 ml odměrné baňky, přidejte 10 ml chloridu lanthanitého (3.11) a doplňte po značku 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou (3.3) (viz rovněž bod 8 poznámky).

Slepý pokus

Slepý pokus musí zahrnovat všechny předepsané kroky postupu kromě toho, že je pominut materiál vzorku.

Kalibrační roztok „0“ nemůže být použit jako slepý.

Měření atomové absorpce

Změřte atomovou absorpci kalibračních roztoků a roztoku, který má být analyzován, s použitím okysličujícího plamene vzduch-acetylen při následujících vlnových délkách:

• Fe: 248,3 nm

• Cu: 324,8 nm

• Mn: 279,5 nm

• Zn: 213,8 nm

Proveďte každé měření čtyřikrát.

Pokud vzorek neobsahuje organickou hmotu, není nezbytné spalování. Pokračujte, jak je to popsáno v bodě 5.1.1 i) počínaje druhým odstavcem. Odpaření s kyselinou fluorovodíkovou může být pominuto.

S použitím kalibrační křivky vypočtěte koncentraci stopového prvku v roztoku, který má být analyzován a vyjádřete výsledek v miligramech stopového prvku na kilogram vzorku (ppm).

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku stejným analytikem nesmí překročit:

• 5 mg/kg v absolutní hodnotě u obsahů příslušného stopového prvku do 50 mg/kg,

• 10 % z vyššího výsledku u obsahů příslušného stopového prvku od 50 do 100 mg/kg,

• 10 mg/kg, v absolutní hodnotě u obsahů příslušného stopového prvku od 100 do 200 mg/kg,

• 5 % z vyššího výsledku u obsahů příslušného stopového prvku přes 200 mg/kg.

Přítomnost velkých množství fosfátů může ovlivňovat stanovení železa, manganu a zinku. Takové ovlivnění musí být korigováno přidáním roztoku chloridu lanthanitého (3.11). Nicméně, pokud je váhový poměr ve vzorku · 2, může být přídavek roztoku chloridu lanthanitého (3.11) do roztoku pro analýzy a do kalibračních roztoků pominuto.