PŘÍLOHA

I. DŮKAZ OXIDAČNÍCH ČINIDEL A STANOVENÍ PEROXIDU VODÍKU V PROSTŘEDCÍCH PRO PÉČI O VLASY

Jodometrické stanovení peroxidu vodíku v kosmetice je možné pouze za nepřítomnosti jiných oxidačních činidel vytvářejících jod z jodidů. Z tohoto důvodu je před jodometrickým stanovením peroxidu vodíku nutné zjistit a identifikovat jakákoli jiná přítomná oxidační činidla. Tento důkaz se dělí do dvou fází; první zahrnuje peroxodisírany, bromičnany a peroxid vodíku, druhá peroxid barnatý.

Peroxodisíran sodný, peroxodisíran draselný a peroxodisíran amonný, bromičnan draselný, bromičnan sodný a peroxid vodíku – bez ohledu na to, zda pochází či nepochází z peroxidu barnatého – se dokazují pomocí sestupné papírové chromatografie, při které se používá dvou vyvíjecích rozpouštědel.

Všechna použitá reakční činidla musí být čistoty p.a.

0,5 % (m/v) vodné referenční roztoky následujících sloučenin:

Peroxodisíran sodný

Peroxodisíran draselný

Peroxodisíran amonný

Bromičnan draselný

Bromičnan sodný

Peroxid vodíku

Vyvíjecí rozpouštědlo A, 80 % (v/v) ethanol

Vyvíjecí rozpouštědlo B, benzen – methanol – 3-methyl-butan-1-ol – voda (34: 38: 18: 10 objemově)

Detekční činidlo A, 10 % (m/v) vodný roztok jodidu draselného

Detekční činidlo B, 1 % (m/v) vodný roztok škrobu

Detekční činidlo C, 10 % (m/m) kyselina chlorovodíková

4 N kyselina chlorovodíková

Chromatografický papír (papír Whatman č. 3 nebo č. 4 nebo jejich ekvivalenty)

Mikropipeta na 1 μl

Odměrné baňky na 100 ml

Skládané filtry

Zařízení pro sestupnou papírovou chromatografii

Z každého vzorku se připraví dva roztoky rozpuštěním 1 g a 5 g výrobku ve 100 ml vody. 1 μl každého z těchto roztoků se použije pro provedení papírové chromatografie popsané v oddílu 5.

Naváží se 1 g a 5 g vzorku a rozptýlí se v 50 ml vody, v obou případech se doplní vodou na 100 ml a promíchají se. Obě suspenze se přefiltrují přes skládaný filtr (3.4) a z každého z filtrátů se použije 1 μl pro provedení papírové chromatografie popsané v oddílu 5.

Ještě jednou se připraví dvě suspenze vzorků rozptýlením 1 g a 5 g v 50 ml vody, okyselí se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (2.7), doplní se vodou na 100 ml a promíchají se. Suspenze se přefiltrují přes skládaný filtr (3.4) a 1 μl každého z těchto roztoků se použije pro provedení papírové chromatografie popsané v oddílu 5.

5 g a 20 g každého výrobku se rozptýlí ve 100 ml vody a suspenze se použijí pro provedení papírové chromatografie popsané v oddílu 5.

Přiměřené množství rozpouštědel A (2.2) a B (2.3) se umístí do dvou oddělených chromatografických komor, aby se provedla sestupná papírová chromatografie. Chromatografické komory se sytí párami rozpouštědla alespoň 24 hodin.

1 μl roztoku vzorku a všech referenčních roztoků připravených podle oddílu 4 a bodu 2.1 se nanese na startovní body proužku chromatografického papíru (Whatman č. 3 nebo ekvivalentní) 40 cm dlouhého a 20 cm širokého (3.1) nebo jiných vhodných rozměrů a rozpouštědlo se nechá odpařit na vzduchu.

Chromatografický proužek (5.2) se umístí do chromatografické kolony naplněné vyvíjecím rozpouštědlem A (5.1) a vyvíjí se, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí o 35 cm (asi 15 hodin).

Postup popsaný v bodech 5.2 a 5.3 se opakuje za použití chromatografického papíru (Whatman č. 4 nebo ekvivalentní) (3.1) a vyvíjecího roztoku B. Chromatografie probíhá, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí o 35 cm (asi pět hodin).

Po ukončení vyvíjení se chromatogramy vyjmou a usuší se na vzduchu.

Skvrny se objeví po následném postříkání:

detekčním činidlem A a krátce poté detekčním činidlem B (2.5). Skvrny peroxodisíranů se na chromatogramu objeví nejdříve a budou je následovat skvrny peroxidu vodíku. Skvrny se označí tužkou;

detekčním činidlem C (2.6) na chromatogramech získaných podle bodu 5.6.1; přítomnost bromičnanů se projeví šedavě modrými skvrnami na chromatogramu.

Za výše zmíněných podmínek vztahujících se k vyvíjecím rozpouštědlům A (2.2) a B (2.3) jsou hodnoty Rf referenčních látek (2.1) přibližně následující:

Peroxid barnatý se dokazuje tvorbou peroxidu vodíku po okyselení vzorku (A.4.2) a přítomností barnatých iontů:

• v nepřítomnosti peroxodisíranů (A) přídavkem zředěné kyseliny sírové do části kyselého roztoku vzorku (B.4.1), čímž vznikne bílá sraženina síranu barnatého. Přítomnost barnatých iontů ve vzorku (B.4.1) se opět potvrdí papírovou chromatografií způsobem popsaným níže (B.5),

• ve vzorcích, ve kterých jsou peroxid barnatý a peroxodisírany přítomny současně (B.4.2), vyloužením zbytku z roztoku (B.4.2) v alkalickém prostředí; po rozpuštění taveniny (B.4.2.3) v kyselině chlorovodíkové se přítomnost barnatých iontů potvrdí papírovou chromatografií a/nebo vysrážením síranu barnatého.

Methanol

36 % (m/m) koncentrovaná kyselina chlorovodíková

6 N kyselina chlorovodíková

4 N kyselina sírová

Disodná sůl kyseliny rhodizonové (5,6-dihydroxycyklohex-5-en1,2,3,4-tetron, sodná sůl)

Chlorid barnatý (BaCl₂·2H₂O)

Bezvodý uhličitan sodný

1 % (m/v) vodný roztok chloridu barnatého

Vyvíjecí rozpouštědlo skládající se z methanolu, koncentrované kyseliny chlorovodíkové (koncentrace 36 %) a vody (80: 10: 10 objemově)

Detekční činidlo, 0,1 % (m/v) vodný roztok disodné soli kyseliny rhodizonové, připravuje se bezprostředně před použitím.

Mikropipeta na 5 μl

Platinové kelímky

Odměrné baňky na 100 ml

Chromatografický papír Schleicher and Schüll 2043 b nebo ekvivalentní. Papír se vyčistí tak, že se přes noc nechá vyvíjet v komoře pro sestupnou chromatografii (A.3.5) obsahující vyvíjecí rozpouštědlo (B.2.9) a poté se usuší.

Skládaný filtrační papír

Běžné zařízení pro provádění vzestupné papírové chromatografie

2 g výrobku se rozptýlí v 50 ml vody a pH suspenze se upraví přibližně na hodnotu 1 kyselinou chlorovodíkovou (B.2.3).

Suspenze se pomocí vody převede do odměrné baňky na 100 ml, doplní se po rysku vodou a promíchá se. Tato suspenze se použije pro analýzu papírovou chromatografií popsanou v oddílu 5 a pro důkaz barya vysrážením síranu.

2 g výrobku se rozptýlí ve 100 ml vody a přefiltruje se.

K vysušenému zbytku se přidá množství uhličitanu sodného odpovídající sedmi až desetinásobku hmotnosti zbytku (B.2.7), promíchá se a směs se půl hodiny taví v platinovém kelímku (B.3.2).

Ochladí se na pokojovou teplotu, tavenina se rozpustí v 50 ml vody a přefiltruje se (B.3.5).

Zbytek z taveniny se rozpustí v kyselině chlorovodíkové (B.2.3) a doplní se vodou na 100 ml. Tento roztok se použije pro analýzu papírovou chromatografií popsanou v oddílu 5 a pro důkaz barya vysrážením síranu.

Přiměřené množství vyvíjecího rozpouštědla (B.2.9) se umístí do komory pro vzestupnou chromatografii a komora se sytí alespoň 15 hodin.

Na kus chromatografického papíru – předem upraveného tak, jak je popsáno v bodu B.3.4 – se nanese do třech startovních bodů 5 μl každého z roztoků připravených podle bodů B.4.1.2 a B.4.2.4 a referenční roztok B.2.8.

Vzorek a referenční skvrny se vysuší na vzduchu. Chromatogram se vyvíjí, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí o 30 cm.

Chromatogram se vyjme z komory a usuší na vzduchu.

Skvrny na chromatogramu se objeví po postříkání papíru detekčním činidlem B.2.10. V přítomnosti barya se na chromatogramu objeví červené skvrny s hodnotou Rf asi 0,10.

Jodometrické stanovení peroxidu vodíku je založeno na následující reakci:

H2O2 + 2H+ + 2I− → I2 − 2H2O

Tato konverze probíhá pomalu, může však být urychlena přidáním molybdenanu amonného. Vzniklý jod se stanoví titračně thiosíranem sodným a je mírou obsahu peroxidu vodíku.

Obsah peroxidu vodíku změřený níže popsaným způsobem se vyjádří v hmotnostních procentech výrobku (% m/m).

Všechna reakční činidla musí být čistoty p.a.

2 N kyselina sírová

Jodid draselný

Molybdenan amonný

0,1 N thiosíran sodný

10 % (m/v) roztok jodidu draselného, připravuje se bezprostředně před použitím

20 % (m/v) roztok molybdenanu amonného

1 % (m/v) roztok škrobu

Kádinky na 100 ml

Byreta na 50 ml

Odměrné baňky na 250 ml

Odměrné válce na 25 a 100 ml

Nedělené pipety na 10 ml

Erlenmeyerovy baňky na 250 ml

Do kádinky na 100 ml se naváží 10 g (m gramů) výrobku obsahujícího asi 0,6 g peroxidu vodíku. Obsah se pomocí vody převede do odměrné baňky na 250 ml, doplní se po rysku vodou a promíchá se.

10 ml roztoku vzorku (5.1) se odpipetuje do Erlenmeyerovy baňky na 250 ml (4.6) a postupně se přidá 100 ml 2 N kyseliny sírové (3.1), 20 ml roztoku jodidu draselného (3.5) a tři kapky roztoku molybdenanu amonného (3.6).

Vzniklý jod se okamžitě titruje 0,1 N roztokem thiosíranu sodného (3.4) a těsně před dosažením bodu ekvivalence se přidá několik mililitrů roztoku škrobu (3.7) jako indikátoru. Zaznamená se spotřeba 0,1 N roztoku thiosíranu sodného (3.4) v mililitrech (V).

Způsobem popsaným v bodech 5.2 a 5.3 se provede slepý pokus, přičemž se nahradí 10 ml roztoku vzorku 10 ml vody. Zaznamená se spotřeba 0,1 N roztoku thiosíranu sodného na slepý pokus (V₀ v ml).

Obsah peroxidu vodíku ve výrobku vyjádřený v hmotnostních procentech (% m/m) se vypočte pomocí následujícího vzorce:

kde

Pro výrobky obsahující asi 6 % (m/m) peroxidu vodíku by neměla absolutní hodnota rozdílu dvou stanovení provedených současně se stejným vzorkem překročit 0,2 %.

Tato metoda je vhodná pro důkaz a semikvantitativní stanovení následujících látek v barvách na vlasy ve formě krému nebo kapaliny:

Oxidační barviva se extrahují z barev ve formě krému nebo kapaliny při pH 10 96 % ethanolem a dokazují se chromatografií na tenké vrstvě, a to jedno nebo dvourozměrnou.

K semikvantitativnímu stanovení těchto látek se chromatogram vzorků porovná pomocí čtyř vyvíjecích systémů s chromatogramy referenčních látek vyvíjenými současně a za co nejpodobnějších podmínek.

Všechna reakční činidla musí být čistoty p.a.

Ethanol, bezvodý

Aceton

Ethanol, 96 % (v/v)

Roztok amoniaku, 25 % (obsah závorky vložit z originálu)

Kyselina L(+)askorbová

Chloroform

Cyklohexan

Dusík, technický

Toluen

Benzen

n-Butanol

Butan-2-ol

Kyselina fosforná, 50 % roztok (v/v)

Diazotační činidlo. Buď:

• 3-nitro-1-benzendiazoniumchlorbenzensulfonát (ve formě stabilní soli), jako např. v červeni 2 JN – Francolor,

• 2-chlor-4-nitro-1-benzendiazoniumnaftalenbenzoát (ve formě stabilní soli), jako např. v činidle NNCD – referenční č. 74150 FLUKA,

nebo ekvivalentní.

Dusičnan stříbrný

p-Dimethylaminobenzaldehyd

2,5-Dimethylfenol

Chlorid železitý hexahydrát

Kyselina chlorovodíková, 10 % roztok (m/v)

Referenční látky jsou sloučeniny uvedené v oddílu 1 „Rozsah a oblast použití“. V případě aminosloučenin musí být referenční sloučenina buď ve formě hydrochloridu (mono nebo dihydrochloridu), nebo jako volná báze.

Připraví se 0,5 % roztoky (m/v) referenčních látek uvedených v bodu 3.20.

Naváží se 50 ± 1 mg referenční látky do odměrné baňky na 10 ml.

Přidá se 5 ml 96 % ethanolu (3.3) a 250 ml kyseliny askorbové (3.5).

Roztok se alkalizuje přidáním roztoku amoniaku (3.4) na hodnotu pH 10 (zjišťuje se indikátorovým papírkem).

Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3) a promíchá se.

Roztoky je možno uchovávat po dobu jednoho týdne v chladu a temnu.

V některých případech může po přidání kyseliny askorbové a roztoku amoniaku vzniknout sraženina. Před dalším postupem je třeba ji nechat usadit.

Aceton – chloroform – toluen (35: 25: 40 objemově)

Chloroform – cyklohexan – absolutní ethanol – 25 % roztok amoniaku (80: 10: 10: 1 objemově)

Benzen – butan-2-ol – voda (50: 25: 25 objemově). Důkladně se protřepe a po dekantaci při pokojové teplotě (20 až 25 °C) se k vyvíjení použije horní fáze.

n-Butanol – chloroform – činidlo M (7: 70: 23 objemově). Fáze se pečlivě dekantují při pokojové teplotě (20 až 25 °C) a použije se spodní fáze.

Vyvíjecí rozpouštědla obsahující amoniak je třeba bezprostředně před použitím dobře protřepat.

Připraví se 5 % (m/v) vodný roztok zvoleného činidla (3.14). Tento roztok se musí připravit bezprostředně před použitím.

2 g p-dimethylaminobenzaldehydu (3.16) se rozpustí ve 100 ml 10 % vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (m/v) (3.19).

Roztok 1: Rozpustí se 1 g dimethylfenolu (3.17) ve 100 ml 96 % ethanolu (3.3).

Roztok 2: Rozpustí se 4 g hexahydrátu chloridu železitého (3.18) ve 100 ml 96 % ethanolu (3.3).

Při vyvolání chromatogramu se těmito roztoky provádí postřik samostatně, nejprve roztokem 1, poté roztokem 2.

25 % amoniak (3.4) se přidá k 5 % (m/v) vodnému roztoku dusičnanu stříbrného (3.15), až se sraženina rozpustí. Toto reakční činidlo se připravuje bezprostředně před použitím.

Nelze jej uchovávat.

Běžné laboratorní vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě.

Plastový nebo skleněný kryt konstruovaný tak, aby chromatografickou desku během nanášení skvrn a sušení mohl obtékat dusík. Toto opatření je nezbytné vzhledem k náchylnosti určitých barviv k oxidaci.

Mikrostříkačka na 10 μl, dělená po 0,2 μl, s jehlou s rovným koncem nebo lépe dávkovač na 50 μl uchycený v držáku tak, aby deska mohla být udržována pod atmosférou dusíku.

Hotové silikagelové desky, tloušťka 0,25 mm, rozměry 20 × 20 cm (Macherey and Nagel, Silica GHR, na plastové podložce nebo ekvivalentní)

Odstředivka, 4000 ot./min.

Centrifugační zkumavky na 10 ml se šroubovými uzávěry potaženými PTFE nebo ekvivalentní.

První 2 až 3 cm krému vytlačeného z tuby se odstraní.

Do centrifugační zkumavky (4.3) předem propláchnuté dusíkem se převede: 300 mg kyseliny askorbové se 3 g krému nebo 3 g homogenizované kapaliny.

Přidává se po kapkách 25 % amoniak (3.4) až pH dosáhne hodnoty 10. Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3).

Homogenizuje se pod atmosférou dusíku (3.8), zazátkuje se a centrifuguje se po 10 minut při 4000 ot./min.

Použije se supernatant.

Pod atmosférou dusíku (3.8) se na chromatografickou desku (4.1.3) nanese po 1 μl každé shora uvedené referenční látky v devíti bodech vzdálených od sebe 1,5 cm podél linie vzdálené asi 1,5 cm od okraje desky.

Referenční látky se nanášejí v tomto uspořádání:

Dále se v bodech 10 a 11 nanesou vždy 2 μl zkoumaných roztoků získaných podle bodu 5.1.

Deska se uchovává pod atmosférou dusíku (3.8) až do okamžiku, kdy je zahájeno vyvíjení chromatogramu.

Deska se vloží do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) a nasycené jedním ze čtyř rozpouštědel (3.22) a nechá se vyvíjet při pokojové teplotě (20 až 25 °C) ve tmě, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti asi 15 cm od startovací linie.

Deska se vyjme a usuší pod atmosférou dusíku (3.8) při pokojové teplotě.

Deska se postříká jedním ze čtyř roztoků uvedených v bodu 3.23.

Porovnají se hodnoty Rf a barvy skvrn vzorku a chromatografovaných referenčních látek.

V tabulce 1 jsou uvedeny příklady hodnot Rf a barev skvrn pro jednotlivé látky v závislosti na použitém rozpouštědle a indikátoru.

Nejistý důkaz je někdy možné potvrdit tak, že se přidá roztok odpovídající referenční látky k extraktu vzorku.

Intenzita skvrn jednotlivých látek dokázaných v bodu 5.2.4 se porovnává vizuálně s odpovídajícím rozsahem koncentrací referenčních látek.

Při nadměrně vysoké koncentraci jedné nebo více látek nalezených ve vzorku se extrakt vzorku zředí a měření se opakuje.

Tato metoda dvourozměrné chromatografie vyžaduje použití dalších standardů a reakčních činidel.

β-naftol (β N)

2-aminofenol (OAP)

3-aminofenol (MAP)

4-aminofenol (PAP)

2-nitro-1,4-fenylendiamin (2-NPPD)

4-nitro-1,2-fenylendiamin (4-NOPD)

Připraví se 0,5 % (m/v) roztoky všech dalších referenčních látek způsobem popsaným v bodu 3.21.

Ethylacetát – cyklohexan – 25 % roztok amoniaku (65: 30: 0,5 objemově)

Do vyvíjecí komory pro chromatografii na tenké vrstvě se vloží skleněná nádobka, přidají se asi 2 g krystalického jodu a komora se uzavře odpovídajícím víkem.

Podle obrázku 1 se na desce pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1.3) vyznačí na straně s absorbentem dvě linky.

V dusíkové atmosféře (4.1.1) se nanese 1 až 4 μl extraktu (5.1) do základního bodu 1 (obr. 1), který leží asi 2 cm od obou okrajů. Množství extraktu závisí na intenzitě skvrn na chromatogramech (5.2).

Mezi body 2 a 3 (obr. 1) se nanesou oxidační barviva dokázaná nebo pokládaná za dokázaná podle bodu 5.2 (vzdálenost mezi body je 1,5 cm). Nanáší se 2 μl každého referenčního roztoku – kromě DAP, který je nutno nanést v objemu 6 μl. Nanášení se provádí v atmosféře dusíku (6.4.2).

Postup podle bodu 6.4.3 se opakuje v základních bodech 4 a 5 (obr. 1) a deska se uchovává pod dusíkem až do zahájení vyvolávání chromatogramu (vzdálenost mezi body je 1,5 cm).

Chromatografická komora se propláchne dusíkem (3.8) a umístí se do ní vhodné množství vyvíjecího rozpouštědla 3.22.2. Deska (6.4.4) se vloží do komory a vyvíjí se ve tmě v prvním vyvíjecím směru (obr. 1).

Vyvíjí se, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na desce (přibližně 13 cm).

Deska se z komory vyjme a umístí do jiné chromatografické komory, předem propláchnuté dusíkem, aby se vyvíjecí rozpouštědlo odpařovalo alespoň 60 minut.

Pomocí dělené zkumavky se do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) převede vhodné množství vyvíjecího rozpouštědla (6.2), do komory se vloží deska otočená o 90° (6.4.6) a chromatogram se vyvíjí ve druhém směru (opět ve tmě), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na straně s adsorbentem. Deska se vyjme z komory a rozpouštědlo se nechá odpařit na vzduchu.

Deska se na 10 minut umístí do chromatografické komory obsahující páry jodu (6.3) a dvourozměrný chromatogram se interpretuje s využitím hodnot Rf a barev současně chromatografovaných referenčních látek (hodnoty Rf a barvy skvrn jsou uvedeny v tabulce II).

Nejlepšího vybarvení skvrn se dosáhne tehdy, ponecháli se po vyvíjení chromatogram v atmosféře po dobu půl hodiny.

Přítomnost oxidačních barviv nalezených podle bodu 6.4.8 je možno definitivně potvrdit opakováním postupu popsaného v bodech 6.4.1 až 6.4.8, kdy se v základním bodu 1 přes množství extraktu podle bodu 6.4.2 nanese 1 μl referenčních látek identifikovaných v bodu 6.4.8. Neobjeví-li se oproti chromatogramu získanému podle bodu 6.4.8 žádná jiná skvrna, je interpretace chromatogramu podle bodu 6.4.8 správná.

Tato metoda je vhodná k důkazu dusitanů v kosmetických prostředcích, zejména v krémech a pastách.

Přítomnost dusitanu indikuje vznik zbarvených derivátů s 2-aminobenzaldehydfenylhydrazonem (Nitrin®).

Všechna reakční činidla musí být čistoty p.a.

Zředěná kyselina sírová: 2 ml koncentrované kyseliny sírové ( = 1,84) (obsah závorky vložit z originálu) se zředí 11 ml destilované vody.

Zředěná kyselina chlorovodíková: 1 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové ( = 1,19) (obsah závorky vložit z originálu) se zředí 11 ml destilované vody.

Methanol

Roztok 2-aminobenzaldehydfenylhydrazonu (reakční činidlo Nitrin®) v methanolu.

Naváží se 2,0 g Nitrinu® a převede se kvantitativně do odměrné baňky na 100 ml. Po kapkách se přidají 4 ml zředěné kyseliny chlorovodíkové (3.2) a protřepe se. Doplní se po rysku methanolem a míchá, dokud se roztok úplně nevyčeří. Roztok se uchovává v hnědé skleněné lahvi (4.3).

Kádinky na 50 ml

Odměrná baňka na 100 ml

Hnědá skleněná láhev na 125 ml

Skleněná deska 10 × 10 cm

Špachtle z plastu

Filtrační papír 10 × 10 cm

Část analyzovaného vzorku se rovnoměrně rozetře na skleněnou desku (4.4) tak, aby byl povrch pokryt vrstvou nejvýše 1 cm silnou.

List filtračního papíru (4.6) se nasákne destilovanou vodou. Položí se na vzorek a přitiskne špachtlí z plastu (4.5).

Počká se asi jednu minutu a do středu filtračního papíru se nanesou:

• 2 kapky zředěné kyseliny sírové (3.1),

• poté dvě kapky roztoku Nitrinu® (3.4).

Po 5 až 10 sekundách se filtrační papír odstraní a prohlédne se proti dennímu světlu. Červenofialové zbarvení indikuje přítomnost dusitanů.

Je-li obsah dusitanů nízký, změní se červenofialové zbarvení během 5 až 15 sekund na žluté. Je-li přítomno velké množství dusitanů, dojde k této barevné změně až po jedné nebo dvou minutách.

Intenzita tmavočerveného zbarvení a doba, která uplyne před změnou na žlutou, naznačují obsah dusitanů ve vzorku.

Metoda popisuje stanovení dusitanů v kosmetických prostředcích.

Obsah dusitanů ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech dusitanu sodného.

Po zředění vzorku vodou a vyčeření se nechá proběhnout reakce přítomných dusitanů se sulfanilamidem a N-1-naftylethylendiaminem a absorbance vzniklého zbarvení se měří při 538 nm.

Všechna reakční činidla musí být čistoty p.a.

Čeřidla: tato reakční činidla nelze používat déle než jeden týden po přípravě.

Carrezovo činidlo I:

106 g kyanoželeznatanu draselného K₄Fe(CN)₆·3H₂O se rozpustí v destilované vodě a zředí se vodou na 1000 ml.

Carrezovo činidlo II:

219,5 g octanu zinečnatého Zn(CH₃COO)₂·2H₂O a 30 ml ledové kyseliny octové se rozpustí v destilované vodě a zředí se vodou na 1000 ml.

Roztok dusitanu sodného:

0,500 g dusitanu sodného se rozpustí v destilované vodě v odměrné baňce na 1000 ml a doplní se vodou po rysku. 10,0 ml tohoto zásobního standardního roztoku se zředí na 500 ml; 1,0 ml výsledného roztoku = 10 mikrogramů NaNO₂.

1 N roztok hydroxidu sodného

0,2 % roztok sulfanilamidhydrochloridu:

2,0 g sulfanilamidu se za zahřívání rozpustí v 800 ml vody. Po ochlazení se za míchání přidá 100 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Zředí se vodou na 1000 ml.

5 N kyselina chlorovodíková

N-1-naftylové činidlo:

Tento roztok se musí připravit v den použití. Rozpustí se 0,1 g dihydrochloridu N-1-naftylethylendiaminu ve vodě a zředí se vodou na 100 ml.

Analytické váhy

Odměrné baňky na 100, 250, 500 a 1000 ml

Nedělené nebo dělené pipety

Odměrné válce na 100 ml

Skládaný filtrační papír, bez dusitanů, průměr 15 cm

Vodní lázeň

Spektrofotometr a kyvety s optickou drahou 1 cm

pHmetr

Mikrobyreta na 10 ml

Kádinky na 250 ml

S přesností na 0,1 mg se naváží asi 0,5 g (m gramů) homogenizovaného vzorku, kvantitativně se převede horkou destilovanou vodou do kádinky na 250 ml (5.10) a doplní se horkou destilovanou vodou asi na 150 ml. Kádinka (5.10) se na půl hodiny vloží do vodní lázně (5.6) vyhřáté na 80 °C. Během této doby se obsah občas protřepe.

Ochladí se na pokojovou teplotu a postupně se za míchání přidají 2 ml Carrezova činidla I (4.1.1) a 2 ml Carrezova činidla II (4.1.2).

Přidává se 1 N roztok hydroxidu sodného (4.3), dokud se pH neupraví na 8,3. (Použije se pHmetr (5.8)). Obsah se kvantitativně převede do odměrné baňky na 250 ml (5.2) a doplní destilovanou vodou po rysku.

Obsah se promíchá a zfiltruje přes skládaný papírový filtr (5.5).

Do odměrné baňky na 100 ml (5.2) se odpipetuje (5.3) odpovídající alikvotní část (V mililitrů) čirého filtrátu, avšak ne více než 25 ml, a doplní se destilovanou vodou na objem 60 ml.

Po promíchání se přidá 10,0 ml roztoku sulfanilamid–hydrochloridu (4.4) a poté 6,0 ml 5 N kyseliny chlorovodíkové (4.5). Promíchá se a ponechá stát pět minut. Přidají se 2,0 ml N-1-naftylového činidla (4.6), promíchá se a ponechá stát tři minuty. Zředí se vodou po rysku a promíchá se.

Připraví se slepý pokus opakováním operací popsaných v bodech 6.5 a 6.6 bez přídavku N1-naftylového činidla (4.6).

Změří se (5.7) absorbance roztoku připraveného podle bodu 6.6 při 538 nm proti roztoku slepého pokusu (6.7).

Z kalibračního grafu (6.10) se odečte obsah dusitanu sodného v mikrogramech na 100 ml roztoku (m1 mikrogramů), odpovídající absorbance změřené podle bodu 6.8.

S využitím roztoku dusitanu sodného o koncentraci 10 μg na ml (4.2) se sestrojí kalibrační graf pro koncentrace 0, 20, 40, 60, 80 a 100 μg dusitanu sodného ve 100 ml.

Obsah dusitanu sodného ve vzorku vyjádřený v hmotnostních procentech se vypočte pomocí následujícího vzorce:

% NaNO2 = 250V × m1 × 10−6 × 100m = m1V × m × 40

kde:

Pro obsah asi 0,2 % (m/m) dusitanu sodného by neměla absolutní hodnota rozdílu dvou stanovení provedených současně se stejným vzorkem překročit 0,005 %.

Tato metoda popisuje důkaz a dva způsoby stanovení v závislosti na tom, zda jsou či nejsou přítomny donory formaldehydu. Je použitelná pro všechny kosmetické prostředky.

Tato metoda se používá v případě, je-li použit formaldehyd samotný nebo s konzervačními přísadami, které nejsou donory formaldehydu.

V opačném případě, a pokud výsledek přesáhne nejvyšší povolenou koncentraci, musí se použít následující metoda pro potvrzení.

Při použití výše uvedené metody (1.2) se při derivatizaci donory formaldehydu štěpí, což vede k příliš vysokým výsledkům (vázaný formaldehyd a formaldehyd v polymerní formě).

Je nezbytné oddělit volný formaldehyd kapalinovou chromatografií.

Obsah volného formaldehydu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjadřuje v hmotnostních procentech.

Volný a vázaný formaldehyd poskytuje v prostředí kyseliny sírové za přítomnosti Schiffova činidla růžové nebo lila zbarvení.

Všechna reakční činidla musí být čistoty p.a. a použije se demineralizovaná voda.

Fuchsin;

Siřičitan sodný heptahydrát;

Koncentrovaná kyselina chlorovodíková (d = 1,19);

Kyselina sírová, asi 1M;

Do kádinky se naváží 100 mg fuchsinu (3.2.1) a rozpustí se v 75 ml vody o teplotě 80 °C. Po ochlazení se přidá 2,5 g siřičitanu sodného heptahydrátu (3.2.2) a 1,5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2.3). Objem se doplní do 100 ml.

Je použitelné do dvou týdnů.

Do kádinky na 10 ml se naváží 2 g vzorku.

Přidají se dvě kapky kyseliny sírové (3.2.4) a 2 ml Schiffova činidla (3.2.5). Toto činidlo musí být při použití naprosto bezbarvé.

Obsah se protřepe a nechá stát 5 minut.

Objeví-li se do pěti minut růžové nebo lila zbarvení, je přítomen formaldehyd v množství vyšším než 0,01 % a musí být stanoven volný a vázaný formaldehyd metodou podle bodu 4 a v případě potřeby metodou podle bodu 5.

Formaldehyd reaguje s pentan2,4-dionem v přítomnosti octanu amonného za tvorby 3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidinu. Ten se extrahuje butan1olem a absorbance extraktu se měří při 410 nm.

Všechna reakční činidla musí být čistoty p.a. a použije se demineralizovaná voda.

Bezvodý octan amonný;

Koncentrovaná kyselina octová, d₄²⁰= 1,05;

Pentan2,4dion, čerstvě předestilovaný za sníženého tlaku 25 mm Hg při 25 °C – nesmí vykazovat žádnou absorpci při 410 nm;

Butan1ol;

Kyselina chlorovodíková, 1M;

Kyselina chlorovodíková, asi 0,1M;

Hydroxid sodný, 1M;

Roztok škrobu, čerstvě připravený (1 g/50 ml vody) podle Evropského lékopisu, 2. vydání 1980, část I-VII-1-1;

Formaldehyd, 37 % až 40 % (m/V);

Odměrný roztok jodu, 0,05 M;

Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1 M;

V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí:

• 150 g octanu amonného (4.2.1),

• 2 ml pentan-2,4-dionu (4.2.3),

• 3 ml kyseliny octové (4.2.2).

Doplní se na 1000 ml vodou (pH roztoku asi 6,4).

Toto činidlo musí být připraveno čerstvě.

Činidlo (4.2.12) bez přídavku pentan-2,4-dionu;

5 g roztoku formaldehydu (4.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.

Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:

Odebere se 10,00 ml; přidá se 25,00 ml odměrného roztoku jodu (4.2.10) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (4.2.7).

Nechá se stát pět minut.

Okyselí se 11,00 ml HCl (4.2.5) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (4.2.11), jako indikátor se použije roztok škrobu (4.2.8).

Spotřeba 1 ml 0,05M odměrného roztoku jodu (4.2.10) odpovídá 1,5 mg formaldehydu;

Zásobní roztok formaldehydu se zředí vodou nejprve v poměru 1/20 a poté v poměru 1/100.

1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 1 μg formaldehydu.

Přesný obsah se vypočte.

Běžné laboratorní vybavení;

Filtr pro separaci fází, Whatman 1 PS (nebo ekvivalentní);

Odstředivka;

Vodní lázeň nastavená na teplotu 60 °C;

Spektrofotometr;

Skleněné kyvety s délkou optické dráhy 1 cm.

Do odměrné baňky na 100 ml se s přesností na 0,001 g naváží množství zkušebního vzorku (v gramech) odpovídající očekávanému obsahu formaldehydu asi 150 μg.

Doplní se po rysku vodou a zamíchá se (roztok S).

(Je nutno ověřit, zda je hodnota pH asi 6; v opačném případě se přidá roztok kyseliny chlorovodíkové (4.2.6).)

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se odměří

• 10,00 ml roztoku S,

• 5,00 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.12),

• demineralizovaná voda na konečný objem 30 ml.

Možný rušivý vliv základního zbarvení zkušebního vzorku se odstraní použitím tohoto referenčního roztoku:

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se odměří

• 10 ml roztoku S,

• 5 ml činidla (4.2.13),

• demineralizovaná voda na konečný objem 30 ml.

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá:

• 5 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.13),

• demineralizovaná voda na konečný objem 30 ml.

Směsi připravené podle bodů 4.4.1, 4.4.2 a 4.4.3 se protřepou. Erlenmeyerovy baňky se přesně na 10 minut vloží do vodní lázně vyhřáté na 60 °C. Nechají se vychladnout dvě minuty v lázni s ledovou vodou.

Obsah se převede do dělicí nálevky na 50 ml obsahující 10 ml butan-1-olu (4.2.4). Každá baňka se vypláchne 3 až 5 ml vody. Směs se přesně 30 sekund důkladně třepe. Fáze se nechají oddělit.

Obsah se přefiltruje do měřicích kyvet (4.3.2) přes filtr pro separaci fází. Fáze lze rovněž odstředit (při 3000 ot./min po dobu 5 minut).

Absorbance (A1) extraktu roztoku vzorku podle bodu 4.4.1 proti extraktu referenčního roztoku 4.4.2 se změří při 410 nm V.

Obdobně se změří absorbance (A2) extraktu roztoku slepého pokusu podle bodu 4.4.3 proti butan-1-olu.

Poznámka: Všechny tyto operace musí být provedeny do 25 minut od okamžiku, kdy byly Erlenmeyerovy baňky vloženy do lázně vyhřáté na 60°C.

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá:

• 5 ml zředěného standardního roztoku podle bodu 4.2.15,

• 5 ml činidla obsahujícího pentan-2,4-dion (4.2.12),

• demineralizovaná voda na celkový objem 30 ml.

Postupuje se tak, jak je popsáno v bodu 4.4.4, a měří se absorbance proti butan-1-olu (4.2.4).

Postup se opakuje s 10, 15, 20 a 25 ml zředěného standardního roztoku (4.2.15).

Nulová hodnota (odpovídající zabarvení reakčních činidel) se získá postupem podle bodu 4.4.4.5.

Po odečtení nulové hodnoty od každé hodnoty absorbance získané podle bodu 4.4.5.1 a 4.4.5.3 se sestrojí kalibrační křivka. Beerův zákon platí až do 30 μg formaldehydu.

Od hodnoty A1 se odečte hodnota A2 a z kalibrační křivky (4.4.5.5) se odečte množství C formaldehydu v roztoku vzorku (4.4.1) v μg.

Obsah formaldehydu ve vzorku (% m/m) se vypočte pomocí vzorce

obsah formaldehydu v % = C103 · m

kde

Při obsahu formaldehydu 0,2 % by neměl rozdíl dvou stanovení provedených současně se stejným vzorkem překročit 0,005 % pro kolorimetrickou metodu s pentan-2,4-dionem.

Vede-li kolorimetrické stanovení volného formaldehydu k výsledkům vyšším, než je nejvyšší koncentrace podle směrnice 76/768/EHS, tj.

• a) 0,05 % až 0,2 % ve výrobku, u něhož není obsah formaldehydu uveden na etiketě;
• b) více než 0,2 % ve výrobku s uvedením obsahu formaldehydu, nebo bez něho,

musí být použito postupu podle bodu 5.

Oddělený formaldehyd se převede na žlutý derivát lutidinu reakcí s pentan2,4dionem v reaktoru za kolonou a absorbance vzniklého derivátu se měří při 420 nm.

Všechna použitá reakční činidla musí být čistoty p.a. a použije se demineralizovaná voda.

Voda čistoty pro HPLC nebo voda ekvivalentní kvality;

Bezvodý octan amonný;

Koncentrovaná kyselina octová;

Pentan-2,4-dion (uchovává se při 4 °C);

Bezvodý hydrogenfosforečnan disodný;

Kyselina trihydrogenfosforečná, 85 % (d = 1,7);

Methanol čistoty pro HPLC;

Dichlormethan;

Formaldehyd, 37 % až 40 % (m/V);

Hydroxid sodný, 1M;

Kyselina chlorovodíková, 1M;

Kyselina chlorovodíková, 0,002M;

Roztok škrobu čerstvě připravený podle Evropského lékopisu (viz 4.2.8);

Odměrný roztok jodu, 0,05M;

Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1M;

Vodný roztok hydrogenfosforečnanu disodného (5.2.5), 0,006 M, upravený na pH 2,1 kyselinou trihydrogenfosforečnou (5.2.6);

V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí

• 62,5 g octanu amonného (5.2.2),

• 7,5 ml kyseliny octové (5.2.3),

• 5 ml pentan2,4dionu (5.2.4).

Objem se doplní po rysku vodou (5.2.1).

Roztok se uchovává ve tmě.

Skladovatelnost: nejvýše tři dny při 25 °C.

Barva roztoku by se neměla měnit.

10 g roztoku formaldehydu (5.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.

Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:

Odebere se 5 ml; přidá se 25 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) a 10 ml roztoku hydroxidu sodného (5.2.10).

Nechá se stát pět minut.

Okyselí se 11 ml HCl (5.2.11) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (5.2.15), jako indikátor se použije roztok škrobu (5.2.13).

Spotřeba 1 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) odpovídá 1,5 mg formaldehydu.

Zásobní roztok formaldehydu se zředí v poměru 1/100 mobilní fází (5.2.16).

1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 37 μg formaldehydu.

Přesný obsah se vypočte.

Běžné laboratorní vybavení;

Bezpulsní čerpadlo pro HPLC;

Nízkotlaké bezpulsní čerpadlo (případně druhé čerpadlo pro HPLC);

Nastřikovací ventil se smyčkou o objemu 10 μl;

Reaktor za kolonou obsahující následující prvky:

• + jednolitrová tříhrdlá baňka,
• + jednolitrové topné hnízdo,
• + dvě kolony Vigreux o minimálně 10 patrech, vzduchem chlazené,
• + trubice z korozivzdorné oceli (sloužící jako výměník tepla) 1,6 mm, vnitřní průměr 0,23 mm, délka 400 mm,
• + teflonová trubice 1,6 mm, vnitřní průměr 0,30 mm, délka 5 m (francouzské pletivo – viz doplněk 1),
• + jeden díl ve tvaru T bez mrtvého objemu (Valco nebo ekvivalentní),
• + tři spojky bez mrtvého objemu,
• nebo: jeden modul za kolonou Applied Biosystems PCRS 520 nebo ekvivalentní s reaktorem o objemu 1 ml.

Membránový filtr, velikost pórů 0,45 μm;

Patrona SEPPAK^R C₁₈ nebo ekvivalentní; (C18 se píše s 18 jako spodním indexem)

Hotové kolony:

• Bischoff hypersil RP 18 (typ NC číslo C 25.46 1805),

  (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm),

• nebo DuPont, Zorbax ODS

  (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm),

• nebo Phase SEP, spherisorb ODS 2

  (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm).

Bischoff K1 hypersil RP 18 (typ K1 G 6301 1805)

(5 μm, délka 10 mm), nebo ekvivalentní.

Kolona a předkolona se spojí systémem Ecotube (typ A 15020508 Bischoff) nebo ekvivalentním.

Aparatura (5.3.5) se sestaví podle blokového schématu v doplňku 2.

Spoje za nastřikovacím ventilem musí být co nejkratší. V tomto případě má trubka z korozivzdorné oceli mezi výstupem z reaktoru a vstupem do detektoru ochladit směs před detekcí; teplota detektoru není známa, ale je konstantní.

Detektor pro viditelnou a UV oblast;

Zapisovač;

Odstředivka;

Ultrazvuková lázeň;

Vibrační míchadlo (Vortex nebo ekvivalentní).

Sestrojí se vynesením výšek píků jako funkce koncentrace zředěných formaldehydových kalibračních roztoků.

Kalibrační roztoky se připraví zředěním standardního roztoku formaldehydu (5.2.19) mobilní fází (5.2.16):

• 1 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20 ml (asi 185 μg/100 ml)

• 2 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20 ml (asi 370 μg/100 ml)

• 5 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 25 ml (asi 740 μg/100 ml)

• 5 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20 ml (asi 925 μg/100 ml).

Kalibrační roztoky se ponechají asi jednu hodinu stát při pokojové teplotě a musí být čerstvě připraveny.

Kalibrační křivka je lineární pro koncentrace od 1,00 do 15,00 μg/ml.

Do odměrné baňky na 100 ml s uzávěrem se s přesností na 0,001 g naváží zkušební vzorek (m gramů) odpovídající očekávanému obsahu 100 μg formaldehydu. Přidá se přesně 20 ml dichlormethanu (5.2.8) a 20 ml kyseliny chlorovodíkové (5.2.12). Promíchá se pomocí vibračního míchadla (5.3.16) a v ultrazvukové lázni (5.3.15). Fáze se oddělí odstředěním (dvě minuty při 3000 g). Mezitím se promyje patrona (5.3.7) 2 ml methanolu (5.2.7) a kondicionuje se 5 ml vody (5.2.1).

Kondicionovanou patronou se nechají protéci 4 ml vodné fáze extraktu, první dva mililitry se odstraní a následující podíl se zachytí.

Do odměrné baňky na 100 ml s uzávěrem se s přesností na 0,001 g naváží zkušební vzorek (m gramů) odpovídající očekávanému obsahu 500 μg formaldehydu.

Doplní se po rysku mobilní fází (5.2.16).

Roztok se zfiltruje přes filtr (5.3.6) a nastříkne se nebo nechá protéci patronou (5.3.7) předem kondicionovanou podle bodu 5.4.2.1. Všechny roztoky musí být nastříknuty hned po přípravě.

• Průtok mobilní fáze: 1 ml/min,

• Průtok činidla: 0,5 ml/min,

• Celkový průtok na výstupu z detektoru: 1,5 ml/min,

• Objem nástřiku: 10 μl,

• Eluční teplota: u obtížných separací se kolona ponoří do ledové lázně a vyčká se do ustálení teploty (15 až 20 minut),

• Teplota reakce za kolonou: 100 °C,

• Detekce: při 420 nm.

Poznámka: Celý chromatografický systém a systém za kolonou je nutno po použití propláchnout vodou (5.2.1). Nepoužije-li se systém do dvou dnů, musí po tomto proplachu následovat ještě propláchnutí methanolem (5.2.7). Před novým kondicionováním se systémem nechá protéci voda, aby se zabránilo rekrystalizaci.

Obsah formaldehydu v % (m/m):

C · 10−6 · 1005 m = C · 10−45 m

V tomto případě platí vzorec:

C · 10−6 · 100m = C · 10−4m

kde

Při obsahu formaldehydu 0,05 % by neměl rozdíl výsledků dvou stanovení provedených současně se stejným vzorkem překročit 0,001 %.

Při obsahu formaldehydu 0,2 % by neměl rozdíl výsledků dvou stanovení provedených současně se stejným vzorkem překročit 0,005 %.

V této metodě je specifikováno stanovení resorcinolu v šamponech a vlasových lotionech plynovou chromatografií. Metoda je vhodná pro koncentrace od 0,1 do 2,0 hmotnostních procent vzorku.

Obsah resorcinolu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.

Resorcinol a 3,5dihydroxytoluen (5methylresorcinol) přidávaný jako vnitřní standard se ze vzorku oddělí chromatografií na tenké vrstvě. Obě sloučeniny se izolují seškrabáním jejich skvrn z horní vrstvy desky a extrakcí methanolem. Nakonec se vyextrahované sloučeniny vysuší, podrobí silylaci a stanoví se plynovou chromatografií.

Všechna reakční činidla musí být čistoty p.a.

25 % kyselina chlorovodíková (m/m)

Methanol

Ethanol 96 % (v/v)

Silikagelové desky pro chromatografii na tenké vrstvě připravené k použití (plastové nebo hliníkové) s fluorescenčním indikátorem. Desky se deaktivují následujícím postupem: běžná silikagelová deska se nastříká vodou, dokud se povrch neleskne. Nastříkané desky se nechají schnout při pokojové teplotě jednu až tři hodiny.

Bez deaktivace může docházet ke ztrátám resorcinolu v důsledku ireverzibilní adsorpce na silikagelu.

Vyvíjecí rozpouštědlo: aceton – chloroform – kyselina octová (20: 75: 5 objemově).

Standardní roztok resorcinolu: rozpustí se 400 mg resorcinolu ve 100 ml 96 % ethanolu (4.3) (1 ml odpovídá 4000 μg resorcinolu).

Roztok vnitřního standardu: rozpustí se 400 mg 3,5dihydroxytoluenu (DHT) ve 100 ml 96 % ethanolu (4.3) (1 ml odpovídá 4000 μg DHT).

Směs standardů: v odměrné baňce na 100 ml se smíchá 10 ml roztoku 4.6 a 10 ml roztoku 4.7, doplní se po rysku 96 % ethanolem (4.3) a promíchá (1 ml roztoku odpovídá 400 μg resorcinolu a 400 μg DHT).

Silylační činidla:

N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)

Hexamethyldisilazan (HMDS)

Trimethylchlorsilan (TMCS)

Běžné vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě a plynovou chromatografii

Skleněné laboratorní nádobí

Do kádinky na 150 ml se přesně naváží zkušební vzorek (m gramů) výrobku, který obsahuje asi 20 až 50 mg resorcinolu.

Okyselí se kyselinou chlorovodíkovou (4.1) do kyselé reakce (je potřeba přibližně 2 až 4 ml), přidá se 10 ml (40 mg DHT) roztoku vnitřního standardu (4.7) a promíchá se. Ethanolem (4.3) se převede do odměrné baňky na 100 ml, doplní se ethanolem po rysku a promíchá.

250 μl roztoku (6.1.2) se nanese na deaktivovanou desku se silikagelem (4.4) jako nepřerušovaná linie o délce přibližně 8 cm. Je třeba dbát na to, aby linie byla co nejužší.

Na stejnou desku se stejným způsobem (6.1.3) nanese 250 μl směsi standardů (4.8).

Do dvou bodů startovací linie se nanese po 5 μl roztoků 4.6 a 4.7 k usnadnění lokalizace skvrn po vyvolání.

Deska se vyvíjí v nenasycené komoře naplněné vyvíjecím rozpouštědlem 4.5, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 12 cm od startovací linie; obvykle to trvá asi 45 minut. Deska se usuší na vzduchu a zóna resorcinolu/DHT se lokalizuje pod krátkovlnným UV světlem (254 nm). Obě tyto sloučeniny mají přibližně stejnou hodnotu Rf. Poloha pásů se vyznačí tužkou ve vzdálenosti 2 mm od vnějšího tmavého rozhraní pásů. Tyto zóny se z desky odstraní a adsorbenty každého pásu se shromáždí v lahvi na 10 ml.

Adsorbent obsahující vzorek a absorbent obsahující směs standardů se extrahují následujícím způsobem:

přidají se 2 ml methanolu (4.2) a extrahuje se jednu hodinu za neustálého míchání. Směs se zfiltruje a extrakce se opakuje po dobu dalších 15 minut se 2 ml methanolu.

Extrakty se spojí a rozpouštědlo se nechá přes noc odpařit ve vakuovém exsikátoru naplněném vhodným sušicím prostředkem. Nezahřívá se.

Odparky (6.1.8) se silylují způsobem popsaným v bodu 6.1.9.1 nebo 6.1.9.2.

Mikrostříkačkou se přidá 200 μl BSTFA (4.9.1) a směs se nechá v uzavřené nádobě 12 hodin při pokojové teplotě.

Mikrostříkačkou se postupně přidá 200 μl HMDS (4.9.2) a 100 μl TMCS (4.9.3), směs se zahřívá v uzavřené nádobě 30 minut na 60 °C. Směs se ochladí.

Kolona musí poskytovat rozlišení R rovné nebo lepší než 1,5:

R = 2 d′ r2 − r1w1 + w2

kde:

Následující kolona a podmínky pro plynovou chromatografii se ukázaly jako vhodné:

Průtoky vodíku a vzduchu se nastaví podle pokynů výrobce.

Do plynového chromatografu se nastříkne 1 až 3 μl roztoků připravených podle bodu 6.1.9. Pro každý roztok (6.1.9) se provede pět nástřiků, změří se plochy píků, vypočte se průměr a poměr ploch píků: S = plocha píku resorcinolu/plocha píku DHT.

Koncentrace resorcinolu ve vzorku vyjádřená v hmotnostních procentech (% m/m) je dána vztahem:

% resorcinolu = 4M × SvzorkuSstandardni smesi

kde:

Pro obsah resorcinolu asi 0,5 % by neměla absolutní hodnota rozdílu dvou stanovení provedených současně se stejným vzorkem překročit 0,025 %.

V metodě je popsána analýza methanolu ve všech typech kosmetických prostředků (včetně aerosolů) plynovou chromatografií.

Metodou je možno stanovit relativní hladiny od 0 do 10 %.

Obsah methanolu stanovený podle této metody se vyjadřuje v hmotnostních procentech methanolu vzhledem k ethanolu nebo propan-2-olu.

Stanovení se provádí plynovou chromatografií.

Používají se reakční činidla čistoty p.a.

Methanol

Absolutní ethanol

Propan-2-ol

Chloroform zbavený alkoholů promytím vodou

Plynový chromatograf:

• s tepelně vodivostním detektorem pro aerosolové vzorky,

• s plamenovým ionizačním detektorem pro jiné než aerosolové vzorky.

Odměrné baňky na 100 ml

Pipety na 2 ml, 20 ml a 0 až 1 ml

Mikrostříkačky na 0 až 100 μl a 0 až 5 μl

a (pouze pro aerosolové vzorky) speciální plynotěsná injekční stříkačka s posuvným ventilem (viz obrázek 5(Úř. věst. L 383, 31.12.1980, s. 27.), postup odběru vzorků).

Vzorky z výrobků v obalech na aerosoly se odebírají postupem podle kapitoly II přílohy ke směrnici Komise 80/1335/EHS ze dne 22. prosince 1980(Úř. věst. L 383, 31.12.1980, s. 27.) a poté se analyzují plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodu 6.2.1.

Vzorky výrobků, které nejsou v obalech na aerosoly, odebírané postupem podle výše uvedené kapitoly II se zředí vodou na koncentraci 1 až 2 % ethanolu či propan-2-olu a poté se analyzují plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodu 6.2.2.

Pro aerosolové vzorky se použije tepelně vodivostní detektor.

Náplní kolony je 10 % Hallcomid M18 na Chromosorbu WAW, 100 až 200 mesh.

Kolona musí poskytovat rozlišení R rovné nebo lepší než 1,5:

R = 2 d′ r2 − d′ r1w1 + w2

kde:

Tohoto rozlišení je možno dosáhnout za následujících podmínek:

Měření plochy píků je možno vylepšit elektronickou integrací.

Jiné než aerosolové vzorky:

Náplní kolony je Chromosorb 105 nebo Porapak QS; použije se plamenový ionizační detektor.

Kolona musí poskytovat rozlišení R rovné nebo lepší než 1,5:

R = 2 d′ r2 − d′ r1w1 + w2

kde:

Tohoto rozlišení je možno dosáhnout za následujících podmínek:

Pro plynovou chromatografii podle bodu 6.2.1 (náplň kolony Hallcomid M18) se použijí následující standardní směsi. Tyto směsi se připraví odměřením pomocí pipet, ale přesné množství se stanoví zvážením pipety nebo baňky po každém přidání.

Do chromatografu se nastřikují 2 až 3 μl za podmínek uvedených v bodu 6.2.1.

Pro každou směs se vypočtou poměry ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/propan2ol). Sestrojí se kalibrační graf vynesením:

Pro plynovou chromatografii podle bodu 6.2.2 (náplň kolony Porapak QS nebo Chromosorb 105) se použijí následující standardní směsi. Tyto směsi se připraví odměřením pomocí pipet, ale přesné množství se stanoví zvážením pipety nebo baňky po každém přidání.

Do chromatografu se nastřikují 2 až 3 μl za podmínek uvedených v bodu 6.2.2.

Pro každou kalibrační směs se vypočtou poměry ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/propan2ol) a sestrojí se kalibrační graf vynesením:

Kalibrační graf musí být přímkový.

Při relativním obsahu 5 % methanolu vzhledem k ethanolu nebo propan2olu by neměl rozdíl dvou stanovení provedených současně se stejným vzorkem překročit 0,25 %.

• Dřevěná navíjecí cívka:

  vnější průměr 5 cm s otvorem o průměru 1,5 cm uprostřed. Cívka se opatří čtyřmi ocelovými hřebíky (podle obrázků 1 a 2). Vzdálenost mezi dvěma hřebíky musí být 1,8 cm a musí být ve vzdálenosti 0,5 cm od středového otvoru;

• jedna pevná jehla (háček) k protahování teflonové kapiláry;

• 5 m teflonové kapiláry o průměru 1,6 mm, vnitřního průměru 0,3 mm.

Před zhotovením „francouzského pletiva“ musí být teflonová kapilára protažena středovým otvorem od horního konce cívky k dolnímu konci (asi 10 cm kapiláry se nechá vyčnívat z dolního konce cívky, což umožní protáhnout řetízek během pletení); poté se kapilára ovine kolem čtyř hřebíků, jak je znázorněno na obrázku 3.

Horní a dolní část pletiva bude chráněna kovovými kroužky a stahovacími šrouby; při utahování je třeba dbát na to, aby se teflon nepoškodil. Kapilára se podruhé ovine kolem každého hřebíku a následujícím způsobem se vytvoří „stehy“:

• spodní část kapiláry se háčkem přetáhne přes horní část kapiláry (obrázek 4). Toto se postupně opakuje u každého hřebíku (1, 2, 3 a 4 proti směru hodinových ručiček), dokud se nezhotoví 5 m nebo požadovaná délka pletiva.

Je nutno ponechat asi 10 cm kapiláry k uzavření řetízku. Kapilára se provlékne každou ze čtyř smyček a lehce se utáhne tak, aby se řetízek uzavřel.

Poznámka: Francouzské pletivo pro reaktory za kolonou je komerčně dostupné (Supelco).