Použije se ode dne 1. června 2008.

PŘÍLOHA

Poznámka:

Před použitím jakékoli z následujících zkušebních metod ke zkoušení vícesložkové látky, látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexního reakčního produktu nebo biologického materiálu (UVCB) nebo směsi a v případě, že její použitelnost ke zkoušení vícesložkové látky, UVCB nebo směsí není v příslušné zkušební metodě uvedena, je třeba zvážit, zda je metoda přiměřená pro zamýšlené použití v právních předpisech.

Jestliže se zkušební metoda použije ke zkoušení vícesložkové látky, UVCB nebo směsi, měly by být pokud možno k dispozici dostatečné informace o jejím složení, jako např. chemická identita jejích složek, jejich kvantitativní výskyt a vlastnosti složek.

Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).

Popsané metody a přístroje jsou určeny ke stanovení bodu tání látek bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.

Výběr metody závisí na povaze látky, která má být zkoumána. Omezením bude tedy skutečnost, zda lze danou látku rozmělnit na prášek snadno, obtížně nebo zda ji nelze rozmělnit.

U některých látek je vhodnější stanovení bodu tuhnutí nebo krystalizace a normalizované metody pro tato stanovení jsou v této metodě rovněž uvedeny.

Nelze-li vzhledem ke zvláštním vlastnostem látky dobře stanovit žádný z uvedených parametrů, může byt vhodné stanovit bod tekutosti.

Bod tání je definován jako teplota, při níž dochází za atmosférického tlaku k přechodu z pevného do kapalného skupenství a která za ideálních podmínek odpovídá bodu tuhnutí.

Vzhledem k tomu, že u mnoha látek dochází k fázovému přechodu v rozmezí teplot, je toto rozmezí často nazýváno rozmezím bodu tání.

Přepočet jednotek (K na ^oC)

t = T – 273,15

Při zkoumání nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Některé kalibrační látky jsou uvedeny v literatuře (4).

Stanovuje se teplota (teplotní rozmezí) fázového přechodu z pevného do kapalného skupenství nebo z kapalného do pevného skupenství. V praxi se při zahřívání/ochlazování vzorku zkoušené látky za atmosférického tlaku stanoví teploty počátku tání/tuhnutí a konce tání/tuhnutí. Je popsáno pět typů metod, jmenovitě kapilární metoda, metody používající zahřívací bloky, metody stanovení bodu tuhnutí, metody termické analýzy a stanovení bodu tekutosti (vyvinuto pro minerální oleje).

V některých případech může být vhodné měřit bod tuhnutí místo bodu tání.

Malé množství jemně rozmělněné látky se vpraví do kapiláry a zhutní se. Kapilára se zahřívá spolu s teploměrem, přičemž se rychlost nárůstu teploty během tání nastaví na méně než 1 K/min. Stanoví se teploty počátku a konce tání.

Provádí se podobně jako v bodě 1.4.1.1 s tím rozdílem, že kapilára a teploměr jsou umístěny v kovovém vyhřívaném bloku a pozorují se otvory v bloku.

Vzorek v kapiláře se automaticky zahřívá v kovovém válci. Otvorem ve válci prochází látkou světelný paprsek na přesně kalibrovaný fotočlánek. Při tání mění většina látek optické vlastnosti a z neprůhledných se mění na průhledné. V tomto okamžiku vzroste intenzita světla dopadajícího na fotočlánek a do zařízení odečítajícího teplotu platinového odporového teploměru umístěného v topné komůrce je vyslán signál k zastavení zaznamenávání. Tato metoda není vhodná pro některé silně zbarvené látky.

Koflerův zahřívací stolek je tvořen dvěma kovovými částmi s různou teplotní vodivostí, je vyhříván elektricky a je konstruován tak, že teplotní gradient je po jeho délce téměř lineární. Teplota stolku se může měnit od 283 do 573 K; stolek je vybaven speciálním zařízením pro odečítání teploty, tvořeným jezdcem s ukazatelem a stupnici navrženou pro daný stolek. Pro stanovení bodu tání se látka nanese v tenké vrstvě přímo na povrch stolku. Během několika sekund se vytvoří ostrá dělicí linie mezi kapalnou a pevnou fázi. Teplota v místě dělicí linie se odečte po nastavení ukazatele na tuto dělicí linii.

Pro stanovení bodu tání velmi malých množství látek se používají různé typy mikroskopů s ohřívacím stolkem. Většina ohřívacích stolků využívá k měření teploty citlivé termočlánky, používají se však i rtuťové teploměry. Typický přístroj pro stanovení bodu tání pomocí mikroskopu s ohřívacím stolkem má ohřívací komoru s kovovou deskou, na kterou se umístí vzorek na podložním sklíčku. Ve středu kovové desky je otvor, kterým může procházet světelný paprsek odražený osvětlovacím zrcátkem mikroskopu. Při měřeních se ohřívací komora přikryje skleněnou destičkou, aby se omezila cirkulace vzduchu v místě, kde se nachází vzorek.

Ohřev vzorku se kontroluje regulačním odporem. Pro velmi přesná měření opticky anisotropních látek lze používat polarizované světlo.

Tato metoda se používá především pro polyamidy.

Vizuálně se stanoví teplota, při které se zřetelně posune meniskus silikonového oleje uzavřeného mezi ohřívacím blokem a skleněnou krycí destičkou umístěnou na vzorku zkoušeného polyamidu.

Vzorek se vloží do speciální zkumavky, která se umístí do přístroje pro stanovení bodu tuhnutí. Během ochlazování se vzorek nepřetržitě pomalu míchá a ve vhodných intervalech se odečítá teplota. Jakmile je teplota po několik odečtů konstantní (po odpovídající korekci teploměru), je zaznamenána jako bod tuhnutí.

Podchlazení je nutno zabránit udržováním rovnováhy mezi pevnou a kapalnou fází.

Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi látkou a referenčním materiálem, jež jsou podrobeny stejnému řízenému teplotnímu programu. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu teploty.

Při této technice se látka a referenční materiál podrobí stejnému řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie absorbované látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty. Tato energie je energií potřebnou k zachování nulového teplotního rozdílu mezi látkou a referenčním materiálem. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu tepelného toku.

Metoda byla vyvinuta pro minerální oleje a je vhodná pro měření olejovitých látek s nízkým bodem tání.

Po počátečním zahřátí se vzorek určitou rychlostí ochlazuje a v intervalech po 3 K se stanovuje jeho tekutost. Nejnižší teplota, při níž je ještě pozorován pohyb látky, se zaznamená jako bod tekutosti.

Použitelnost a přesnost různých metod stanovení bodu tání/rozmezí bodu tání jsou uvedeny v této tabulce.

Postupy téměř všech těchto zkušebních metod jsou popsány v národních a mezinárodních normách (viz doplněk 1).

Při pomalém vzestupu teploty lze u jemně práškovitých látek obvykle rozlišit stupně tání znázorněné na obrázku 1.

Během stanovení bodu tání se zaznamenávají teploty počátku tání a konečné fáze.

Na obrázku 2 je znázorněna normalizovaná skleněná aparatura pro stanovení bodu tání (JIS K 0064); všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech.

Je třeba zvolit vhodnou kapalinu. Volba kapaliny závisí na bodu tání, který má být stanoven, např. kapalný parafin pro stanovení bodu tání nižšího než 473 K, silikonový olej pro stanovení bodu tání nižšího než 573 K.

Pro stanovení bodu tání vyššího než 523 K lze použít směs tří hmotnostních dílů kyseliny sírové a dvou hmotnostních dílů síranu draselného. S tímto typem směsi je třeba pracovat s náležitou opatrností.

Měly by se používat pouze teploměry, které splňují požadavky norem ASTM E 171, DIN 12770, JIS K 8001 nebo rovnocenných norem.

ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Suchá látka se jemně rozetře v třecí misce a vpraví se do kapiláry zatavené na jednom konci, a to tak, aby po zhutnění byla kapilára naplněna do výšky přibližně 3 mm. Má-li se dosáhnout stejnoměrného zhutnění, nechá se kapilára dopadnout z výšky přibližně 700 mm skleněnou trubicí na hodinové sklíčko.

Naplněná kapilára se vloží do lázně tak, aby se střední část rtuťové baňky teploměru dotýkala kapiláry v místě, kde se nachází vzorek. Kapilára se obvykle vkládá do lázně při teplotě asi o 10 K nižší, než je bod tání.

Lázeň se zahřívá tak, aby vzestup teploty činil přibližně 3 K/min. Lázeň se míchá. Asi 10 K pod očekávaným bodem tání se růst teploty upraví na nejvýše 1 K/min.

Bod tání se vypočte takto:

T = T_D + 0,00016 (T_D – T_E)n

kde:

Je tvořen:

• válcovým kovovým blokem, jehož horní část je dutá a tvoří komoru (viz obrázek 3),

• kovovou krycí deskou se dvěma nebo více otvory, kterými je možno do kovového bloku zavést trubičky,

• ohřívacím systémem kovového bloku, například elektrickým topným odporem uzavřeným v kovovém bloku,

• regulačním odporem pro regulaci příkonu, je-li použit elektrický ohřev,

• čtyřmi okénky ze žáruvzdorného skla v bočních stěnách ohřívací komory, orientovanými vůči sobě pod pravým úhlem. Před jedním z těchto okének je umístěn okulár pro pozorování kapilární trubičky. Ostatní tři okénka slouží k osvětlení vnitřního prostoru žárovkami,

• kapilární trubičkou z žáruvzdorného skla zatavenou na jednom konci (viz 1.6.1.1).

Viz normy uvedené v 1.6.1.1. Je rovněž možné použít termoelektrické měřicí přístroje srovnatelné přesnosti.

Přístroj a postup:

Přístroj se skládá z kovové komory s automatickým ohřívacím zařízením. Tři kapilární trubičky se naplní podle bodu 1.6.1.1 a umístí se do ohřívací komory.

Pro kalibraci přístroje je k dispozici několik lineárních režimů růstu teploty, přičemž vhodný lineární růst teploty se elektricky nastaví předem zvolenou konstantou. Zaznamenávací zařízení ukazují teplotu v ohřívací komoře a teplotu látky v kapilárách.

Viz doplněk.

Viz doplněk.

Viz doplněk.

V oblasti bodu tání by měla být rychlost ohřevu menší než 1 K/min.

Viz doplněk.

Viz doplněk.

Viz doplněk.

Viz doplněk.

V některých případech je nutno provést korekci teploměru.

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

• použitá metoda,

• přesná specifikace látky (identifikace a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění,

• odhad přesnosti.

Jako bod tání se uvede střední hodnota alespoň dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí odhadnuté přesnosti (viz tabulky).

Leží-li rozdíl teplot počáteční a konečné fáze tání v mezích přesnosti metody, uvede se jako bod tání konečná teplota, v opačném případě se uvedou obě teploty.

Jestliže se látka před dosažením bodu tání rozkládá nebo sublimuje, uvede se teplota, při které dochází k pozorovanému jevu.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).

Popsané metody a zařízení lze použít pro kapaliny a látky s nízkým bodem tání, pokud nepodléhají chemickým reakcím pod bodem varu (např. autooxidaci, přesmyku, rozkladu atd.). Metody lze použít jak pro čisté kapalné látky, tak pro kapalné látky obsahující nečistoty.

Přednost mají metody využívající detekci fotočlánkem a metody termické analýzy, protože umožňují stanovení jak bodu tání, tak bodu varu. Tato měření mohou být navíc prováděna automaticky.

„Dynamická metoda“ má tu výhodu, že ji lze použít i ke stanovení tlaku par a přitom není třeba korigovat bod varu na normální tlak (101,325 kPa), neboť tento tlak lze během měření nastavit manostatem.

Poznámky:

Vliv nečistot na stanovení bodu varu závisí ve velké míře na jejich povaze. Jestliže vzorek obsahuje těkavé nečistoty, které mohou ovlivnit výsledky, může být látky přečištěna.

Standardní bod varu je definován jako teplota, při které je tlak par dané kapaliny roven 101,325 kPa.

Jestliže se měření bodu varu neprovádí za normálního tlaku, lze závislost tlaku par na teplotě popsat Clausiovou-Clapeyronovou rovnicí:

kde:

Bod varu se uvádí s ohledem na okolní tlak při měření.

Přepočty

Tlak (jednotka: kPa)

1 bar = 0,1 Mpa

(jednotka „bar“ je nadále přípustná, její používání se však nedoporučuje)

1 mm Hg = 1 torr

(jednotky „mm Hg“ a „torr“ nejsou povoleny)

standardní atmosféra = 101325 Pa

(jednotka „atm“ není povolena).

Teplota (jednotka:K)

t = T – 273,15

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Některé kalibrační látky jsou uvedeny v doplňku.

Pět metod stanovení bodu varu (teplotního rozmezí bodu varu) je založeno přímo na měření teploty varu, další dvě využívají termální analýzy.

Ebuliometry byly původně vyvinuty pro stanovení molekulové hmotnosti na základě zvýšení teploty varu, jsou však vhodné také pro přesná měření bodu varu. Velmi jednoduchý přístroj je popsán v normě ASTM D 112072 (viz doplněk). V tomto přístroji se kapalina zahřívá za rovnovážných podmínek při atmosférickém tlaku, dokud nezačne vřít.

Metoda zahrnuje měření teploty kondenzace páry vhodným teploměrem umístěným za varu ve zpětném toku (refluxu). U této metody lze měnit tlak.

Metoda zahrnuje destilaci kapaliny a měření teploty kondenzace páry, přičemž se stanovuje také množství destilátu.

Vzorek se zahřívá ve zkumavce, která je ponořena do tepelné lázně. Do zkumavky se vzorkem je zasunuta zatavená kapilára, v jejíž spodní části se nachází vzduchová bublinka.

Při použití principu unikajících bublinek podle Siwoloboffa se provádí automatické fotoelektrické měření.

Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty, přičemž látka a referenční materiál se podrobí témuž řízenému teplotnímu programu. Jestliže u studované látky dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu teploty.

Při této technice se látka a referenční materiál podrobí stejnému řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie absorbované látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty. Tato energie je energií potřebnou k zachování nulového teplotního rozdílu mezi látkou a referenčním materiálem. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu tepelného toku.

Použitelnost a přesnost různých metod používaných pro stanovení bodu/teplotního rozmezí bodu varu jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1 Srovnání metod

Postupy některých zkušebních metod jsou popsány v mezinárodních a národních normách (viz doplněk).

Viz doplněk.

Viz metoda A.4 pro stanovení tlaku par.

Zaznamená se teplota varu naměřená při tlaku 101,325 kPa.

Viz doplněk.

Vzorek se zahřívá ve zkumavce o průměru přibližně 5 mm v přístroji pro stanovení bodu tání (obrázek 1).

Na obrázku 1 je znázorněn normalizovaný přístroj pro stanovení bodu varu (JIS K 0064) (přístroj je skleněný, všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech).

Do zkumavky se vloží kapilára (varná kapilára) zatavená asi 1 cm nad spodním koncem. Zatavená část kapiláry musí ležet pod hladinou kapaliny. Zkumavka obsahující kapiláru se upevní buď pryžovou páskou k teploměru, nebo pomocí bočního držáku (viz obrázek 2).

Kapalina pro lázeň se volí podle bodu varu. Pro teploty do 573 K lze použít silikonový olej. Parafinový olej lze použít pouze do 473 K. Kapalina v lázni se zahřívá tak, aby vzestup teploty byl zpočátku asi 3 K/min. Lázeň se míchá. Asi 10 K před očekávaným bodem tání se zahřívání sníží tak, aby nárůst teploty byl nejvýše 1 K/min. Krátce před dosažením bodu varu začnou z varné kapiláry rychle unikat bublinky.

Bodu varu je dosaženo, když při ochlazování náhle ustane unikáni bublinek a kapalina začne v kapiláře stoupat. Příslušný údaj na teploměru je bodem varu látky.

Modifikovanou metodou (obrázek 3) se bod varu stanovuje v kapiláře pro stanovení bodu tání. Ta se vytáhne do tenké špičky dlouhé asi 2 cm (a) a do ni se nasaje malé množství vzorku. Otevřený konec tenké části kapiláry se zataví tak, aby na konci byla malá vzduchová bublinka. Při zahřívání v aparatuře pro stanoveni bodu táni (b) se vzduchová bublinka rozpíná. Bod varu odpovídá teplotě, při které sloupeček látky dosáhne hladiny kapalinové lázně (c).

Vzorek se zahřívá v kapiláře ve vyhřívaném kovovém bloku.

Otvory v bloku se vede světelný paprsek tak, aby procházel látkou na přesně kalibrovaný fotočlánek.

Při zvyšování teploty vzorku stoupají z kapiláry jednotlivé vzduchové bublinky. Při dosažení bodu varu počet bublinek značně vzroste. To vede ke změně intenzity světla zaznamenané fotočlánkem a vyvolá signál v měřicím přístroji, kterým se zastaví zaznamenávání teploty měřené platinovým odporovým teploměrem umístěným v bloku.

Tato metoda je zvláště vhodná, protože umožňuje stanovení teplot nižších než laboratorní teplota až do 253,15 K (–20 ^oC) bez jakékoli úpravy přístroje. Pouze je třeba umístit přístroj v chladicí lázni.

Viz doplněk.

Viz doplněk.

Při malých odchylkách od normálního tlaku (nejvýše ± 5 kPa) se hodnoty teploty varu přepočítávají na normalizovanou teplotu T_n pomocí Sidneyovy-Youngovy rovnice:

T_n = T + (f_T × Δp)

kde:

Teplotní korekční faktory f_T a rovnice pro jejich aproximaci jsou uvedeny pro řadu látek ve zmíněných mezinárodních a národních normách.

Například metoda podle DIN 53171 uvádí přibližné korekce pro rozpouštědla obsažená v nátěrových hmotách:

Tabulka 2 Teplotní korekční faktory f_T

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

• použitá metoda,

• přesná specifikace látky (identifikace a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění,

• odhad přesnosti.

Jako bod varu se uvede střední hodnota alespoň dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí odhadnuté přesnosti (viz tabulka 1).

Uvedou se naměřené teploty varu a jejich střední hodnota a dále hodnota tlaku v kPa, při kterém byla měření provedena. Tlak by se měl pokud možno blížit normálnímu tlaku.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Základní principy jsou uvedeny v literatuře (2).

Popsané metody jsou určeny pro měření povrchového napětí vodných roztoků.

Před provedením těchto zkoušek je vhodné mít k dispozici předběžné informace o rozpustnosti látky ve vodě, o její struktuře, o hydrolýze a o kritické koncentraci pro tvorbu micel.

Níže uvedené metody jsou použitelné pro většinu chemických látek bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.

Měření povrchového napětí metodou prstencového tenziometru je omezeno na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižší než přibližně 200 mPa/s.

Povrchová volná enthalpie vztažená na jednotku povrchu se nazývá povrchové napětí.

Povrchové napětí se vyjadřuje těchto jednotkách:

N/m (v soustavě SI) nebo

mN/m (odvozená jednotka v soustavě SI)

1 N/m= 103 dyn/cm

1 mN/m = 1 dyn/cm ve staré soustavě CGS

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Referenční látky, které pokrývají široké rozpětí hodnot povrchového napětí, jsou uvedeny v literatuře (1, 3).

Metody jsou založeny na měření největší síly, kterou je nutné působit ve svislém směru na třmínek nebo prstenec, který se dotýká povrchu zkoumané kapaliny umístěné v měřicí nádobě, aby se od tohoto povrchu oddělil, nebo na destičku, která se svým okrajem dotýká povrchu, aby se vzniklý film vytáhl nahoru.

Látky, jejichž rozpustnost ve vodě dosahuje hodnoty alespoň 1 mg/1, se zkoušejí ve vodných roztocích při jedné koncentraci.

Přesnost těchto metod je pravděpodobně vyšší, než je požadováno pro účely hodnocení stavu životního prostředí.

Připraví se roztok látky v destilované vodě. Koncentrace roztoku by měla být 90 % koncentrace nasyceného roztoku látky ve vodě; pokud tato koncentrace přesáhne 1 g/l, použije se k měření roztok o koncentraci 1 g/l. Látky, jejichž rozpustnost je menší než 1 mg/l, není nutné zkoušet.

Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

Pro toto měření jsou vhodné komerční tenziometry. Skládají se z těchto částí:

• pohyblivý stolek pro vzorek,

• systém měření síly,

• měřicí tělísko,

• měřicí nádoba.

Pohyblivý stolek pro vzorek slouží jako podložka pro termostatovanou měřicí nádobu, ve které je kapalina, která má být zkoušena. Spolu se systémem měření síly je upevněn na stojanu.

Systém měření síly je umístěn nad stolkem pro vzorek (viz obrázek). Chyba měření síly nemá překročit ± 10^–6 N, což odpovídá chybě ± 0,1 mg při měřeni hmotnosti. Ve většině případů je měřicí stupnice komerčních tenziometrů dělena v mN/m, takže je možné povrchové napětí odečítat přímo v mN/m s přesností na 0,1 mN/m.

Prstenec je obvykle zhotoven z platino-iridiového drátu o průměru asi 0,4 mm a středním obvodu 60 mm. Prstenec z drátu je zavěšen vodorovně na upevňovací vidlici z drátu a na kovové tyčince, která tvoří spojení k systému měření síly (viz obrázek).

(všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech)

Měřicí nádobou pro zkušební roztok je termostatovaná skleněná nádoba. Má být konstruována tak, aby teplota zkoumané kapaliny i plynné fáze nad jejím povrchem zůstala během měření konstantní a aby se vzorek nemohl odpařovat. Vhodná je válcová skleněná nádoba o vnitřním průměru nejméně 45 mm.

Skleněné nádoby je třeba pečlivě vyčistit. Pokud je to nutné, měly by se vymýt horkou kyselinou chromsírovou a následně koncentrovanou kyselinou fosforečnou (83 až 98 % hmot. H₃PO₄), pečlivě vypláchnout tekoucí vodou a nakonec omýt redestilovanou vodou do neutrální reakce a následně vysušit nebo vypláchnout vzorkem kapaliny, která má být měřena.

Prstenec je třeba nejprve pečlivě umýt vodou, aby se odstranily všechny látky rozpustné ve vodě. Poté se krátce ponoří do kyseliny chromsírové, opláchne se v redestilované vodě do neutrální reakce a nakonec se krátce ohřeje nad methanolovým plamenem.

Poznámka:

Znečištění látkami, které se nerozpouštějí ani nerozkládají kyselinou chromsírovou ani kyselinou fosforečnou, jako například silikony, je nutné odstraňovat vhodnými organickými rozpouštědly.

Validace aparatury spočívá v ověření nuly a v nastavení přístroje tak, aby jeho data umožňovala spolehlivé stanovení v mN/m.

Přístroj musí být nastaven do vodorovné polohy, např. pomocí libely položené na základovou desku tenziometru a nastavením stavěcích šroubů základnové desky.

Po upevnění prstence na aparatuře a před ponořením do kapaliny je třeba nastavit nulu ukazatele tenziometru a zkontrolovat rovnoběžnost prstence s hladinou kapaliny. K tomu je možné použít hladiny kapaliny jako zrcadla.

Vlastní kalibraci před měřením je možné provést dvěma postupy:

• a) Použitím závaží: při tomto postupu se použijí jezdce o známé hmotnosti od 0,1 g do 1,0 g, které se umístí na prstenec. Kalibrační faktor Ф_a, kterým je třeba násobit všechny hodnoty odečtené na přístroji, je možné určit podle rovnice (1):

  (1)

  kde:

  (mN/m)

  mhmotnost jezdce (g),gtíhové zrychlení (981 cm s^–2 na úrovni hladiny moře),bstřední obvod prstence (cm)σ_aodečtená hodnota na tenziometru po umístění jezdců na prstenec (mN/m).

• b) Použitím vody: při tomto postupu se použije čistá voda, jejíž povrchové napětí má při 23 ^oC hodnotu 72,3 mN/m. Tento postup lze provést rychleji než kalibraci se závažími, ale existuje vždy nebezpečí, že povrchové napětí vody je zkresleno stopovým znečištěním povrchově aktivními látkami.

  Kalibrační faktor Φ_b, kterým je třeba násobit všechny hodnoty odečtené na přístroji, je možné určit podle rovnice (2):

  (2)

  kde:

  σ_ohodnota povrchového napětí vody uvedená v literatuře (mN/m),σ_gnaměřená hodnota povrchového napětí vody (mN/m), obě při stejné teplotě.

Připraví se vodné roztoky zkoušených látek o požadované koncentraci, které nesmějí obsahovat nerozpuštěné složky.

Roztoky musí být udržovány při konstantní teplotě (± 0,5^oC). Protože se povrchové napětí roztoku v měřicí nádobě v čase mění, provedou se měření v různých časech a sestrojí se křivka závislosti povrchového napětí na čase. Nedochází-li k žádným dalším změnám, bylo dosaženo rovnovážného stavu.

Měření je ovlivňováno znečištěním prachem nebo plynnými látkami. Práce musí být tedy prováděny pod ochranným krytem.

Měření se provádí přibližně při 20 ^oC a udržuje se tolerance ± 0,5^oC.

Roztoky, které mají být měřeny, se převedou do pečlivě vyčištěné měřicí nádoby, přičemž je třeba dbát na to, aby nedošlo k pěnění, a nádoba se poté postaví na stolek zkušební aparatury. Horní část stolku s měřicí nádobou se vysune tak vysoko, aby se prstenec ponořil pod povrch roztoku, který má být měřen. Horní část stolku se následně postupně a rovnoměrně sníží (rychlostí přibližně 0,5 cm/min), aby došlo k oddělení prstence od povrchu, a to až do dosažení maximální hodnoty síly. Film kapaliny lpící na prstenci se od něho nesmí odtrhnout. Po ukončení měření se prstenec opět ponoří pod povrch a postup se opakuje až do dosažení konstantní hodnoty povrchového napětí. Při každém stanovení se začne zaznamenávat čas v okamžiku plnění roztoku do měřicí nádoby. Odečty se provedou vždy v okamžiku, kdy je dosaženo maximální síly nutné pro oddělení prstence od povrchu kapaliny.

Za účelem výpočtu povrchového napětí se hodnota odečtená na přístroji v mN/m nejprve vynásobí kalibračním faktorem Φ_a nebo Φ_b (podle použitého postupu kalibrace). Získá se tak hodnota, která však platí pouze přibližně, a vyžaduje proto korekci.

Harkins a Jordan (4) empiricky stanovili korekční faktory pro hodnoty povrchového napětí měřeného prstencovou metodou, které závisí na rozměrech prstence, hustotě kapaliny a jejím povrchovém napětí.

Vzhledem k tomu, že je zdlouhavé stanovovat pro každé jednotlivé měření korekční faktor z tabulek Harkinse a Jordana, lze pro výpočet povrchového napětí vodných roztoků použít zjednodušenou metodu, která spočívá v odečtu korigovaných hodnot povrchového napětí přímo z tabulky. (Pro odečtené hodnoty, které leží mezi hodnotami uvedenými v tabulce, se provede interpolace.)

Tabulka Korekce naměřených hodnot povrchového napětí Pouze pro vodné roztoky ρ = 1 g/cm³

Tabulka byla sestavena na základě korekcí podle Harkinse a Jordana. Je obdobou tabulky podle normy DIN 53914 pro vodu a vodné roztoky (hustota p = 1 g/cm³); platí pro běžný komerční prstenec o rozměrech R = 9,55 mm (střední poloměr prstence) a r = 0,185 mm (poloměr drátu prstence). Tabulka udává korigované hodnoty pro měření povrchového napětí získané po kalibraci závažími nebo vodou.

Jiným řešením je vypočítat povrchové bez předchozí kalibrace podle rovnice:

kde:

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

• použitá metoda,

• druh vody nebo použitého roztoku,

• přesná specifikace látky (identifikace a nečistoty),

• výsledky měření: povrchové napětí (odečtené hodnoty) s uvedením jednotlivých odečtených hodnot a jejich aritmetického průměru a rovněž korigované střední hodnoty (přičemž se bere v úvahu kalibrační faktor a tabulka korekcí),

• koncentrace roztoku,

• zkušební teplota,

• stáří použitého roztoku, zejména časový odstup mezi přípravou roztoku a měřením,

• znázornění časové závislosti povrchového napětí po převedení roztoku do měřicí nádoby,

• uvedou se všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

Vzhledem k tomu, že povrchové napětí vody je 72,75 mN/m při 20 ^oC, měly by být látky vykazující za podmínek této metody povrchové napětí menší než 60 mN/m považovány za povrchově aktivní materiály.

• běžné laboratorní skleněné nádoby a pomůcky,

• zařízení pro třepání roztoků při regulované konstantní teplotě,

• odstředivka (nejlépe termostatovaná), je-li nutná v případě emulzí a

• analytické vybavení.

• 1) Směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek, Úř. věst. L 383 A, 29.12.1992, s. 54.
• 2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
• 3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro dané sledované vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Tato metoda umožňuje stanovit, zda u pevné nebo pastovité látky existuje nebezpečí výbuchu, je-li podrobena působení plamene (citlivost na působení tepla), nárazu nebo tření (citlivost na mechanické podněty), a zda u kapalné látky existuje nebezpečí výbuchu, je-li podrobena působení plamene nebo nárazu.

Metoda sestává ze tří částí:

• a) zkouška citlivosti na působení tepla (1);
• b) zkouška mechanické citlivosti na náraz (1);
• c) zkouška mechanické citlivosti na tření (1).

Metoda poskytuje data pro stanovení pravděpodobnosti vyvolání výbuchu určitými běžnými podněty. Metoda neslouží ke zjištění, zda je látka schopna vybuchnout za jakýchkoli podmínek.

Metoda je vhodná pro zjištění, zda u látky existuje nebezpečí výbuchu (citlivost na působení tepla a mechanická citlivost) za určitých podmínek specifikovaných ve směrnici. Je založena na řadě typů zařízení, která jsou široce používána v mezinárodním měřítku (1) a která obvykle poskytují vypovídající výsledky. Připouští se, že tato metoda není definitivní. Lze použít jiné než specifikované zařízení, za předpokladu, že je mezinárodně uznané a že lze výsledky vhodným způsobem srovnat s výsledky poskytnutými specifikovaným zařízením.

Zkouška nemusí být provedena, jestliže z dostupných termodynamických informací (např. ze slučovacího tepla nebo disociačního tepla) a/nebo z nepřítomnosti určitých reakčních skupin (2) ve struktuře s jistotou vyplývá, že látka nemá schopnost rychle se rozkládat za vývoje plynů nebo za uvolňování tepla (tzn. materiál nepředstavuje žádné riziko výbuchu). Zkouška mechanické citlivosti na tření se nevyžaduje u kapalin.

Výbušná látka:

Látka, která může vybuchnout působením plamene nebo která je citlivá na náraz nebo tření ve specifikovaném zařízení (nebo je mechanicky citlivější než 1,3-dinitrobenzen v alternativním zařízení).

1,3-dinitrobenzen, technický krystalický výrobek, prosetý na sítu o velikosti oka 0,5 mm, pro metody citlivosti na tření a na náraz.

Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (označovaný jako RDX nebo hexogen nebo cyklonit – CAS 121-82-4) rekrystalizovaný z vodného cyklohexanonu, prosetý za mokra na sítě 250 μm a zachycený na sítě 150 μm, sušený 4 hodiny při 103 ± 2 ^oC pro druhou sérii zkoušek citlivosti na tření a na náraz.

Pro zjištění bezpečných podmínek pro provedení tří zkoušek citlivosti jsou nezbytné předběžné zkoušky.

Z bezpečnostních důvodů se před provedením hlavních zkoušek podrobí velmi malé neuzavřené vzorky látky (přibližně 10 mg) zahřívání v plameni plynového hořáku, nárazu v jakémkoli vhodném zařízení a tření za použití paličky proti podložce nebo jiného zařízení pro zkoušení citlivosti natření. Účelem předběžných zkoušek je zjistit, zda je látka tak citlivá a výbušná, že by měly být předepsané zkoušky citlivosti, zvláště zkouška citlivosti na působení tepla, prováděny za zvláštních bezpečnostních opatření, aby nedošlo k poranění osoby provádějící zkoušky.

Metoda spočívá v zahřívání látky v ocelové trubce uzavřené clonami s různými průměry otvorů s cílem zjistit, zda může za podmínek intenzivního zahřívání a při definovaném utěsnění vybuchnout.

Metoda spočívá ve vystavení látky nárazu specifikovaným závažím puštěným ze specifikované výšky.

Metoda spočívá ve vystavení pevných nebo pastovitých látek tření mezi standardními povrchy za specifikovaných podmínek zatížení a vzájemného pohybu.

Nejsou stanovena.

Zařízení je tvořeno ocelovou trubkou na jedno použití s opakovaně použitelným uzavíracím zařízením (obrázek 1), instalovanou v ohřívacím a ochranném zařízení. Každá trubka je hlubokotažená z ocelového plechu (viz doplněk) a má vnitřní průměr 24 mm, délku 75 mm a tloušťku stěny 0,5 mm. Na otevřeném konci trubky je příruba sloužící k uzavření trubky sestavou clony. Sestava je tvořena clonou se středovým otvorem odolnou vůči tlaku, připevněnou k trubce pomocí dvoudílného šroubového spoje (matice a závitové příruby). Matice a závitová příruba jsou zhotoveny z chrommanganové oceli (viz doplněk), která je do 800 ^oC nejiskřivá. Clony mají tloušťku 6 mm, jsou vyrobeny ze žáruvzdorné oceli a tvoří řadu podle velikosti otvorů.

Látka se obvykle zkouší ve stavu, v jakém byla obdržena, ačkoliv v některých případech, např. je-li lisovaná, litá nebo jiným způsobem zhutněná, může být nezbytné ji před provedením zkoušky rozdrtit.

U pevných látek se hmotnost látky, která má být použita v každé zkoušce, stanoví zkouškou ve dvou etapách. Zvážená trubka se naplní 9 cm látky a látka se po celém průřezu trubky stlačí silou 80 N. Z bezpečnostních důvodů nebo v případech, kdy může stlačováním dojít ke změně fyzikální formy vzorku, lze použít jiný způsob plnění, například je-li látka velmi citlivá na tření, není vhodné ji stlačovat. Je-li látka stlačitelná, přidá se a stlačuje další množství látky, dokud není trubka zaplněna do úrovně 55 mm od horního okraje. Stanoví se celkové množství látky použité pro naplnění do úrovně 55 mm od horního okraje a přidají se další dva podíly látky, přičemž se každý stlačí silou 80 N. Látka se poté podle potřeby buď přidá a stlačí, nebo se odebere tak, aby byla trubka naplněna do úrovně 15 mm od horního okraje. Provede se druhá zkouška, přičemž se začne s třetinou hmotnosti po stlačení zjištěné v první etapě. Přidají se další dva podíly, stlačí se silou 80 N a podle potřeby se látka přidá nebo odebere do úrovně 15 mm od horního okraje trubky. Množství pevné látky zjištěné ve druhé etapě se použije pro každý pokus; naplnění se provede se třemi stejnými množstvími a každé z nich se stlačí na objem 9 cm bez ohledu na potřebnou sílu (pro usnadnění lze k tomuto účelu použít rozpěrné kroužky).

Kapaliny a gely se naplní do trubky do výšky 60 mm, přičemž je třeba věnovat zvláštní pozornost gelům, aby se v nich netvořily dutiny. Na trubku se zdola navleče závitová příruba, vloží se vhodná clona a po nanesení maziva na bázi disulfidu molybděničitého se matice utáhne. Je důležité se přesvědčit, zda nějaká látka nezůstala zachycena mezi přírubou a clonou nebo v závitech.

K zahřívání se použije propan odebíraný z průmyslové tlakové lahve s regulátorem tlaku (60 až 70 mbar) přes průtokoměr a rovnoměrně rozdělený rozdělovacím potrubím do čtyř hořáků (ověří se vizuálně pozorováním plamenů hořáků). Hořáky se umístí kolem zkušební komory, jak je znázorněno na obrázku 1. Čtyři hořáky mají celkovou spotřebu přibližně asi 3,2 litru propanu za minutu. Lze použít jiné palivo a hořáky, avšak rychlost ohřevu musí být taková, jak je uvedeno na obrázku 3. Rychlost ohřevu se musí u všech zařízení pravidelně kontrolovat za použití trubek naplněných dibutylftalátem, jak je znázorněno na obrázku 3.

Každá zkouška se provádí do roztržení trubky nebo dokud doba ohřevu nedosáhne 5 minut. Výsledek zkoušky, při níž došlo k roztržení trubky na tři nebo více úlomků, z nichž některé mohou být vzájemně spojeny úzkými proužky kovu, jak je znázorněno na obrázku 2, se hodnotí jako výbuch. Výsledek zkoušky, při níž vzniklo méně úlomků nebo k roztržení nedošlo, se nehodnotí jako výbuch.

Nejprve se provede série tří zkoušek s clonou o průměru otvoru 6,0 mm, a pokud nedojde k výbuchu, provede se druhá série tří zkoušek s clonou o průměru otvoru 2,0 mm. Dojde-li k výbuchu u kterékoli zkušební série, nevyžadují se další zkoušky.

Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, dojde-li k výbuchu při jedné z výše uvedených zkušebních sérií.

Základními částmi typických zařízení s padacím kladivem je blok z lité oceli s podstavcem, kovadlina, sloup, vodicí lišty, padací závaží, uvolňovací zařízení a držák vzorku. Ocelová kovadlina o průměru 100 mm a výšce 70 mm je přišroubována k horní straně bloku z lité oceli o délce 230 mm, šířce 250 mm a výšce 200 mm se základovou litinovou deskou o délce 450 mm, šířce 450 mm a výšce 60 mm. Sloup tvořený bezešvou taženou ocelovou trubkou je připevněn držákem přišroubovaným na zadní stranu bloku z lité oceli. Čtyři šrouby ukotvují zařízení k betonovému bloku o rozměrech 60 × 60 × 60 cm takovým způsobem, že jsou vodicí lišty dokonale svislé a padací závaží padá volně. Používá se závaží o hmotnosti 5 a 10 kg z pevné oceli. Úderová hlava každého závaží je z tvrzené oceli HRC 60 až 63 a má minimální průměr 25 mm.

Zkoušený vzorek se uzavře do zkušebního zařízení tvořeného dvěma plnými souosými válci umístěnými nad sebou a vodicím pouzdrem tvořeným dutým ocelovým válcem. Plné ocelové válce o průměru 10 (– 0,003, – 0,005) mm a výšce 10 mm mají vyleštěné plochy, zakulacené hrany (s poloměrem zakřivení 0,5 mm) a tvrdost HRC 58 až 65. Dutý válec musí mít vnější průměr 16 mm, vyleštěný vyvrtaný otvor o průměru 10 (+ 0,005, + 0,010) mm a výšku 13 mm. Sestavené zkušební zařízení se umístí na výměnnou ocelovou mezipodložku (o průměru 26 mm a výšce 26 mm), která je vystředěna kroužkem s otvory pro odvod dýmů.

Objem vzorku by měl být 40 mm³ nebo by měl být vhodný pro alternativní zařízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se tímto způsobem:

• a) práškové látky se prosejí sítem (o velikosti oka 0,5 mm); ke zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem;
• b) lisované, lité nebo jiným způsobem zhutněné látky se rozdrtí na malé kousky a prosejí; ke zkoušení se použije prosetý podíl o velikosti částic od 0,5 do 1 mm, který by měl být reprezentativní pro původní látku.

Látky dodávané obvykle ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu nebo po odstranění maximálního možného množství ředidla. Kapalné látky se zkoušejí při mezeře 1 mm mezi horním a dolním ocelovým válcem.

Provede se série šesti zkoušek spuštěním závaží o hmotnosti 10 kg z výšky 0,40 m (40 J). Dojde-li během těchto šesti zkoušek při 40 J k výbuchu, musí se provést další série šesti zkoušek spuštěním závaží o hmotnosti 5 kg z výšky 0,15 m (7,5 J). U jiných zařízení se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. technikou up-and-down atd).

Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, jestliže dojde k výbuchu (vzplanutí nebo třesk jsou rovnocenné výbuchu) alespoň jednou při kterékoli zkoušce se specifikovaným zařízením nebo je-li vzorek citlivější než 1,3-dinitrobenzen nebo RDX v alternativní zkoušce citlivosti na náraz.

Třecí zařízení je tvořeno základovou deskou z lité oceli, na které je upevněno třecí zařízení. To je tvořeno nepohyblivým porcelánovým kolíkem a pohyblivou porcelánovou destičkou. Porcelánová destička je upevněna na saních vedených dvěma vodicími lištami. Saně jsou připojeny k elektromotoru ojnicí, excentrickou vačkou a vhodným ozubeným převodem tak, že porcelánová destička vykonává pod porcelánovým kolíkem pohyb tam a zpět na dráze o délce 10 mm. Porcelánový kolík lze zatížit silou buď 120 N, nebo 360 N.

Rovné porcelánové destičky jsou vyrobeny z bílého technického porcelánu (o drsnosti 9 až 32 um) a mají délku 25 mm, šířku 25 mm a výšku 5 mm. Válcový porcelánový kolík je rovněž vyroben z bílého technického porcelánu, má délku 15 mm, průměr 10 mm a zdrsněné kulové plochy s poloměrem zakřivení 10 mm.

Objem vzorku by měl být 10 mm³ nebo by měl být vhodný pro alternativní zařízení.

Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se tímto způsobem:

• a) práškové látky se prosejí sítem (o velikosti oka 0,5 mm); ke zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem;
• b) lisované, lité nebo jiným způsobem zhutněné látky se rozdrtí na malé kousky a prosejí; ke zkoušení se použije prosetý podíl o velikosti částic < 0,5 mm.

Látky dodávané obvykle ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu. Nelze-li látku připravit v suchém stavu, zkouší se pasta (po odstranění maximálního možného množství ředidla) ve formě proužku o tloušťce 0,5 mm, šířce 2 mm a délce 10 mm připraveného v tvarovací formě.

Porcelánový kolík se přiloží na zkoušený vzorek a zatíží se. Při provádění zkoušky musí být rýhy v porcelánové destičce orientovány příčně ke směru pohybu. Je nutné dbát na to, aby kolík spočíval na vzorku, aby pod kolíkem leželo dostatečné množství zkoušeného materiálu a také aby se destička pohybovala pod kolíkem správně. U pastovitých látek se pro nanesení látky na destičku používá měrka o tloušťce 0,5 mm s otvorem 2 × 10 mm. Porcelánová destička se musí pohybovat pod porcelánovým kolíkem po dráze 10 mm tam a zpět za 0,44 s. Každá část povrchu destičky a kolíku se smí použít pouze jednou; dva konce každého kolíku slouží pro dva pokusy a každá ze dvou stran destičky slouží pro tři pokusy.

Série šesti zkoušek se provede se zatížením 360 N. Získá-li se během těchto šesti zkoušek pozitivní výsledek, musí se provést další série šesti zkoušek se zatížením 120 N. U jiných zařízení se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. technikou up-and-down atd).

Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, jestliže dojde k výbuchu (praskání, třesk nebo vzplanutí jsou rovnocenné výbuchu) alespoň jednou při kterékoli zkoušce se specifikovaným zařízením pro stanovení citlivosti na tření nebo splňuje-li ekvivalentní kritéria alternativní zkoušky citlivosti na tření.

Látka se v zásadě považuje ve smyslu této směrnice za nebezpečnou z hlediska výbuchu, jestliže jsou získány pozitivní výsledky ve zkoušce citlivosti na působení tepla, ve zkoušce citlivosti na náraz nebo na tření.

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

• identifikace zkoušené látky, její složení, čistota, obsah vlhkosti atd.,

• fyzikální forma vzorku, zda se vzorek drtil, mlel nebo proséval,

• údaje zjištěné při zkoušce citlivosti na působení tepla (např. hmotnost vzorku a počet úlomků atd.),

• pozorované jevy při zkoušce mechanické citlivosti (např. tvorba značného množství dýmu nebo úplný rozklad bez třesku, plameny, jiskry, třesk, praskání atd.),

• výsledky každého typu zkoušky,

• bylo-li použito alternativní zařízení, musí být uvedeno vědecké zdůvodnění použití a důkaz srovnatelnosti výsledků získaných se specifikovaným zařízením a výsledků získaných s rovnocenným zařízením,

• všechny užitečné poznámky, například odkaz na zkoušky podobných látek, které by mohly mít význam pro správné hodnocení výsledků,

• všechny další poznámky, které mají význam pro interpretaci výsledků.

V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny všechny výsledky, které jsou považovány za chybné, anomální nebo nereprezentativní. Má-li být kterýkoli z těchto výsledků vyloučen, mělo by být uvedeno vysvětlení a výsledky jakéhokoli alternativního nebo doplňkového zkoušení. Pokud nelze anomální výsledek vysvětlit, musí být přijat tak, jak byl dosažen, a musí být použit k odpovídající klasifikaci látky.

(všechny rozměry v mm)

(příklady roztržení trubky)

Křivka závislosti teploty na čase získaná při zahřívání dibutyl-ftalátu (27 cm³) v uzavřené trubce (s clonou 1,5 mm) při průtoku propanu 3,2 litry za minutu. Teplota byla měřena chromel/alumelovým termočlánkem o průměru 1 mm, zapouzdřeným v korozivzdorné oceli a umístěným 43 mm pod okrajem trubky. Rychlost zahřívání mezi 135 ^oC a 285 ^oC by měla být 185 až 215 K/min.

(všechny rozměry v mm)

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Tato gelově permeační chromatografická metoda je replikou metody OECD TG 118 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1).

Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou metodu a přesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelově permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení údajů lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li na ně uvedeny úplné odkazy. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. ve vodě rozpustné polymery a polymery s dlouhými větvemi.

Početně průměrná molekulová hmotnost M_na hmotnostně průměrná molekulová hmotnost M_w se stanoví pomocí těchto rovnic:

kde:

H_i je výška signálu detektoru nad základní čarou pro retenční objem V_i,

M_i je molekulová hmotnost frakce polymeru s retenčním objemem V_i a

n je počet údajů.

Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity systému, je dána poměrem M_w/M_n.

Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. k tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými průměrnými molekulovými hmotnostmi M_n a M_w a se známou distribucí molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické.

Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém kolon.

Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulové hmotnosti ekvivalentní polystyrenu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), poly(methyl-methakrylát), poly(akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno.

Distribuce molekulové hmotnosti vzorku i průměrné molekulové hmotnosti (M_n, M_w) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž se vzorek dělí podle hydrodynamických objemů jednotlivých složek (2).

Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou do pórů, zatímco velké molekuly nikoli. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají do některých pórů a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají do všech pórů. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

V ideálním případě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým adsorpčním jevům. Nestejnoměrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

Detekce se provádí například měřením indexu lomu nebo UV absorpce a výsledkem je jednoduchá distribuční křivka. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v ideálním případě v podstatě podobnou strukturou, např. různými polystyrenovými standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek různých molekulových hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Je-li chromatogram hodnocen v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí být požadovaná opakovatelnost zajištěna korekcí vnitřním standardem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami:

(M_p je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku)

Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve zvoleném eluentu. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30 cm × 7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným třepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 um.

Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v závěrečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpuštěných částic vyjádřené v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

• zásobník rozpouštědla,

• odplynovací zařízení (podle potřeby),

• dávkovací čerpadlo,

• tlumič rázů (podle potřeby),

• vstřikovací systém,

• chromatografické kolony,

• detektor,

• průtokoměr (podle potřeby),

• zapisovač,

• nádoba na odpad.

Musí být zajištěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

Určený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu buď dávkovačem, nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním vnesení) může způsobit změny v pozorované distribuci molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být opatřen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

Podle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá kolona nebo několik za sebou řazených kolon. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, vylučovací meze). Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1, 2, 3).

Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. Při použití THF jako eluentu to zahrnuje vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpuštěné látky na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán touto rovnicí:

kde,

Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roh také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z tohoto vztahu

kde,

Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:

kde,

Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 99,5 % čistotu). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho dopravou čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a veden) by měla být konstantní a měla by být v souladu s volbou rozpouštědla.

Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. k detekci se obvykle používá diferenciálního refraktometru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/vis, IR detektory a viskozitní detektory atd.

Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování údajů, měla by být použita norma DIN (1).

Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně.

Pro každé měření musí být uvedeny hodnoty M_n, M_w, M_w/M_n a M_p. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log M_p (přičemž M_p je výška maxima píku kalibračního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Početně a hmotnostně průměrné molekulové hmotnosti se obecně určí elektronickým zpracováním údajů založeným na rovnicích v bodě 1.2. Při manuálním zpracování údajů do číselné formy lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

Distribuční křivka musí být znázorněna ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V grafickém znázornění by měl mít jeden řád molekulové hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. U integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose přibližně 10 cm.

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

• dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, přísady, nečistoty),

• popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.

• zásobník eluentu, inertní plyn, odplynění eluentu, složení eluentu, nečistoty,

• dávkovací čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,

• separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),

• počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),

• informace o symetrii pík,

• teplota kolony, způsob řízení teploty,

• detektor (princip měření, typ, objem kyvety),

• průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),

• systém pro záznam a zpracování údajů (hardware a software).

• podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,

• informace o kritériích jakosti této metody (např. korelační koeficient, součet čtverců chyb atd.),

• informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování údajů,

• všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat tyto informace:

  • název vzorku,

  • výrobce vzorku,

  • charakteristické hodnoty standardů M_p, M_n, M_w, M_w/M_n, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,

  • vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,

  • hodnota M_p použitá po kalibraci

  • eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,

  • hodnota M_p vypočtená pro maximum píku,

  • chyba vypočtené hodnoty M_p a kalibrační hodnoty M_p vyjádřená v procentech.

• hodnocení vlivu času: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),

• informace o tom, zda bylo hodnocení provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času.

• informace o mezích hodnocení v případě, že pík nebyl úplně analyzován,

• popis metody vyrovnávání křivek, bylo-li použito,

• příprava a postupy předúpravy vzorku,

• popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,

• vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),

• pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,

• podrobný popis všech změn zkušebních postupů,

• podrobnosti o rozsahu chyb,

• jakékoli další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.

Gelově permeační chromatografie (GPC) je preferovanou metodou stanovení M_n, zejména tehdy, je-li k dispozici sada standardů, jejichž struktura je srovnatelná se strukturou polymeru. Vyskytnou-li se praktické obtíže při použití GPC nebo očekává-li se, že látka nevyhoví regulativním kritériím na M_n, (což je třeba potvrdit), jsou k dispozici alternativní metody, jako jsou:

spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu tuhnutí (kryoskopie) rozpouštědla po přidání polymeru. Metoda je založena na skutečnosti, že vliv rozpuštěného polymeru na bod varu nebo bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1, 2).

Použitelnost: M_n < 20000.

spočívá v měření tlaku par zvolené referenční kapaliny před přidáním a po přidání známého množství polymeru (1, 2).

Použitelnost: M_n < 20000 (teoretická; v praxi však má omezený význam).

spočívá na principu osmózy, tj. přirozené snahy molekul rozpouštědla proniknout polopropustnou membránou ze zředěného do koncentrovaného roztoku a dosáhnout rovnováhy. Při zkoušce je koncentrace zředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný roztok obsahuje polymer. Pronikáním rozpouštědla membránou dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti polymeru (1, 3, 4).

Použitelnost: M_n od 20000 do 200000.

spočívá ve srovnání rychlosti vypařování aerosolu čistého rozpouštědla s alespoň třemi aerosoly obsahujícími polymer v různých koncentracích (1, 5, 6).

Použitelnost: M_n < 20000.

Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací nebo derivatizací). Stanovení počtu koncových skupin polymeru může vést k hodnotě molekulové hmotnosti (7, 8, 9).

Použitelnost: M_n až do 50000 (s klesající spolehlivostí).

Tato gelově permeační chromatografická metoda je replikou metody OECD TG 119 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkazech.

Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou metodu a přesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelově permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení údajů lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li na ně uvedeny úplné odkazy. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. ve vodě rozpustné polymery a polymery s dlouhými větvemi.

Nízká molekulová hmotnost je konvenčně definována jako molekulová hmotnost pod 1000.

Početně průměrná molekulová hmotnost M_n a hmotnostně průměrná molekulová hmotnost M_w se stanoví pomocí těchto rovnic:

kde,

Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity systému, je dána poměrem M_w/M_n.

Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými průměrnými molekulovými hmotnostmi M_n a M_w a se známou distribucí molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické.

Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém kolon.

Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulové hmotnosti ekvivalentní polystyrenu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), poly(methyl-methakrylát), poly (akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno.

Distribuce molekulové hmotnosti vzorku i průměrné molekulové hmotnosti (M_n, M_w) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž se vzorek dělí podle hydrodynamických objemů jednotlivých složek (2).

Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou do pórů, zatímco velké molekuly nikoliv. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají do některých pórů a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají do všech pórů. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

V ideálním případě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým adsorpčním jevům. Nestejnoměrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

Detekce se provádí například měřením indexu lomu nebo UV absorpce a výsledkem je jednoduchá distribuční křivka. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v ideálním případě v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek různých molekulových hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

Obsah molekul o nízké hmotnosti se odečte z této kalibrační křivky. Výpočet může být správný pouze tehdy, je-li odezva nízkomolekulárních látek hmotnostně ekvivalentní polymeru jako celku.

Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Je-li chromatogram hodnocen v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí být požadovaná opakovatelnost zajištěna korekcí vnitřním standardem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami:

(M_p je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku)

Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve zvoleném eluentu. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30 × 7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným třepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 um.

Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v závěrečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpuštěných částic vyjádřené v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

Korekce obsahu frakce s M < 1000 v důsledku příspěvku od přítomných nepolymerních specifických složek (např. nečistot a/nebo přísad) je obvykle nezbytná, není-li naměřený obsah < 1 %. Dosáhne se toho přímou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC.

V případech, kdy je eluát po průchodu kolonou pro další analýzu příliš zředěný, musí být zkoncentrován. Může být nezbytné odpařit eluát do sucha a opět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být provedeno za podmínek, při nichž je zajištěno, že nedojde ke změnám v eluátu. Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické metodě použité ke kvantitativnímu stanovení.

Aparatura pro GPC sestává z těchto částí:

• zásobník rozpouštědla,

• odplynovací zařízení (podle potřeby),

• dávkovací čerpadlo,

• tlumič rázů (podle potřeby),

• vstřikovací systém,

• chromatografické kolony,

• detektor,

• průtokoměr (podle potřeby),

• zapisovač,

• nádoba na odpad.

Musí být zajištěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

Určený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu buď dávkovačem nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním vnesení) může způsobit změny v pozorované distribuci molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být opatřen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

Podle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá kolona nebo několik za sebou řazených kolon. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, vylučovací meze). Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1, 2, 3).

Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. Při použití THF jako eluentu to zahrnuje vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpuštěné látky na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán touto rovnicí:

kde,

Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roh také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z tohoto vztahu:

kde,

kde,

kde,

Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 99,5 % čistotu). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho dopravou čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a vedení) by měla být konstantní a měla by být v souladu s volbou rozpouštědla.

Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používá diferenciálního refraktometru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/vis, IR detektory a viskozitní detektory atd.

Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování údajů, měla by být použita norma DIN (1).

Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Ve všech případech je důležité stanovit také údaje ze slepých pokusů zpracovaných za stejných podmínek jako vzorek.

Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log M_p (přičemž M_p je výška maxima píku kalibračního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Při stanovení se část křivky odpovídající molekulovým hmotnostem nižším než 1000 podle potřeby koriguje na nečistoty a přísady. Eluční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického zpracování údajů. Při manuálním zpracování údajů do číselné formy lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

Jestliže je v koloně zachycen nerozpustný polymer, je jeho molekulová hmotnost pravděpodobně vyšší než molekulová hmotnost rozpuštěné frakce, a pokud by tato skutečnost nebyla zohledněna, došlo by k nadhodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru je uveden v příloze.

Distribuční křivka musí být znázorněna ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V grafickém znázornění by měl mít jeden řád molekulové hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. U integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose přibližně 10 cm.

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

• dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, přísady, nečistoty),

• popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.

• zásobník eluentu, inertní plyn, odplynění eluentu, složení eluentu, nečistoty,

• dávkovací čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,

• separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),

• počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),

• informace o symetrii píků,

• teplota kolony, způsob řízení teploty,

• detektor (princip měření, typ, objem kyvety),

• průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),

• systém pro záznam a zpracování údajů (hardware a software).

• podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,

• informace o kritériích jakosti této metody (např. korelační koeficient, součet čtverců chyb atd.),

• informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování údajů,

• všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat tyto informace:

  • název vzorku,

  • výrobce vzorku,

  • charakteristické hodnoty standardů M_p, M_n, M_w, M_w/M_n, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,

  • vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,

  • hodnota M_p použitá po kalibraci

  • eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,

  • hodnota M_p vypočtená pro maximum píku,

  • chyba vypočtené hodnoty M_p a kalibrační hodnoty M_p vyjádřená v procentech.

• popis metod použitých v analýze a způsobu, jakým byly experimenty provedeny,

• informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností vyjádřeném v hmotnostních procentech celkového vzorku,

• informace o nečistotách, přísadách a jiných nepolymerních podílech vyjádřených v hmotnostních procentech celkového vzorku.

• hodnocení vlivu času: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),

• informace o tom, zda bylo hodnocení provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,

• informace o mezích hodnocení v případě, že pík nebyl úplně analyzován,

• popis metody vyrovnávání křivek, bylo-li použito,

• příprava a postupy předúpravy vzorku,

• popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,

• vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),

• pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,

• podrobný popis všech změn zkušebních postupů,

• podrobnosti o rozsahu chyb,

• jakékoli další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.

Je-li ve vzorku přítomen nerozpuštěný polymer, dochází ke ztrátě hmotnosti během analýzy GPC. Nerozpuštěné polymery jsou nevratně zachyceny v koloně nebo na filtru při filtraci vzorku, zatímco rozpustný podíl vzorku kolonou projde. V případě, že lze odhadnout nebo změřit přírůstek indexu lomu (dn/dc) polymeru, lze odhadnout ztrátu hmotnosti vzorku na koloně. V takovém případě se korekce provede pomocí externí kalibrace standardními materiály o známé koncentraci a známé hodnotě dn/dc, čímž se kalibruje refraktometr. V příkladě uvedeném dále je jako standard použit poly(methyl-methakrylát) (PMMA).

Při externí kalibraci pro analýzu polyakrylátů se analyzuje metodou GPC standard PMMA známé koncentrace v tetrahydrofuranu a výsledné údaje se použijí pro nalezení konstanty refraktometru podle rovnice:

K = R/(C × V × dn/dc)

kde:

Pro standard PMMA jsou typické tyto údaje:

Výsledná hodnota K = 3,05 × 10¹¹ se poté použije pro výpočet teoretické odezvy detektoru v případě, že detektorem prošlo 100 % vstříknutého polymeru.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenné mezinárodní zkušební metody nebo jiné použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 1 části 0.

Tato metoda popisuje postup měření délkově váženého středního geometrického průměru (DVGSP) umělých minerálních vláken (UMV). Jelikož DVGSP statistického souboru bude s pravděpodobností 95 % mezi hladinami významnosti 95 % (DVGSP ± dvě střední směrodatné chyby) vzorku, ohlášená hodnota (testová hodnota) bude nižší hladina významnosti 95 % vzorku (tj. DVGSP – 2 dvě střední směrodatné chyby). Metoda je založena na aktualizaci (červen 1994) návrhu průmyslového postupu HSE (Výkonný výbor pro zdraví a bezpečnost) dohodnutého na schůzce HSE a ECFIA (Evropská asociace odvětví keramických vláken) v Chesteru dne 26. září 1993 a vyvinutého druhou mezilaboratorní zkouškou (1, 2). Tato měřicí metoda může být použita pro charakterizaci průměru vláken sypkých látek či výrobků obsahujících UMV, včetně vysokotavných keramických vláken (VKV), umělých skelných vláken (USV), krystalických a polykrystalických vláken.

Délkové vážení je způsobem kompenzace vlivu rozlomení dlouhých vláken při odběru vzorků či při manipulaci s vlákny na rozložení jejich průměru. Pro měření rozložení velikosti průměrů UMV jsou použita geometrická statistická data (geometrický průměr), jelikož tyto průměry obvykle mají rozložení velikosti blížící se normálnímu.

Měření délky a průměru je jak únavné, tak dlouhé, ovšem pokud se měří pouze ta vlákna, která se dotýkají nekonečně tenké čáry na zorném poli rastrovacího elektronového mikroskopu, pak je pravděpodobnost výběru daného vlákna přímo úměrná jeho délce. Jelikož tím se zohledňuje délka při délkově vážených výpočtech, jediné vyžadované měření je měření průměru a DVGSP-2SE může být vypočten uvedeným způsobem.

Částice: objekt s poměrem délky k šířce menším než 3:1.

Vlákno: objekt s poměrem délky k šířce (charakteristický poměr) nejméně 3:1.

Metoda je určena pro pohled na rozdělení průměrů o středním průměru mezi 0,5 μm a 6 μm. Větší průměry mohou být měřeny pomocí menších zvětšení rastrového elektronového mikroskopu, ale tato metoda bude stále více limitována vzhledem k rozdělení jemných vláken a je-li střední průměr menší než 0,5 μm, doporučujeme měření transmisním elektronovým mikroskopem (TEM).

Z vláknové pokrývky či z volných sypkých vláken se odebere několik reprezentativních jádrových vzorků. Sypká vlákna jsou délkově omezena pomocí procesu drcení a reprezentativní podíl vzorku se rozpustí ve vodě. Poměrné podíly se vyloučí a přefiltrují přes polykarbonátový filtr o rozměrech pórů 0,2 μm a připraví se na pozorování pomocí technik rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM). Průměry vláken se měří při zvětšení obrazovky × 10000 nebo vyšším(Tato hodnota zvětšení je uvedena pro vlákna o průměru 3 μm, pro vlákna o průměru 6 μm je vhodnější zvětšení × 5000.) pomocí čárové zadržovací metody, aby se získal nezaujatý odhad středního průměru. Vypočte se nižší hladina významnosti 95 % (na základě jednostranného testu), a tím se získá odhad nejnižších hodnot geometrického středního průměru vláken materiálu.

Je nutno minimalizovat vystavení osob zvířeným vláknům a při manipulaci se suchými vlákny je nutno používat digestoř či suchou skříň. Je nutno periodicky provádět monitoring osobní expozice pro určení efektivity kontrolních metod. Při manipulaci s UMV je nutno nosit jednorázové rukavice pro omezení podráždění kůže a pro zabránění křížové kontaminaci.

• lis a lisovadla (schopná vyvinout tlak 10 MPa),

• polykarbonátové filtry s kapilárními póry o velikosti 0,2 μm (průměr 25 mm),

• membránový filtr z esteru buničiny o rozměru pórů 5 μm jako filtr záložní,

• skleněný filtrační přístroj (či použitelné filtrační systémy) pro filtry o průměru 25 cm (např. skleněná mikroanalytická sada Millipore typ XX10 025 00),

• čerstvá voda destilovaná přes filtr o rozměru pórů 0,2 μm pro odstranění mikroorganismů,

• katodový rozprašovač s anodou ze zlata či ze zlata/palladia,

• rastrovací elektronový mikroskop schopný rozlišení až 10 nm a pracující při zvětšení × 10000,

• různé: stěrky, skalpel typu 24, pinzeta, tubusy SEM, uhlíkové lepidlo či uhlíková lepící páska, stříbrná tyčinka,

• ultrazvuková sonda či ultrazvuková lázeň na desce laboratorního stolu,

• odběrač vzorků sedimentu či korkovrt pro odebírání jádrových vzorků z pokrývky UMV.

U pokrývek a roun se používá odběrač vzorků velikosti 25 mm či korkovrt pro odebírání vzorků z řezu. Vzorky by měly být rovnoměrně rozprostřeny po šířce a z malé délky pokrývky, nebo by měly být odebrány z náhodných ploch, je-li k dispozici pokrývka o velké délce. Stejné zařízení může být použito pro odběr náhodných vzorků z volných vláken. Je-li to možné, mělo by být odebráno šest vzorků tak, aby byly zohledněny prostorové odchylky v sypkém materiálu.

Těchto šest jádrových vzorků je nutno rozdrtit v lisovadle o průměru 50 mm tlakem 10 MPa. Materiál se rozmíchá stěrkou a znovu se stlačí tlakem 10 MPa. Poté se materiál vyjme z lisovadla a umístí v utěsněné skleněné láhvi.

Je-li to nutné, organické pojivo může být odstraněno umístěním vláken do pece o teplotě 450 °C po dobu jedné hodiny.

Vytvarujte vzorek do kužele a rozčtvrťte jej (to by mělo být provedeno uvnitř prachové skříně).

Přidejte stěrkou malé množství vzorku (< 0,5 g) do 100 ml čerstvé destilované vody, která byla přefiltrována přes membránový filtr 0,2 μm (je možno použít jiný zdroj velmi čisté vody, ukáže-li se být uspokojivý). Řádně rozmíchejte vzorek pomocí ultrazvukové sondy provozované s výkonem 100 W a vyladěné tak, aby se objevila kavitace (není-li sonda k dispozici, postupujte takto: opakovaně vzorek protřepte a otočte jej na dobu 30 sekund; po dobu pěti minut vystavte vzorek ultrazvuku v ultrazvukové lázni; poté opět několikrát protřepte a otočte vzorek po dobu dalších 30 sekund).

Ihned po promíchání vláken odeberte několik poměrných dílů (např. tři poměrné části o 3, 6 a 10 ml) pomocí široké pipety (o objemu 2–5 ml).

Vakuově přefiltrujte každý poměrný díl přes polykarbonátový filtr 0,2 μm s pomocí podpůrného filtru MEC o velikosti pórů 5 μm pomocí skleněného filtračního tunelu 25 mm s válcovou nádrží. Přibližně 5 ml filtrované destilované vody by mělo být umístěno do tunelu a poměrný díl by měl být pomalu pipetován do vody, okraj pipety se drží pod prohnutou čočkou. Po pipetování musí být pipeta a nádrž řádně propláchnuta, jelikož tenká vlákna mají snahu ulpívat dále na povrchu.

Opatrně odstraňte filtr a oddělte jej od podpůrného filtru před jeho umístěním do obalu za účelem jeho vysušení.

Uřízněte čtvrtinu či polovinu filtrované části filtrovaného depozitu pomocí skalpelu typu 24 trhnutím. Opatrně připojte odříznutou část k bloku SEM pomocí lepící uhlíkové pásky či uhlíkového lepidla. Je nutno použít alespoň na třech místech stříbrnou tyčinku pro zlepšení elektrického kontaktu na okrajích filtru a bloku. Je-li lepidlo/stříbrná tyčinka suchá, katodově rozprašte cca 50 nm zlata či zlata/palladia na povrch depozitu.

Kalibrace SEM by měla být zkontrolována minimálně jednou za týden (ideálně jednou denně) pomocí certifikované kalibrační mřížky. Kalibrace musí být kontrolována vůči certifikovanému standardu a není-li naměřená hodnota (SEM) v rozsahu ±2 % hodnoty certifikované, potom musí být kalibrace SEM seřízena a znovu zkontrolována.

SEM by měl být schopen rozlišit alespoň minimální viditelný průměr 0,2 μm pomocí reálné vzorkovací matice při zvětšení × 2000.

SEM by měl být provozován při zvětšení 10000(U vláken 3 μm viz předchozí poznámka.) za podmínek, které dávají dobré rozlišení při přijatelném snímku při pomalých snímacích rychlostech např. 5 sekund na rámec. I když se provozní požadavky různých SEM mohou lišit, obecně by mělo být použito urychlovací napětí 5–10 keV s nastavením malé velikosti bodu a krátkou pracovní vzdáleností; tím se získá nejlepší viditelnost a rozlišení s materiály o relativně nízkých atomových hmotnostech. Při provádění lineárního příčného pohybu musí být použit sklon 0° pro minimalizaci přeostření, nebo má-li SEM eucentrickou fázi, musí být použita eucentrická pracovní vzdálenost. Menší zvětšení může být použito, neobsahuje-li materiál vlákna o malých průměrech a průměry vláken jsou velké (> 5 μm)

Zpočátku by měl být vzorek pozorován při malém zvětšení pro ujištění se o rozdrcení velkých vláken a pro vyhodnocení hustoty vláken. V případě velkého rozdrcení je doporučeno připravit nový vzorek.

Kvůli statistické přesnosti je nezbytné změřit minimální počet vláken a může se zdát být výhodná vysoká hustota vláken, jelikož pozorováním prázdných polí ztrácíme čas a nijak k analýze nepřispíváme. Ovšem při přetížení filtru je obtížné změřit všechna měřitelná vlákna a jelikož malá vlákna mohou být zakryta vlákny většími, mohou být vynechána.

Je-li hustota vláken větší než 150 vláken na milimetr lineárního příčného posuvu, může dojít k nežádoucímu vlivu nadhodnocení DVGSP. Na druhé straně malá koncentrace vláken zvyšuje dobu analýzy a často je nákladově efektivní připravit vzorek v hustotou vlákna blíže hodnotě optimální, než zůstat u počítání vláken o menších koncentracích. optimální hustota vláken by měla dávat průměrně jedno či dvě počítatelná vlákna na pole z záběru o zvětšení 5000. Nicméně optimální hustota bude záviset na velikosti (průměru) vláken, takže je nezbytné, aby obsluha používala odborný úsudek za účelem rozhodnutí, zda je hustota vláken blízko hodnotě optimální či nikoliv.

Pouze ta vlákna, která se dotýkají (nebo kříží) (nekonečně) tenkou čáru nakreslenou na obrazovce SEM, se započítávají. Z tohoto důvodu je přes střed obrazovky nakreslena horizontální (či vertikální) čára.

Alternativně může být ve středu obrazovky umístěn jediný bod a zahájí se spojité snímání v jednom směru přes filtr. Každé vlákno o charakteristickém poměru větším než 3:1 dotýkající se při procházející tímto bodem má změřený a zaznamenaný průměr.

Doporučuje se měření minimálně 300 vláken. Každé vlákno je měřeno pouze jednou v bodě průsečíku s čárou či bodem nakresleným na snímku (nebo blízko průsečíku, jsou-li okraje vlákna zakrytá). Jestliže se objeví vlákna s nerovnoměrným průřezem, je nutno použít měření reprezentující střední průměr vlákna. Je nutno dbát na definování okraje a měřit nejkratší vzdálenost mezi okraji vlákna. Třídění může být prováděno on-line, nebo off-line na uložených snímcích či fotografiích. Doporučeny jsou poloautomatické snímkovací měřicí systémy, které stahují data přímo do tabulky, jelikož šetří čas, eliminují chyby v přepisech a mohou být zautomatizovány výpočty.

Konce dlouhých vláken by měla být zkontrolovány při malém zvětšení, aby bylo zajištěno, že se nepřesunou zpět do měřicího zorného pole a že budou měřeny pouze jednou.

Průměry vláken obvykle nemají normální rozdělení. Ovšem provedením logaritmické transformace je možno získat rozdělení, které se blíží normálnímu.

Vypočtěte aritmetický průměr (střední (mean) lnD) a standardní odchylku (SD_lnD) logaritmem o základu e hodnoty (lnD) průměrů vláken (D).

Standardní odchylka je dělena druhou odmocninou počtu měření (n), čímž získáme střední směrodatnou chybu (SE_lnD).

Odečtěte od průměrné hodnoty dvojnásobek střední směrodatné chyby a vypočtěte exponenciál této hodnoty (průměr mínus dvě střední směrodatné chyby), což dává střední geometrickou hodnotu mínus dvě geometrické směrodatné chyby.

Zpráva o měření by měla obsahovat minimálně tyto informace:

• hodnotu DVGSP-2SE,

• veškeré odchylky a zejména ty, které mohou mít vliv na přesnost výsledků, s patřičným odůvodněním.

• (1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. Únor 1999.
• (2) G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Projekt R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.

Protože se jedná o podíl dvou koncentrací, je bezrozměrný. Nejčastěji se udává jako dekadický logaritmus (log P_ow). Hodnota P_ow závisí na teplotě a vykazované údaje by měly zahrnovat i teplotu měření.

• a) strukturní vzorec;
• b) vhodné analytické metody k stanovení koncentrace látky ve vodě a oktan-1-olu;
• c) disociační konstanta (konstanty) ionizovatelných látek (Pokyny OECD 112 (9));
• d) rozpustnost ve vodě (10);
• e) abiotická hydrolýza (11);
• f) snadná biologická rozložitelnost (12);
• g) tlak par (13).

• magnetické míchačky a magnetické míchací tyčinky s teflonovým povlakem k míchání vodné fáze,

• analytické přístroje vhodné k stanovení koncentrace zkoušené chemické látky v předpokládaném rozmezí koncentrací,

• míchací nádoba s kohoutem v dolní části. V závislosti na odhadované hodnotě log P_ow a mezi stanovitelnosti (LOD) zkoušené sloučeniny se musí zvážit použití reakční nádoby stejného tvaru o objemu větším než jeden litr, aby bylo možno získat dostatečný objem vody pro chemickou extrakci a analýzu. Koncentrace ve vodném extraktu tak budou vyšší a tím bude i k analytické stanovení spolehlivější. V příloze 1 naleznete tabulku, v níž jsou uvedeny odhady minimálního potřebného objemu, LOD sloučeniny, její odhadované hodnoty log P_ow a její rozpustnost ve vodě. Tabulka je založena na vztahu mezi hodnotou log P_ow a poměrem rozpustností v oktanolu a ve vodě, jak jej uvádí Pinsuwanet al. (14):

  kde

  (v jednotkách molární koncentrace),

  a na vztahu pro odhad rozpustnosti ve vodě, jak jej uvádí Lyman (15). Hodnoty rozpustnosti ve vodě vypočítané podle rovnice uvedené v příloze 1 se musí považovat za první odhad. Je třeba poznamenat, že uživatel může k získání odhadu rozpustnosti ve vodě použít bez omezení jakýkoli vztah, o němž se má za to, že lépe vyjadřuje vztah mezi hydrofobicitou a rozpustností. Například u sloučenin v pevném skupenství se doporučuje zahrnout do odhadu rozpustnosti bod tání. V případě, že se použije pozměněný vzorec, je třeba se ujistit, že vzorec pro výpočet rozpustnosti v oktanolu i nadále platí. V dodatku 2 je uveden schematický nákres míchací nádoby se skleněným pláštěm o objemu asi jeden litr. Proporce nádoby uvedené v dodatku 2 se osvědčily jako vhodné a měly by se zachovat i při použití aparatury jiné velikosti,

• během experimentu používajícího pomalé míchání je nezbytné udržovat konstantní teplotu.

• zkoušená chemická látka se rozpustí v oktan-1-olu (nasyceném vodou),

• roztok se nechá po dostatečně dlouhou dobu ustálit, aby se suspendovaná pevná látka usadila. V průběhu usazování se sleduje koncentrace zkoušené chemické látky,

• poté, co naměřené koncentrace látky v roztoku oktan-1-olu dosáhnou stálých hodnot, naředí se zásobní roztok vhodným objemem oktan-1-olu,

• koncentrace ředěného zásobního roztoku se změří. Jestliže naměřená koncentrace odpovídá ředění, může se naředěný zásobní roztok použít v experimentu s pomalým mícháním.

• 1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring‘ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
• 2) Kapitola A.8 této přílohy, Rozdělovací koeficient.
• 3) Kapitola A.8 této přílohy, Rozdělovací koeficient.
• 4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
• 5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
• 6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
• 7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.
• 8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.
• 9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.
• 10) Kapitola A.6 této přílohy, Rozpustnost ve vodě.
• 11) Kapitola C.7 této přílohy, Rozklad – Abiotický rozklad – hydrolýza jako funkce pH.
• 12) Kapitola C.4 – část II–VII (metoda A až F) této přílohy, Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti.
• 13) Kapitola A.4 této přílohy, Tlak par.
• 14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.
• 15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.
• 16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
• 17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
• 18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.
• 19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.
• 20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
• 21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.
• 22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.

Předpoklady:

• Maximální objem jednotlivých podílů = 10 % celkového objemu; 5 podílů = 50 % celkového objemu.

• . V případě nižších koncentrací budou potřeba větší objemy.

• Objem použitý ke stanovení meze stanovitelnosti (LOD) = 100 ml.

• log P_ow oproti log S_w a log P_ow oproti SR (S_o/S_w) vhodně vyjadřují vztahy zkoušených chemických látek.

Odhad S_o

Minimální požadovaný objem vodné fáze při jednotlivých koncentracich LOD

Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 1 litr.

Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 2 litry.

Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 5 litrů.

Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibrační nádoba o objemu 10 litrů.

Přesahuje 10 % objemu, a to i u ekvilibrační nádoby o objemu 10 litrů.

Přehled požadovaných objemů v závislosti na rozpustnosti ve vodě a log P_ow Minimální požadovaný objem fáze H₂O při každé koncentraci LOD (ml)

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 117 (2004).

• 1. Rozdělovací koeficient (P) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací rozpuštěné látky v dvoufázovém systému tvořeném dvěma prakticky nemísitelnými rozpouštědly. V případě n-oktanolu a vody platí:

  Rozdělovací koeficient jako podíl dvou koncentrací je bezrozměrná veličina a obvykle se uvádí jeho dekadický logaritmus.

• 2. P_ow je klíčový parametr při studiu chování chemických látek v životním prostředí. Byl zjištěn vysoce významný vztah mezi P_ow neionizované formy látek a jejich bioakumulací u ryb. Bylo rovněž ukázáno, že P_ow je účinný parametr v odhadech adsorpce na půdě a sedimentech a při stanovení kvantitativních vztahů mezi strukturou a aktivitou v širokém rozsahu biologických účinků.
• 3. Původní návrh této zkušební metody vycházel z článku autorů C. V. Eadsfortha a P. Mosera (1). Vývoj zkušební metody a srovnávací zkoušky OECD mezi laboratořemi byly koordinovány centrálním úřadem pro životní prostředí (Umweltbundesamt) Spolkové republiky Německo během roku 1986 (2).

kde t_R je retenční čas zkoušené látky a t₀ je mrtvý čas, tj. průměrná doba, kterou potřebuje molekula rozpouštědla, aby prošla kolonou. Kvantitativní analytické metody nejsou zapotřebí, nezbytné je pouze stanovení retenčních časů.

kde

a, blineární regresní koeficienty.

Tato rovnice se získá lineární regresí logaritmu rozdělovacích koeficientů oktanol/voda referenčních látek proti logaritmu kapacitních faktorů referenčních látek.

Vážený průměr log P_ow je platný pouze pro látky nebo směsi (např. tálové oleje) skládající se z homologů (např. série alkanů). Při měření směsí lze užitečné výsledy získat za předpokladu, že použitý analytický detektor má stejnou citlivost vůči všem látkám ve směsi a lze je dostatečně rozlišit.

• Opakovatelnost: Hodnoty log P_ow získané z opakovaných měření za identických podmínek a za použití stejného souboru referenčních látek by měly spadat do rozmezí + 0,1 log.

• Reprodukovatelnost: Jsou-li měření opakována s odlišným souborem referenčních látek, výsledky se mohou lišit. Korelační koeficient R vztahu mezi log k a log P_ow pro soubor zkoušených látek je obvykle okolo 0,9, což odpovídá rozdělovacímu koeficientu oktanol/voda log P_ow + 0,5 log.

Tabulka 1 Doporučené referenční látky

• předběžný odhad rozdělovacího koeficientu, odhadnuté hodnoty a použitá metoda, jsou-li stanoveny; byla-li použita výpočtová metoda, její úplný popis, včetně identifikace databáze a podrobné informace o výběru fragmentů,

• zkoušené a referenční látky: čistota, strukturní vzorec a číslo CAS,

• popis zařízení a pracovních podmínek: analytická kolona, ochranná předkolona,

• mobilní fáze, detekční systém, teplotní rozsah, pH,

• eluční profily (chromatogramy),

• mrtvý čas a metoda jeho měření,

• retenční data a hodnoty log P_ow z literatury pro referenční látky použité ke kalibraci,

• charakteristiky proložené regresní přímky (log k versus log P_ow) a korelační koeficient přímky, včetně intervalů spolehlivosti,

• průměrné retenční údaje a interpolovaná hodnota log P_ow pro zkoušenou látku,

• v případě směsi: chromatogram elučního profilu s uvedenými hraničními hodnotami,

• poměr hodnot log P_ow k procentuálnímu podílu plochy píku log P_ow,

• výpočet použitím regresní přímky,

• popřípadě vypočítané vážené průměrné hodnoty log P_ow.

• rozhodnutí, která experimentální metoda se použije: metoda Shake Flask (třepací lahev) pro log P_ow mezi – 2 a 4; HPLC metoda pro log P_ow mezi 0 a 6;

• volbu podmínek použitých v HPLC (referenční látky, poměr metanol/voda);

• prověření věrohodnosti hodnot získaných experimentálními metodami;

• zjištění odhadu v případě, kdy experimentální metody nelze použít.

^πX = log P_ow (PhX) – log P_ow (PhH)

kde PhX je aromatický derivát a PhH výchozí látka.

π-metoda je primárně důležitá u aromatických látek. π-hodnoty pro velký počet substituentů lze nalézt v literatuře (4, 5).

kde a_i je číslo vyjadřující, kolikrát se daný fragment vyskytuje v molekule, a f_i je přírůstek log P_ow fragmentu. Interakční členy je možné vyjádřit jako souhrnný násobek jediné konstanty C_m (tzv. „magické konstanty“). Fragmentové konstanty f_i a C_m byly stanoveny ze seznamu 1054 experimentálních hodnot P_ow pro 825 látek pomocí vícenásobné regresní analýzy (6, 8). Stanovení interakčních členů se provede podle stanovených pravidel (6, 8, 9).

kde f_i je fragmentová konstanta, F_j korekční člen (faktor), a_i a b_j odpovídající četnosti výskytu. Seznamy atomových a skupinových fragmentových hodnot a korekčních členů F_j byly získány metodou pokusu a omylu z experimentálních hodnot P_ow. Korekční členy byly rozděleny do několika různých tříd (1, 4). Byla vyvinuta sada programů, které berou v úvahu všechna pravidla a korekční členy (3).

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 112 (1981).

• Vhodná analytická metoda

• Rozpustnost ve vodě

• Strukturní vzorec

• Elektrická vodivost v případě konduktometrické metody

• Všechny zkušební metody lze provádět s čistými nebo běžně obchodovanými látkami. Měly by být zváženy možné účinky nečistot na výsledky.

• Titrační metoda není vhodná pro látky s nízkou rozpustností (viz zkušební roztoky níže).

• Spektrofotometrickou metodu lze použít pouze u látek, které mají v disociované a nedisociované formě zřetelně různá absorpční spektra UV/VIS. Tato metoda může být rovněž vhodná pro látky s nízkou rozpustností a pro nekyselé/bazické disociace, např. komplexotvorné.

• V případech, kdy platí Onsagerova rovnice, lze použít konduktometrickou metodu, a to i při dosti nízkých koncentracích, a dokonce i v případech nekyselé/bazické rovnováhy.

Tato zkušební metoda je založena na metodách uvedených v odkazech v oddíle „Literatura“ a na předběžném návrhu dokumentu Návod pro oznamování před výrobou, EPA, 18. srpna 1978.

Disociace látky ve vodě má význam pro posuzování jejího dopadu na životní prostředí. Závisí na ní forma látky, což určuje její chování a přepravu. Může ovlivňovat absorpci chemické látky do půdy a sedimentů a adsorpci do biologických buněk.

Disociace je reverzibilní rozdělení molekuly na dvě nebo více chemických látek, které mohou mít charakter iontů. Tento proces obecně vyjadřuje rovnice

RX &#x21cc; R⁺+ X ^–

a koncentrační rovnovážná konstanta určující reakci je

Například v konkrétním případě, kde R je vodík (látkou je kyselina), je tato konstanta

nebo

Následující referenční látky není nutné používat vždy při zkoušení nové chemické látky. Jsou uvedeny především proto, aby bylo možné čas od času provést kalibraci metody a aby bylo možné porovnat výsledky v případě, že se použije jiná metoda.

Bylo by užitečné mít látku s několika hodnotami pK, jak je uvedeno níže v oddíle „Princip zkušební metody“. Takovou látkou by mohla být:

Popisovaný chemický proces je celkově jen mírně závislý na teplotě v teplotním rozpětí, které je běžné v životním prostředí. Ke stanovení disociační konstanty je nutné změřit koncentrace disociované a nedisociované formy chemické látky. Příslušnou konstantu lze stanovit na základě znalosti stechiometrie disociační reakce uvedené výše v oddíle „Definice a jednotky“. V konkrétním případě popsaném v této zkušební metodě se látka chová jako kyselina nebo jako zásada a stanovení se nejpohodlněji provede určením relativních koncentrací iontové a neiontové formy látky a pH roztoku. Vztah mezi těmito pojmy popisuje rovnice pro výpočet pK_a v oddíle „Definice a jednotky“ výše. Některé látky vykazují více než jednu disociační konstantu a lze odvodit obdobné rovnice. Některé z metod zde popsaných jsou vhodné také pro nekyselé/bazické disociace.

Stanovení disociační konstanty by se mělo provést opakovaně (minimálně tři stanovení) s tolerancí ± 0,1 log.

Existují dvě základní metody pro stanovení pK_a. Jedna zahrnuje titraci známého množství látky se standardní kyselinou nebo případně zásadou; druhá zahrnuje stanovení relativní koncentrace ionizované a neionizované formy a její závislosti na pH.

Metody založené na těchto zásadách lze rozdělit na titrační, spektrofotometrické a konduktometrické.

Při titrační metodě a konduktometrické metodě by chemická látka měla být rozpuštěna v destilované vodě. Při spektrofotometrické a jiných metodách se používají pufrované roztoky. Koncentrace zkoušené chemické látky by neměla přesahovat 0,01 M nebo polovinu saturační koncentrace, podle toho, která z hodnot je nižší, a pro přípravu roztoku by měla být použita nejčistší dostupná forma látky. Je-li látka jen mírně rozpustná, může být před přípravou výše uvedených koncentrací rozpuštěna v malém množství rozpouštědla mísitelného s vodou.

Roztoky by měly být za využití Tyndallova jevu zkontrolovány na přítomnost emulzí, zejména pokud byl použit kosolvent pro zvýšení rozpustnosti. Použijí-li se pufrované roztoky, neměla by koncentrace pufru přesáhnout 0,05 M.

Teplota by měla být regulována s přesností nejméně ± 1°C. Stanovení by se mělo provádět při 20 °C.

Existuje-li podezření na významnou závislost na teplotě, mělo by být stanovení prováděno alespoň při dvou jiných teplotách. Teplotní intervaly by v tomto případě měly být 10 °C a regulace teploty ± 0,1 °C.

Metoda bude určována povahou látky, která se testuje. Musí být dostatečně citlivá, aby umožňovala stanovení různých druhů chemických látek při každé koncentraci zkušebního roztoku.

Zkušební roztok se testuje titrací se standardním roztokem zásady nebo případně kyseliny, přičemž po každém přidání titračního roztoku se změří pH. Před dosažením bodu ekvivalence by měl být roztok přidán v rostoucích objemech alespoň desetkrát. Je-li rovnováhy dosaženo dostatečně rychle, může se použít záznamový potenciometr. Pro tuto metodu musí být přesně známo celkové množství látky a její koncentrace. Je nutné vyloučit oxid uhličitý. Podrobnosti postupu, preventivní opatření a výpočet jsou uvedeny ve standardních zkouškách, např. v položkách (1), (2), (3) a (4) seznamu literatury.

Vlnová délka se zjistí, pokud ionizovaná a neionizovaná forma látky má znatelně rozdílné absorpční koeficienty. Absorpční spektrum UV/VIS se zjistí z roztoků o konstantní koncentraci za takové hodnoty pH, kde je látka v podstatě neionizovaná, kde je plně ionizovaná a při několika mezilehlých hodnotách pH. Toho lze dosáhnout buď přidáním podílů koncentrované kyseliny (zásady) do poměrně velkého objemu roztoku látky v mnohosložkovém pufru, nejprve při vysoké (nízké) hodnotě pH (viz položka 5 seznamu literatury), anebo přidáním stejných objemů zásobního roztoku látky např. ve vodě nebo v methanolu ke konstantním objemům různých pufrovaných roztoků, jež pokrývají žádoucí rozpětí hodnot pH. Z hodnot pH a hodnot absorbance při zvolené vlnové délce se vypočítá dostatečný počet hodnot pK_a za použití alespoň 5 hodnot pH, kdy je látka ionizována z nejméně 10 % a z méně než 90 %. Další podrobnosti o zkoušce a metoda výpočtu jsou uvedeny v odborné literatuře (1).

Pomocí elektrického článku o nízké, známé článkové konstantě se změří vodivost přibližně 0,1 M roztoku látky ve vodivostní vodě. Změří se rovněž vodivost několika přesně připravených zředění tohoto roztoku. Koncentrace se pokaždé sníží na polovinu a celá série by měla pokrývat koncentrace nejméně v rozsahu jednoho řádu. Mezní vodivost při nekonečném zředění se zjistí provedením obdobného pokusu se sodnou solí a extrapolací. Míru disociace pak lze vypočítat z vodivosti každého roztoku pomocí Onsagerovy rovnice, a disociační konstantu je tedy možné vypočítat pomocí Ostwaldova zřeďovacího zákona jako K = α²C/(1 – α), kde C je koncentrace v molech na litr a α je disociovaná frakce. Je nutné vyloučit CO₂. Další podrobnosti o zkoušce a metoda výpočtu jsou uvedeny v normách a odborné literatuře (1), (6) a (7).

Vypočítá se pK_a pro 10 měřených bodů na titrační křivce. Vypočítá se střední hodnota těchto hodnot pK_a a směrodatná odchylka. Měl by být přiložen graf závislosti hodnot pH na objemu standardní zásady nebo kyseliny spolu s vyjádřením v tabulce.

Hodnoty absorbance a pH v každém spektru se uvedou v tabulce. Z mezilehlých údajů ve spektrech se vypočítá alespoň pět hodnot pK_a a vypočte se rovněž střední hodnota těchto výsledků a směrodatná odchylka.

Vypočítá se ekvivalentní vodivost Λ pro každou koncentraci kyseliny a pro každou koncentraci směsi jednoho ekvivalentu kyseliny plus 0,98 ekvivalentu hydroxidu sodného bez uhličitanů. Přebytek kyseliny má zabránit přebytku OH^– v důsledku hydrolýzy. Hodnota 1/Λ se vynese do grafu v závislosti na √C a hodnotu Λ_o soli lze stanovit extrapolací na nulovou koncentraci.

Hodnotu Λ_o kyseliny lze vypočítat pomocí hodnot H⁺ a Na⁺ uvedených v odborné literatuře. Hodnotu pK_a je možné vypočítat z α = Λ_i /Λ_o a K_a = α²C/(1 – α) pro každou koncentraci. Přesnější hodnoty Ka lze získat provedením úprav na mobilitu a aktivitu. Měla by se vypočítat střední hodnota a směrodatné odchylky z hodnot pK_a.

Předložit by se měly všechny naměřené údaje a vypočítané hodnoty pK_a spolu s metodou výpočtu (nejlépe ve formě tabulky, jak se doporučuje v položce seznamu literatury (1)) a stejně tak i výše popsané statistické parametry. U titračních metod by měly být uvedeny podrobnosti o standardizaci titračních roztoků.

U spektrofotometrické metody by měla být předložena všechna spektra. U konduktometrické metody by měly být uvedeny podrobnosti týkající se stanovení článkové konstanty. Měly by se uvést informace o použitém postupu, analytických metodách a povaze všech použitých pufrů.

Měla by se uvést zkušební teplota (teploty).

• 1) Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.
• 2) Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, s. 1186–1188 (1969).
• 3) ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
• 4) Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.
• 5) Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).
• 6) ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
• 7) Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (viz výše (4)).
• 8) Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).

Složení zkoušené látky, včetně hlavních nečistot, a její relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti, včetně stálosti, by měly být známy před zahájením jakékoli studie toxicity.

Fyzikálně-chemické vlastnosti zkoušené látky poskytují důležité informace pro výběr způsobu podávání, pro návrh každé jednotlivé studie a pro manipulaci se zkoušenou látkou a její uchovávání.

Zahájení studie by měl předcházet vývoj analytické metody pro kvalitativní a kvantitativní stanovení zkoušené látky (pokud možno včetně hlavních nečistot) v dávkovacím médiu a v biologickém materiálu.

Veškeré informace týkající se identifikace, fyzikálně-chemických vlastností, čistoty a chování zkoušené látky by měly být obsaženy v protokolu o zkoušce.

Při zkoušení toxicity jsou důležité přísná kontrola podmínek prostředí a správná péče o zvířata.

Podmínky chovu v prostorech nebo klecích pro pokusná zvířata by měly vyhovovat testovacím druhům. Pro potkany, myši a morčata jsou vhodnými podmínkami teplota místnosti 22 ± 3 ^oC a relativní vlhkost 30 až 70 %; pro králíky se doporučuje teplota 20 ± 3 ^oC a relativní vlhkost 30 až 70 %.

Některé experimentální techniky jsou zvláště citlivé na vliv teploty a v takových případech jsou v popisu zkušební metody uvedeny podrobnosti o vhodných podmínkách. Při všech sledováních toxických účinků by měly být zaznamenávány údaje o teplotě a vlhkosti a měly by být zahrnuty do závěrečné zprávy o studii.

Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Podrobnosti o světelném režimu by měly zaznamenány a uvedeny v konečné zprávě studie.

Není-li v metodě uvedeno jinak, měla by být zvířata chována jednotlivě nebo umístěna v klecích po malých skupinách stejného pohlaví; jsou-li zvířata v klecích po skupinách, nemělo by být chováno v jedné kleci více než pět zvířat.

Ve zprávách o experimentech na zvířatech je důležité uvést typ použité klece a počet zvířat chovaných v každé kleci jak během expozice chemické látce, tak během kterékoli další doby pozorování.

Strava by měla splňovat veškeré požadavky výživy pro příslušný testovací druh. Pokud jsou zkoušené látky podávány v potravě, může být nutriční hodnota snížena interakcí látky s některou složkou potravy. Možnost takové reakce by měla být zohledněna při interpretaci výsledků zkoušky. Může být použita konvenční laboratorní strava s neomezeným přístupem k pitné vodě. Výběr potravy se může řídit potřebou zajistit vhodné přimíchání zkoušené látky, pokud je podávána touto metodou.

Příměsi v potravě, jejichž vliv na toxicitu je znám, nesmí být přítomny v koncentracích, ve kterých by se vliv projevil.

Vědeckým cílem Evropské unie je vývoj a validace alternativních metod, které mohou poskytnout stejnou úroveň informací jako současné zkoušky na zvířatech, při nichž se však použije méně zvířat, způsobí méně utrpení nebo se v nich použití zvířat zcela vypouští.

Hned po svém uvedení do praxe musí být tyto metody použity, kdykoli je to možné, pro charakterizaci nebezpečnosti a následnou klasifikaci a označování látek z hlediska jejich nebezpečnosti.

Při hodnocení a interpretaci zkoušek musí být vzaty v úvahu určité meze, nakolik lze výsledky studií na zvířatech a in vitro extrapolovat na člověka, a proto lze pro potvrzení výsledků zkoušení použít poznatky o nepříznivých účincích na člověka, pokud jsou k dispozici.

Tyto metody jsou většinou vyvinuty v rámci programu OECD pro zkušební pokyny a měly by být prováděny v souladu s principy správné laboratorní praxe, aby bylo zajištěno co nejširší „vzájemné uznávání údajů“.

Další podobnější informace lze získat v pokynech OECD a v příslušné literatuře publikované jinde.

Tato zkušební metoda je rovnocenná metodě OECD TG 420 (2001).

Tradiční metody hodnocení akutní toxicity používají jako koncový bod uhynutí zvířat. V roce 1984 navrhla Britská toxikologická společnost nový přístup k testování akutní toxicity založený na podávání řady fixních dávek (1). Tento přístup jako koncový bod nepoužíval uhynutí zvířat, nýbrž se opíral o pozorování jasných příznaků toxicity u jedné z řady fixních dávek. Po provedení britských (2) a mezinárodních (3) validačních studií in vivo byl tento postup v roce 1992 přijat jako zkušební metoda. Následně byly pomocí matematických modelů v řadě studií (4, 5, 6) vyhodnoceny statistické vlastnosti metody fixní dávky. Studie in vivo a modelové studie společně prokázaly, že metoda je reprodukovatelná, vyžaduje méně zvířat, působí menší utrpení než tradiční metody a dokáže látky zařadit podobně jako jiné zkušební metody akutní toxicity.

Poučení týkající se výběru nejvhodnější zkušební metody k danému účelu obsahuje text Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7). V tomto dokumentu jsou také uvedeny doplňující informace o provádění a analýze zkušební metody B.1.a.

Podstatou metody je použití pouze středně toxických dávek v hlavní studii, dávky, u nichž se očekává, že budou letální, by neměly být podávány. Také není nutné podávat dávky, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazně dráždivých účinků vyvolávají značnou bolest a utrpení. Umírající zvířata nebo zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, se humánně utratí a při analýze výsledků se hodnotí jako zvířata uhynulá při zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících zvířat a poučení týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou předmětem samostatného dokumentu (8).

Metoda poskytuje informace o nebezpečných vlastnostech a umožňuje zařazení a klasifikaci látky podle globálně harmonizovaného systému (GHS) klasifikace chemických látek, které způsobují akutní toxicitu (9).

Zkušební laboratoř by před provedením studie měla vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Součástí těchto informací je totožnost a chemická struktura látky, výsledky jiných zkoušek toxicity dané látky, in vitro nebo in vivo, toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru vhodné výchozí dávky.

Akutní orální toxicita: nepříznivé účinky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 hodin.

Opožděný úhyn: znamená, že zvíře během 48 hodin neuhyne ani nejeví známky umírání, ale uhyne později během čtrnáctidenní doby pozorování.

Dávka: množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (např. mg/kg).

Zjevná toxicita: obecný pojem popisující zřetelné příznaky toxicity, které se projeví po podání zkoušené látky (příklady viz (3)), kdy při podání další vyšší fixní dávky lze u většiny pokusných zvířat očekávat značné bolesti a přetrvávající známky značného utrpení, stavu agónie (kritéria uvádí dokument Humane Endpoints Guidance (8)) nebo pravděpodobné uhynutí.

GHS: Globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (lidské zdraví a životní prostředí), Odborného výboru OSN pro přepravu nebezpečného zboží (fyzikálně-chemické vlastnosti) a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpečnosti) koordinovaný Meziorganizačním programem pro řádné nakládání s chemikáliemi (IOMC).

Blížící se uhynutí: stav agónie nebo uhynutí je očekáván před další plánovanou dobou pozorování. Příznaky svědčící o tomto stavu u hlodavců mohou zahrnovat křeče, polohu na boku, polohu vleže a třes (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (8)).

LD₅₀ (střední letální dávka): statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, u níž lze očekávat, že způsobí uhynutí 50 % zvířat, jimž byla podána orální cestou. Hodnota LD₅₀ se vyjadřuje v hmotnosti zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (mg/kg).

Limitní dávka: označuje nejvyšší přípustnou dávku (2000 nebo 5000 mg/kg).

Stav agónie: označuje stav úhynu nebo neschopnost přežít, ani když je zvíře léčeno (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (8)).

Předvídatelný úhyn: přítomnost klinických příznaků svědčících o smrti, přičemž doba úhynu je známá a předchází plánovanému ukončení zkoušky v budoucnosti, např. neschopnost dojít k vodě nebo potravě (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (8)).

Skupinám zvířat stejného pohlaví se postupně podá fixní dávka 5, 50, 300 a 2000 mg/kg (výjimečně lze uvažovat o další fixní dávce 5000 mg/kg, viz část 1.6.2). Výchozí úroveň dávky se zvolí na základě orientační studie jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá některé příznaky toxicity, aniž způsobí závažné toxické účinky nebo úhyn. Klinické příznaky a stavy spojené s bolestí, utrpením a blížícím se úhynem jsou podrobně popsány v samostatném dokumentu OECD (8). Dalším skupinám zvířat mohou být podány vyšší nebo nižší fixní dávky podle přítomnosti nebo nepřítomnosti příznaků toxicity nebo uhynutí. Podle tohoto postupu se pokračuje, dokud nebude zjištěna dávka vyvolávající zřejmou toxicitu nebo není pozorováno více než jedno uhynutí, anebo pokud nejsou ani při nejvyšší dávce zjištěny žádné účinky nebo pokud dochází k úhynům při nejnižší dávce.

Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít i jiné druhy hlodavců. Obvykle se používají samice (7). Je to proto, že přehled literatury o konvenčních zkouškách LD₅₀ ukazuje, že mezi pohlavími je obvykle malý rozdíl, pokud jde o citlivost, ale v případech, v nichž jsou rozdíly pozorovány, jsou samice obecně nepatrně citlivější (10). Pokud však poznatky o toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturně příbuzných chemických látek naznačují, že citlivější jsou pravděpodobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat náležité odůvodnění.

Použijí se mladá zdravá dospělá zvířata běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Každé zvíře musí být na začátku podávání látky 8 až 12 měsíců staré a jeho hmotnost by se měla pohybovat v intervalu ± 20 % střední hmotnosti zvířat, kterým byla podána předchozí dávka.

Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 ^oC (± 3 ^oC). Relativní vlhkost vzduchu by měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 %, kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. Zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky, ale počet zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého zvířete.

Zvířata se náhodně vyberou, pro usnadnění individuální identifikace se označí, a chovají se v klecích minimálně pět dnů před začátkem podávání látky, aby se mohla přizpůsobit laboratorním podmínkám.

Zkoušená látka by obecně měla být při všech úrovních zkoušených dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného přípravku. V případech, kdy má být zkoušen kapalný koncový produkt nebo směs, může však být použití nezředěné zkoušené látky, tj. s konstantní koncentrací, pro hodnocení následného rizika této látky užitečnější a je vyžadováno některými kontrolními orgány. Ani v jednom případě nesmí být překročen maximální objem dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, avšak u vodních roztoků připadá v úvahu i dávka 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. S ohledem na složení dávkovaného přípravku se ve všech případech, kde je to možné, doporučuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v pořadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec případně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných než voda musí být známy toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce před podáním, pokud není stálost přípravku během doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako přijatelná.

Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žaludeční sondy nebo vhodné intubační kanyly. Pokud výjimečně není možné podat dávku najednou, lze ji podat po menších množstvích během nejvýše 24 hodin.

Před podáním zkoušené látky nemají zvířata dostávat potravu (např. potkanům by se neměla podávat přes noc, myším 3–4 hodiny), voda se však ponechává. Po uplynutí doby hladovění se zvířata zváží a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí přístupu k potravě na dalších 3–4 hodin u potkanů nebo 1–2 hodiny u myší. Podává-li se látka po částech v průběhu určité doby, může být podle délky období nezbytné poskytnout zvířatům potravu a vodu.

Cílem orientační studie je umožnit výběr vhodné výchozí dávky pro hlavní studii. Zkoušená látka se podává jednotlivým zvířatům postupně podle vývojového diagramu v příloze 1. Orientační studie je ukončena, jakmile lze stanovit výchozí dávku pro hlavní studii (nebo pokud je při nejnižší fixní dávce pozorován úhyn).

Výchozí dávka orientační studie se zvolí z fixních dávek ve výši 5, 50, 300 a 2000 mg/kg jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá zřejmou toxicitu, přičemž toto očekávání je pokud možno založeno na důkazech z údajů získaných in vivo a in vitro ze stejné chemické látky a strukturně příbuzných látek. Pokud takové informace neexistují, výchozí dávka činí 300 mg/kg.

Mezi podáním dávky každému zvířeti se ponechá doba minimálně 24 hodin. Všechna zvířata se pozorují minimálně 14 dnů.

Ve výjimečných případech a pouze je-li to odůvodněno specifickými konkrétními předpisy, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně dávky 5000 mg/kg (viz dodatek 3). S ohledem na dobré zacházení se zvířaty se pokusy na zvířatech v rámci kategorie 5 GHS (2000–5000 mg/kg) nedoporučují a měly by se zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takového pokusu mají přímý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví zvířat nebo životního prostředí.

V případech, kdy zvíře, u něhož je látka zkoušena v nejnižší fixní úrovni dávky (5 mg/kg), v orientační studii uhyne, obvykle se studie ukončí a látka přiřadí do kategorie 1 GHS (jak je uvedeno v příloze 1). Pokud je však vyžadováno další potvrzení klasifikace, může být proveden tento volitelný doplňkový postup: druhému zvířeti se podá dávka 5 mg/kg. Pokud toto druhé zvíře uhyne, bude kategorie 1 GHS potvrzena a studie okamžitě ukončena. Pokud druhé zvíře přežije, dávka 5 mg/kg se podá maximálně třem dalším zvířatům. Jelikož riziko úhynu bude vysoké, měla by být látka zvířatům podávána postupně, aby bylo zajištěno dobré zacházení se zvířaty. Časový interval mezi dávkami podanými jednotlivým zvířatům by měl být dostatečný na to, aby bylo možné stanovit, zda zvíře, jemuž byla látka podána dříve, pravděpodobně přežije. Pokud dojde k úhynu druhého zvířete, posloupnost podávání se okamžitě ukončí a látka nebude podána žádnému dalšímu zvířeti. Vzhledem k tomu, že výskyt druhého úhynu (bez ohledu na počet zvířat, na nichž byla látka v době ukončení zkoušena) spadá do výsledku A (2 anebo více úhynů), postupuje se podle pravidla klasifikace v příloze 2 s fixní dávkou 5 mg/kg (kategorie 1, pokud se vyskytnou dva a více úhynů nebo kategorie 2, pokud se nevyskytne více než 1 úhyn). Navíc je v příloze 4 uvedeno poučení týkající se klasifikace v rámci systému EU, dokud nebude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS).

Kroky, podle kterých se má postupovat po provedení zkoušek s výchozí úrovní dávky, jsou uvedeny ve vývojovém diagramu v příloze 2. Bude nutné zvolit jeden ze tří postupů: buď zkoušení ukončit a stanovit odpovídající klasifikační třídu nebezpečnosti, nebo provést zkoušky s vyšší fixní dávkou, nebo zkoušky s nižší fixní dávkou. S ohledem na ochranu zvířat se v hlavní studii znovu nepoužije úroveň dávky, která v orientační studii vedla k uhynutí (viz dodatek 2). Zkušenosti ukázaly, že nejpravděpodobnějším výsledkem u výchozí úrovně dávky bude, že látku lze klasifikovat bez nutnosti dalších zkoušek.

Obvykle se pro každou zkoumanou úroveň dávky použije celkem pět zvířat stejného pohlaví. Mezi těmito pěti zvířaty bude jedno zvíře z orientační studie, jemuž byla podána zvolená úroveň dávky, a další čtyři zvířata (kromě výjimečných případů, kdy úroveň dávky použité v hlavní studii nebyla součástí orientační studie).

Časový interval mezi podáváním jednotlivé výše dávky závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. Expozice zvířat další dávce bude odložena, dokud nebude jisté, že zvířata, jimž byla podána předchozí dávka, přežila. Mezi jednotlivými dávkami se v případě potřeby doporučuje ponechat dobu 3 nebo 4 dnů, aby bylo umožněno pozorování zpožděné toxicity. Časový interval lze podle potřeby upravit, např. v případě neprůkazné reakce.

Při zvažování použití nejvyšší fixní dávky 5000 mg/kg se postupuje podle metody popsané v příloze 3 (viz také 1.6.2).

Limitní zkouška se používá především tehdy, má-li osoba provádějící zkoušku informace svědčící o tom, že zkoušený materiál je pravděpodobně netoxický, tj. je toxický pouze nad rámec regulačních limitních dávek. Informace o toxicitě zkoušeného materiálu lze získat ze znalostí o podobných zkoušených sloučeninách, směsích nebo produktech s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušený materiál bude toxický, bude provedena hlavní zkouška.

Podle obvyklého postupu slouží jako limitní zkouška pro tyto pokyny výchozí dávka orientační studie 2000 mg/kg (nebo výjimečně 5000 mg/kg), po níž následuje podání této výše dávky dalším čtyřem zvířatům.

Po podání dávky se zvířata pozorují individuálně minimálně jednou během prvních 30 minut, pravidelně během prvních 24 hodin, přičemž zvláštní pozornost se věnuje prvním 4 hodinám, a poté denně po dobu 14 dnů kromě případů, kdy je nutné zvířata ze studie vyjmout a humánně utratit z důvodu dodržování pravidla dobrého zacházení se zvířaty, nebo je zjištěn jejich úhyn. Doba pozorování by však neměla být stanovena pevně. Bude stanovena podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a může tedy být podle potřeby prodloužena. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity (11). Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou jednotlivě, pro každé zvíře.

Další pozorování budou nutná, jestliže zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnují změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je třeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu. Vezmou se v úvahu principy a kritéria shrnuté v textu Humane Endpoints Guidance Document (8). Zvířata ve stavu agónie a zvířata se známkami prudkých bolestí nebo s přetrvávajícími příznaky značného utrpení se humánně utratí. Pokud jsou zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.

Hmotnost jednotlivých zvířat se stanoví krátce před podáním zkoušené látky a nejméně jednou týdně poté. Vypočítají se změny hmotnosti a zaznamenají se. Na konci zkoušky se zvířata, která přežila, zváží a poté humánně utratí.

Všechna pokusná zvířata (včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena z důvodu dodržování pravidla dobrého zacházení se zvířaty) se pitvají. U každého zvířete se zaznamenají všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikroskopické vyšetření orgánů, u nichž jsou patrné makroskopické patologie, u zvířat, která přežila 24 nebo více hodin po prvním podání dávky, protože mohou poskytnout užitečné informace.

Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy.

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

• Zkoušená látka:

  • fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace),

  • identifikační údaje, včetně čísla CAS.

• Vehikulum (je-li použito):

  • zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.

• Pokusná zvířata:

  • použitý druh/kmen,

  • mikrobiologický stav zvířat, je-li znám,

  • počet, stáří a pohlaví zvířat (případně včetně zdůvodnění použití samců místo samic),

  • původ, podmínky chovu, strava atd.

• Zkušební podmínky:

  • podrobné údaje o složení zkoušené látky, včetně podrobností o fyzikální formě podávaného materiálu,

  • podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky, včetně objemu dávek a době podávání,

  • podrobné údaje o stravě a kvalitě vody (včetně druhu/zdroje stravy, zdroje vody),

  • zdůvodnění výběru výchozí dávky.

• Výsledky:

  • údaje o reakcích každého zvířete a o výši jeho dávky (tj. počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, včetně uhynutí, povahy, závažnosti a trvání účinků), ve formě tabulky,

  • údaje o tělesné hmotnosti a jejích změnách ve formě tabulky,

  • hmotnosti jednotlivých zvířat v den podání dávky, poté v týdenních intervalech a v čase úhynu nebo utracení,

  • datum a doba úhynu, pokud předchází plánovanému usmrcení,

  • časový průběh nástupu příznaků toxicity u každého zvířete, a zda byly vratné,

  • pitevní a histopatologické nálezy pro každé zvíře, pokud jsou k dispozici.

• Diskuse a interpretace výsledků.

• Závěry.

Kritéria pro kategorii nebezpečnosti 5 mají umožnit identifikaci zkoušených látek, u nichž je nebezpečí akutní toxicity nízké, avšak které mohou za určitých okolností pro citlivé jedince představovat nebezpečí. U těchto látek se předpokládá, že se jejich orální nebo dermální LD₅₀ nebo LD₅₀ ekvivalentních dávek podávaných jinými cestami pohybuje v rozmezí od 2000 do 5000 mg/kg. Zkoušené látky lze klasifikovat v kategorii nebezpečnosti definované jako 2000 mg/kg < LD₅₀ < 5000 mg/kg (v GHS kategorie 5) v těchto případech:

• a) pokud je do této kategorie zařazena podle některého ze způsobů zkoušení uvedeného v příloze 2, a to v závislosti na výskytech uhynutí;
• b) pokud jsou již k dispozici spolehlivé důkazy naznačující, že LD₅₀ se pohybuje v rozmezí hodnot kategorie 5, nebo pokud z jiných studií na zvířatech nebo z toxických účinků na člověka vyplývají akutní obavy o lidské zdraví;
• c) pokud extrapolací, odhadem nebo měřením údajů není přiřazení do vyšší třídy nebezpečnosti odůvodněno a

  • pokud jsou k dispozici spolehlivé informace naznačující významné toxické účinky na člověka, nebo

  • pokud je během zkoušení orální cestou s dávkami nejvýše kategorie 4 pozorováno uhynutí, nebo

  • v případech, kdy odborný posudek potvrdí závažné klinické příznaky toxicity při testování s dávkami nejvýše kategorie 4 s výjimkou průjmu, zježení srsti nebo rozcuchané srsti, nebo

  • v případech, kdy odborný posudek potvrdí spolehlivé informace, které naznačují možnost závažných akutních účinků vyplývajících z jiných studií na zvířatech.

Ve výjimečných případech, a pouze je-li to odůvodněno specifickými regulačními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně fixní dávky 5000 mg/kg. S ohledem na zásadu dobrého zacházení se zvířaty se zkoušení s dávkami 5000 mg/kg nedoporučuje, mělo by se zvažovat pouze v případě, že existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky by měly přímý význam pro ochranu zvířat nebo lidského zdraví (9).

Pravidla pro rozhodování, jimiž se řídí metoda postupného podávání dávek uvedená v příloze 1, se rozšíří tak, aby zahrnovala úroveň dávky 5000 mg/kg. Pokud se v orientační studii použije výchozí dávka 5000 mg/kg, výsledek A (úhyn) povede k nutnosti zkoušet na druhém zvířeti dávku 2000 mg/kg. Výsledky B a C (zřejmá toxicita nebo žádná toxicita) umožní zvolit dávku 5000 mg/kg za výchozí dávku hlavní studie. Podobně pokud se použije výchozí dávka jiná než 5000 mg/kg, zkoušení pokračuje na úroveň 5000 mg/kg v případě, že se při 2000 mg/kg zjistí výsledky B nebo C. Následný výsledek A při 5000 mg/kg bude vyžadovat výchozí dávku hlavní studie 2000 mg/kg a výsledky B a C budou vyžadovat výchozí dávku v hlavní studii 5000 mg/kg.

Pravidla pro rozhodování, jimiž se řídí metoda postupného podávání dávek uvedená v příloze 2, se rozšíří tak, aby zahrnovala úroveň dávky 5000 mg/kg. Pokud se tedy v hlavní studii použije výchozí dávka 5000 mg/kg, bude výsledek A (≥ 2 úhyny) vyžadovat zkoušení dávky 2000 mg/kg na druhé skupině. Výsledek B (zřejmá toxicita a/nebo ≤ 1 úhyn) nebo C (žádná toxicita) povedou k tomu, že látka nebude podle GHS klasifikována. Podobně pokud se použije výchozí dávka jiná než 5000 mg/kg, zkoušení pokračuje na úroveň 5000 mg/kg v případě, že se při 2000 mg/kg zjistí výsledek C. Následný výsledek A při 5000 mg/kg povede k tomu, že se látka přiřadí do kategorie 5 GHS a na základě výsledku B nebo C látka nebude klasifikována.

Tato zkušební metoda odpovídá metodě OECD TG 423 (2001).

Metoda stanovení třídy akutní toxicity (1) stanovená v této zkoušce je metodou po krocích, přičemž u každého kroku se používají tři zvířata stejného pohlaví. V závislosti na úmrtnosti a/nebo stavu agónie zvířat lze o akutní toxicitě zkoušené látky rozhodnout průměrně na základě 2 až 4 kroků. Tato metoda je reprodukovatelná, vyžaduje méně zvířat a dokáže látky zařadit podobně jako jiné zkušební metody akutní toxicity. Metoda stanovení třídy akutní toxicity je založena na biometrickém hodnocení (2)(3)(4)(5) s fixními dávkami, přiměřeně oddělenými tak, aby umožnila zařazení látky pro účely klasifikace a posouzení nebezpečnosti. Metoda přijatá v roce 1996 byla podrobena rozsáhlým národním (6) mezinárodním (7) validačním studií in vivo pro srovnání s hodnotami LD₅₀ získanými z literatury.

Obecný návod týkající se výběru nejvhodnější zkušební metody k danému účelu obsahuje text Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). V tomto dokumentu jsou také uvedeny doplňující informace o provádění a analýze zkušební metody B.1.b.

Není nutné podávat zkoušené látky v dávkách, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazně dráždivých účinků vyvolávají značnou bolest a utrpení. Umírající zvířata nebo zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, se humánně utratí a při interpretaci výsledků jsou hodnocena jako zvířata uhynulá při zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících zvířat a poučení týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou předmětem samostatného dokumentu (9).

Metoda využívá předem stanovených dávek a její výsledky umožňují látku zařadit a klasifikovat podle globálně harmonizovaného systému klasifikace chemických látek, které způsobují akutní toxicitu (10).

V zásadě tato metoda neslouží k vypočtení přesné hodnoty LD₅₀, ale umožňuje určit definované rozpětí expozice, při které se předpokládá letalita, neboť hlavním koncovým vyhodnocením této zkoušky zůstává uhynutí části zvířat. Metoda umožňuje stanovit hodnotu LD₅₀, pouze pokud alespoň dvě dávky vedou k mortalitě vyšší než 0 % a nižší než 100 %. Použití výběru předem stanovených dávek, bez ohledu na zkoušenou látku, u něhož se klasifikace explicitně váže k počtu zvířat pozorovaných v různých stavech, zvyšuje možnost konzistentního a opakovaného předávání zpráv mezi laboratořemi.

Zkušební laboratoř vezme před provedením studie v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Součástí těchto informací je totožnost a chemická struktura látky, její fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledek jiných zkoušek toxicity dané látky in vitro nebo in vivo, toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru nejvhodnější výchozí dávky.

Akutní orální toxicita: se vztahuje na nepříznivé účinky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 hodin.

Opožděný úhyn: znamená, že zvíře během 48 hodin neuhyne ani nejeví známky umírání, ale uhyne později během čtrnáctidenní doby pozorování.

Dávka: množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (např. mg/kg).

GHS: globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (lidské zdraví a životní prostředí), Odborného výboru OSN pro přepravu nebezpečného zboží (fyzikálně-chemické vlastnosti) a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpečnosti) koordinovaný Meziorganizačním programem pro řádné nakládání s chemikáliemi (IOMC).

Blížící se uhynutí: stav agónie nebo uhynutí je očekáván před další plánovanou dobou pozorování. Příznaky svědčící o tomto stavu mohou u hlodavců zahrnovat křeče, polohu na boku, polohu vleže a třes (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (9)).

LD₅₀ (střední letální orální dávka): statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, u níž lze očekávat, že způsobí uhynutí 50 % zvířat, jimž byla podána orální cestou. Hodnota LD₅₀ se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (mg/kg).

Limitní dávka: označuje nejvyšší přípustnou dávku (2000 nebo 5000 mg/kg).

Stav agónie: označuje stav úhynu nebo neschopnost přežít, ani když je zvíře léčeno (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (9)).

Předvídatelný úhyn: přítomnost klinických příznaků svědčících o smrti, přičemž doba úhynu je známa a předchází plánovanému ukončení zkoušky v budoucnosti, např. neschopnost dojít k vodě nebo potravě (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance Document (9)).

Podstatou zkoušky je, že se pomocí metody po krocích, využívající minimálního počtu zvířat u každého kroku, získají informace o akutní toxicitě zkoušené látky, které umožní její klasifikaci. Látka se skupině pokusných zvířat podává orálně v jedné ze stanovených dávek. Látka se zkouší metodou po krocích, přičemž u každého kroku se používají tři zvířata stejného pohlaví (obvykle samice). Přítomnost nebo nepřítomnost mortality vyvolané látkou u zvířat, jimž byla látka podána v jednom kroku, rozhodne o dalším kroku, tj.:

• není třeba žádné další zkoušení,

• podá se stejná dávka dalším třem zvířatům,

• látka se podá dalším třem zvířatům v nejbližší vyšší nebo nejbližší nižší úrovni dávky.

Podrobnosti postupu zkoušení jsou uvedeny v příloze 1. Metoda umožní rozhodnout s ohledem na zařazení zkoušené látky do jedné z řady tříd toxicity definovaných fixními hraničními hodnotami LD₅₀.

Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít i jiné druhy hlodavců. Obvykle se používají samice (9). Je to proto, že přehled literatury o konvenčních zkouškách LD₅₀ ukazuje, že ačkoliv je mezi pohlavími obvykle malý rozdíl, pokud jde o citlivost, jsou samice v případech, ve kterých jsou rozdíly pozorovány, obecně nepatrně citlivější (11). Pokud však poznatky o toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturně příbuzných chemických látek naznačují, že citlivější jsou pravděpodobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat náležité odůvodnění.

Použijí se mladá zdravá dospělá zvířata běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Každé zvíře musí být na začátku podávání látky 8 až 12 měsíců staré a jeho hmotnost by se měla pohybovat v intervalu ±20 % střední hmotnosti zvířat, kterým byla podána předchozí dávka.

Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 ^oC (± 3 ^oC), relativní vlhkost vzduchu by měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 %, kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. Zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky, ale počet zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého zvířete.

Zvířata se náhodně vyberou, pro usnadnění individuální identifikace se označí a chovají se v klecích minimálně pět dnů před podáním látky, aby se mohla přizpůsobit laboratorním podmínkám.

Zkoušená látka by obecně měla být při všech úrovních zkoušených dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného přípravku. V případech, kdy má být zkoušen kapalný koncový produkt nebo směs, může však být použití nezředěné zkoušené látky, tj. s konstantní koncentrací, pro hodnocení následného rizika této látky užitečnější a je vyžadováno některými kontrolními orgány. Ani v jednom případě nesmí být překročen maximální objem dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, avšak u vodních roztoků připadá v úvahu i dávka 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. S ohledem na složení dávkovaného přípravku se ve všech případech, kde je to možné, doporučuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v pořadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec případně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných než voda musí být známy toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce před podáním, pokud není stálost přípravku během doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako přijatelná.

Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žaludeční sondy nebo vhodné intubační kanyly. Pokud výjimečně není možné podat dávku najednou, lze ji podat po menších množstvích během nejvýše 24 hodin.

Před podáním zkoušené látky nemají zvířata dostávat potravu (např. potkanům by se neměla podávat přes noc, myším 3–4 hodiny), voda se však ponechává. Po uplynutí doby hladovění se zvířata zváží a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí přístupu k potravě na další 3–4 hodiny u potkanů nebo 1–2 hodiny u myší. Podává-li se látka po částech v průběhu určité doby, může být podle délky období nezbytné poskytnout zvířatům potravu a vodu.

V každém kroku se používají tři zvířata. Dávka, která bude použita jako výchozí, se zvolí z jedné ze čtyř fixních úrovní: 5, 50, 300 a 2000 mg/kg tělesné hmotnosti. Výchozí dávka by měla být taková, která nejpravděpodobněji vyvolá uhynutí některých zvířat, jimž bude podána. Postup, který je nutno u každé výchozí dávky dodržet, je popsán ve vývojových diagramech v příloze 1. V příloze 4 jsou uvedeny pokyny týkající se klasifikace v rámci systému EU do doby, než bude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS).

Pokud dostupné informace naznačují, že při nejvyšší úrovni výchozí dávky (2000 mg/kg tělesné hmotnosti) je úmrtnost nepravděpodobná, je nutné provést limitní zkoušku. Pokud nejsou o látce, která má být zkoušena, k dispozici žádné informace, doporučuje se, z důvodů dodržování pravidla dobrého zacházení se zvířaty, použít výchozí dávku 300 mg/kg tělesné hmotnosti.

Časový interval mezi experimentálními skupinami závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. Podání další dávky bude odloženo, dokud nebude jisté, že zvířata, jimž byla podána předchozí dávka, přežila.

Ve výjimečných případech a pouze je-li to odůvodněno specifickými konkrétními předpisy, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně dávky 5000 mg/kg tělesné hmotnosti (viz dodatek 2). S ohledem na zásadu dobrého zacházení se zvířaty se pokusy na zvířatech v rámci kategorie 5 GHS (2000–5000 mg/kg) nedoporučují a měly by se zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky budou mít přímý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví zvířat nebo životního prostředí.

Limitní zkouška se používá především tehdy, má-li osoba provádějící zkoušku informace svědčící o tom, že zkoušený materiál je pravděpodobně netoxický, tj. je toxický pouze nad rámec regulačních limitních dávek. Informace o toxicitě zkoušeného materiálu lze získat ze znalostí o podobných zkoušených sloučeninách, směsích nebo produktech s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušený materiál bude toxický, bude provedena hlavní zkouška.

Limitní zkoušku s jednou úrovní dávky 2000 mg/kg tělesné hmotnosti lze provést na šesti zvířatech (tři zvířata na jeden krok). Výjimečně lze na třech zvířatech provést limitní zkoušku s jednou úrovní dávky 5000 mg/kg (viz dodatek 2). Projeví-li se úmrtnost vyvolaná zkoušenou látkou, budou další zkoušky uskutečněny s nejbližší nižší úrovní dávky.

Po podání dávky se zvířata pozorují individuálně minimálně jednou během prvních 30 minut, pravidelně během prvních 24 hodin, přičemž zvláštní pozornost se věnuje prvním 4 hodinám, a poté denně po dobu 14 dnů kromě případů, kdy je nutné zvířata ze studie vyjmout a humánně utratit z důvodu dodržování pravidla dobrého zacházení se zvířaty, nebo je zjištěn jejich úhyn. Doba pozorování by však neměla být stanovena pevně. Bude stanovena podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a může tedy být podle potřeby prodloužena. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity (12). Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé zvíře jednotlivě.

Další pozorování budou nutná, jestliže zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnují změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je třeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu. Vezmou se v úvahu principy a kritéria shrnuté v textu Humane Endpoints Guidance Document (9). Zvířata ve stavu agónie a zvířata se známkami prudkých bolestí nebo s přetrvávajícími příznaky značného utrpení se humánně utratí. Pokud jsou zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.

Hmotnost jednotlivých zvířat se stanoví krátce před podáním zkoušené látky a nejméně jednou týdně poté. Vypočítají se změny hmotnosti a zaznamenají se. Na konci zkoušky se zvířata, která přežila, zváží a humánně utratí.

Všechna pokusná zvířata (včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena z důvodu dodržování pravidla dobrého zacházení se zvířaty) se pitvají. U každého zvířete se zaznamenají všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikroskopické vyšetření orgánů, u nichž jsou patrné makroskopické patologie, u zvířat, která přežila 24 nebo více hodin, protože mohou poskytnout užitečné informace.

Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat následující informace:

• Zkoušená látka:

  • fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace),

  • identifikační údaje, včetně čísla CAS.

• Vehikulum (je-li použito):

  • zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.

• Pokusná zvířata:

  • použitý druh/kmen,

  • mikrobiologický stav zvířat, je-li znám,

  • počet, stáří a pohlaví zvířat (případně včetně zdůvodnění použití samců místo samic),

  • původ, podmínky chovu, strava atd.

• Zkušební podmínky:

  • podrobné údaje o složení zkoušené látky, včetně podrobností o fyzikální formě podávaného materiálu,

  • podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky, včetně objemu dávek a době podávání,

  • podrobné údaje o stravě a kvalitě vody (včetně druhu/zdroje stravy, zdroje vody),

  • zdůvodnění výběru výchozí dávky.

• Výsledky:

  • údaje ve formě tabulky o reakcích každého zvířete a o výši jeho dávky (tj. počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, včetně uhynutí, povahy, závažnosti a trvání účinků),

  • údaje o tělesné hmotnosti a jejích změnách ve formě tabulky,

  • hmotnosti jednotlivých zvířat v den podání dávky, poté v týdenních intervalech a v čase úhynu nebo utracení,

  • datum a doba úhynu, pokud předchází plánovanému usmrcení,

  • časový průběh nástupu příznaků toxicity u každého zvířete, a zda byly vratné,

  • pitevní a histopatologické nálezy pro každé zvíře, pokud jsou k dispozici.

• Diskuse a interpretace výsledků.

• Závěry.

Systém zkoušení u každé výchozí dávky obsažený v této příloze nastiňuje postup, který je třeba sledovat.

• Dodatek 1A: výchozí dávka je 5 mg na kg tělesné hmotnosti.

• Dodatek 1B: výchozí dávka je 50 mg na kg tělesné hmotnosti.

• Dodatek 1C: výchozí dávka je: 300 mg na kg tělesné hmotnosti.

• Dodatek 1D: výchozí dávka je: 2000 mg na kg tělesné hmotnosti.

Postup zkoušení se řídí naznačenými šipkami v závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých zvířat.

Kritéria pro kategorii nebezpečnosti 5 mají umožnit identifikaci zkoušených látek, u nichž je nebezpečí akutní toxicity relativně nízké, avšak které mohou za určitých okolností pro citlivé jedince představovat nebezpečí. U těchto látek se předpokládá, že se jejich orální nebo dermální LD₅₀ nebo LD₅₀ ekvivalentních dávek podávaných jinými cestami pohybuje v rozmezí od 2000 do 5000 mg/kg. Zkoušenou látku lze klasifikovat v kategorii nebezpečnosti definované jako 2000 mg/kg < LD₅₀ < 5000 mg/kg v těchto případech (v GHS kategorie 5):

• a) pokud je do této kategorie zařazena podle některého ze systémů zkoušení uvedeného v příloze 1a–1d, v závislosti na výskytech uhynutí;
• b) pokud jsou již k dispozici spolehlivé důkazy naznačující, že LD₅₀ se pohybuje v rozmezí hodnot kategorie 5, nebo pokud z jiných studií na zvířatech nebo toxických účinků na člověka vyplývají akutní obavy o lidské zdraví;
• c) pokud extrapolací, odhadem nebo měřením údajů není přiřazení do vyšší třídy nebezpečnosti odůvodněno a

  • pokud jsou k dispozici spolehlivé informace naznačující závažné toxické účinky na člověka, nebo

  • pokud je během zkoušení orální cestou do hodnot kategorie 4 pozorováno uhynutí, nebo

  • v případech, kdy odborný posudek potvrdí závažné klinické příznaky toxicity při testování do hodnot kategorie 4 s výjimkou průjmu, zježení srsti nebo rozcuchané srsti, nebo

  • v případech, kdy odborný posudek potvrdí spolehlivé informace, které naznačují možnost závažných akutních účinků vyplývajících z jiných studií na zvířatech.

S ohledem na nutnost dodržování zásady dobrého zacházení se zvířaty se zkoušení na zvířatech v kategorii 5 (5000 mg/kg) nedoporučuje a mělo by se zvažovat pouze v případě, že existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky mají přímý význam pro ochranu lidského zdraví nebo zdraví zvířat (10). S vyššími úrovněmi dávek se žádné další zkoušky neprovedou.

Pokud je vyžadováno zkoušení s dávkou 5000 mg/kg, vyžaduje se pouze jeden krok (tj. tři zvířata). Pokud první zvíře, jemuž byla podána dávka, uhyne, pokračuje podávání s úrovní 2000 mg/kg podle vývojového diagramu v příloze 1. Pokud první zvíře přežije, podá se dávka dalším dvěma zvířatům. Pokud uhyne pouze jedno zvíře ze tří, očekává se, že hodnota LD₅₀ přesáhne 5000 mg/kg. Pokud uhynou obě zvířata, pokračuje se podáním dávky 2000 mg/kg.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

• Odůvodnění zkoušení in vivo:

  • analýza průkaznosti výsledků údajů z dřívějších zkoušek, včetně výsledků strategie postupného zkoušení, s posouzením závažnosti důkazů,

  • popis relevantních údajů z předchozích zkoušek,

  • údaje získané v každé fázi strategie zkoušení,

  • popis provedených zkoušek in vitro, včetně podrobných údajů o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referenčními látkami,

  • analýza závažnosti důkazů odůvodňující provedení studie in vivo.

• Zkoušená chemická látka:

  • jednosložková látka: chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.,

  • vícesložková látka, směs a látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkty nebo biologické materiály (UVCB): charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek,

  • fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

  • zdroj, číslo šarže, jsou-li k dispozici,

  • případně ošetření zkoušených chemických/kontrolních látek před zkoušením (např. zahřátí, mletí),

  • stabilita zkoušené chemické látky, datum použitelnosti nebo datum opětovné analýzy, je-li známo,

  • podmínky skladování.

• Vehikulum:

  • identifikace, koncentrace (podle potřeby), použitý objem,

  • zdůvodnění výběru vehikula.

• Pokusná zvířata:

  • použitý druh/kmen, zdůvodnění použití jiných zvířat, není-li použit albinotický králík,

  • počet zvířat každého pohlaví,

  • hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku a na konci zkoušky,

  • stáří na začátku studie,

  • původ zvířat, podmínky chovu, strava atd.

• Zkušební podmínky:

  • technika přípravy oblasti kůže, na kterou se nanese náplast;

  • podrobné údaje o materiálech použitých na náplasti a technice aplikování náplastí,

  • podrobné údaje o přípravě zkoušené chemické látky, jejím nanesení a odstranění.

• Výsledky:

  • údaje o stupni odezvy na dráždivé nebo leptavé účinky u každého zvířete v každém okamžiku měření,

  • popis všech pozorovaných lézí,

  • podrobný popis povahy a stupně pozorovaných dráždivých nebo leptavých účinků a případné histopatologické nálezy,

  • popis jiných místních (např. odtučnění kůže) a systémových účinků vedle dráždivých nebo leptavých účinků na kůži.

• Diskuse o výsledcích

• Závěry

• (1) OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
• (2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28^th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.
• (3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.Žádný erytém…0Velmi slabý erytém (sotva patrný)…1Zřetelně viditelný erytém…2Mírný až výrazný erytém…3Těžký erytém (silné zrudnutí) nebo tvorba příškvaru znemožňující posouzení erytému…4Maximálně možné: 4Žádný edém…0Velmi lehký edém (sotva patrný)…1Lehký edém (okraje jsou patrné, plocha je ohraničena zřetelným vyvýšením)…2Mírný edém (okraje vyvýšeny asi o 1 mm)…3Výrazný edém (zduření více než 1 mm a otok přesahující hranice exponované plochy)…4Maximálně možné: 4Pro objasnění neurčitých reakcí lze provést histopatologické vyšetření.

Chemická látka je látka nebo směs.

Dráždivé účinky na kůži znamenají vyvolání vratných změn na kůži do 4 hodin po aplikaci zkoušené chemické látky.

Leptavé účinky na kůži znamenají vyvolání nevratného poškození kůže; zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky, do čtyř hodin po aplikaci zkoušené chemické látky. Typickými reakcemi na poleptání jsou vředy, krvácení, krvavé strupy a v závěru čtrnáctidenního pozorování ztráta barvy v důsledku vyblednutí kůže, úplná ložiska alopecie a jizvy. K vyhodnocení sporných lézí by se měla uvážit histopatologie.

Zkoušená chemická látka je jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

• doba utracení vzhledem k diurnálním odchylkám v koncentracích hormonů,

• způsob utracení – mělo by se zabránit zbytečnému stresu zvířat, který může ovlivnit koncentrace hormonů,

• testovací soupravy pro stanovení hormonů, jejichž standardní křivky se mohou lišit.

Definitivní identifikace chemických látek působících na štítnou žlázu je spolehlivější, pokud se provede pomocí histopatologické analýzy spíše než stanovením hladin hormonů.

• Zkoušená chemická látka:

  • fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,

  • identifikační údaje.

• Nosič (je-li použit):

  • zdůvodnění výběru nosiče, pokud je jiný než voda.

• Pokusná zvířata:

  • použitý druh/kmen,

  • počet, stáří a pohlaví zvířat,

  • zdroj, podmínky chovu, krmivo atd.,

  • hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku zkoušky,

  • zdůvodnění použití druhu, pokud je jiný než potkan.

• Zkušební podmínky:

  • zdůvodnění výběru úrovně dávky,

  • podrobné údaje o použité formě zkoušené chemické látky/úpravě krmiva, o dosažené koncentraci, stabilitě a homogenitě přípravku,

  • podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,

  • popřípadě přepočet koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vodě (ppm) na skutečnou denní dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),

  • podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody.

• Volitelné zkoumané cílové parametry

  • seznam volitelných zkoumaných cílových parametrů.

• Výsledky:

  • tělesná hmotnost a změny tělesné hmotnosti,

  • spotřeba krmiva, popřípadě spotřeba vody,

  • údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávky, včetně příznaků toxicity,

  • povaha, závažnost a trvání klinických projevů (ať vratných, či nevratných),

  • posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity,

  • hematologická vyšetření s příslušnými základními hodnotami (normami),

  • klinická biochemická vyšetření s příslušnými výchozími hodnotami (normami),

  • tělesná hmotnost při utracení a údaje o hmotnosti orgánů,

  • pitevní nálezy,

  • podrobný popis všech histopatologických nálezů,

  • údaje o absorpci, jsou-li dostupné,

  • popřípadě statistické zpracování výsledků.

• Diskuse o výsledcích.

• Závěry.

• Androgenicita je schopnost chemické látky působit v organismu savců jako přirozený androgenní hormon (např. testosteron).

• Antiandrogenicita je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného androgenního hormonu (např. testosteronu).

• Antiestrogenicita je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného estrogenního hormonu (např. estradiolu 17ß).

• Antityreoidální působení je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného hormonu štítné žlázy (např. T₃).

• Dávkování je obecný termín zahrnující dávku, její četnost a trvání podávání látky.

• Dávka je podávané množství zkoušené chemické látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené chemické látky na jednotku tělesné hmotnosti zvířete za den (např. mg/kg tělesné hmotnosti/den) nebo jako konstantní koncentrace v krmivu.

• Zřejmá toxicita je obecný termín popisující jasné příznaky toxicity po podání zkoušené chemické látky. Ty by měly být dostačující pro posouzení nebezpečnosti a měly by být takové, že při zvýšení podávané dávky lze očekávat rozvoj závažných toxických příznaků a pravděpodobnou mortalitu.

• NOAEL je zkratka pro angl. „no-observed-adverse-effect level“. Je to nejvyšší úroveň dávky, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky spojené se zkouškou.

• Estrogenicita je schopnost chemické látky působit v organismu savců jako přirozený estrogenní hormon (např. estradiolu 17ß).

• Zkoušená chemická látka: Jakákoli látka nebo směs zkoušená pomocí této zkušební metody.

• Tyreoidální působení je schopnost chemické látky působit jako přirozený hormon štítné žlázy (např. T₃) v savčím organismu.

• Validace je vědecký postup určený k charakterizaci provozních požadavků a omezení zkušební metody a k prokázání její spolehlivosti a relevantnosti pro konkrétní účel.

• varlata

• nadvarlata

• nadledvinky

• prostata a semenné váčky s Cowperovými žlázami

• vaječníky

• děloha včetně hrdla děložního

• štítná žláza

• gonády:

  • varlata a

  • vaječníky

• přídatné pohlavní orgány:

  • nadvarlata

  • prostata a semenné váčky s Cowperovými žlázami

  • děloha včetně hrdla děložního

• nadledvinky

• štítná žláza

• pochva

• poševní stěry

• samčí prsní žlázy

• hypofýza

• hladiny cirkulujícího T3 a T4

• hladina cirkulujícího TSH

• 1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
• 2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
• 3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
• 4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.
• 5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
• 6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
• 7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
• 8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
• 9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
• 10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
• 11) OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html
• 12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
• 13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
• 14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
• 15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.
• 16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
• 17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
• 18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
• 19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Viz obecný úvod, část B (A).

Viz obecný úvod, část B (B).

Žádné.

Zkoušená látka se denně po dobu 28 dní nanáší na kůži v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během doby aplikace se zvířata denně pozorují s cílem zjistit příznaky toxicity. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula, i zvířata, která do konce zkoušky přežila, se pitvají.

Nejsou stanovena.

Nejméně pět dní před zkouškou jsou zvířata chována v takových podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během zkoušky. Před zkouškou se provede náhodný výběr zdravých mladých dospělých zvířat, která se přiřadí do experimentálních a kontrolních skupin. Krátce před zahájením zkoušky se zvířatům ostříhá srst na zádech. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést asi 24 hodin před zkouškou. Ostříhání nebo oholení je potřeba obvykle opakovat přibližně v týdenních intervalech. Při stříhání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se neporanila kůže. Pro aplikaci zkoušené látky se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže, která má být zbavena srsti, a o velikosti krycího obvazu je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat. Při zkouškách pevných látek, které mohou být podle potřeby rozetřeny na prach, se zkoušená látka dostatečně navlhčí vodou nebo podle potřeby vhodným vehikulem, aby se zajistil dobrý styk s kůží. Kapalné zkoušené látky se zpravidla aplikují neředěné. Aplikace se provádí pět až sedm dnů v týdnu.

Mohou být použiti dospělí potkani, králíci nebo morčata. Lze použít i jiné živočišné druhy, ale jejich použití musí být zdůvodněno.

Na začátku zkoušky by nemělo rozpětí odchylek hmotností použitých zvířat u obou pohlaví (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % příslušné střední hodnoty.

Pro každou úroveň dávek se použije nejméně 10 zvířat (pět samic a pět samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se plánuje usmrcování zvířat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před koncem studie. Mimoto je možné exponovat po dobu 28 dnů satelitní skupinu 10 zvířat (pět zvířat každého pohlaví) vysokou dávkou a během následujících 14 dnů po podávání sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupina 10 kontrolních zvířat (pět zvířat každého pohlaví).

Použijí se nejméně tři úrovně dávek a kontrolní skupina nebo, je-li použito vehikulum, kontrolní skupina s vehikulem. Doba expozice by měla být nejméně šest hodin denně. Zkoušená látka by měla být aplikována každý den přibližně ve stejnou dobu a dávkování by mělo být pravidelně (týdně nebo každých čtrnáct dnů) přizpůsobeno, aby bylo konstantní vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace zkoušené látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako se zvířaty v exponované skupině. Použije-li se pro usnadnění aplikace vehikulum, aplikuje se na kontrolní skupinu stejným způsobem a ve stejném množství, jako ve skupině, které se aplikuje nejvyšší dávka. Nejvyšší úroveň dávky by měla mít za následek toxické účinky, ale neměla by způsobit žádná uhynutí, nebo by měla mít za následek malý počet uhynutí. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné známky toxicity. Je-li k dispozici použitelný odhad expozice člověka, měla by jej nejnižší úroveň překračovat. V ideálním případě by měla střední úroveň dávky vyvolat minimální pozorovatelné toxické účinky. Použije-li se více než jedna střední úroveň dávky, měly by se úrovně lišit tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupinách s nízkou a střední úrovní dávky a v kontrolní skupině by měla být četnost uhynutí nízká, aby bylo možné provést smysluplné hodnocení výsledků.

Vede-li aplikace zkoušené látky k závažnému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké úrovně dávky může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li navíc k závažnému poškození kůže, je nutné zkoušku ukončit a provést ji znovu s nižšími koncentracemi.

Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg/kg nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, je-li známa, žádné toxické účinky, není další zkoušení potřebné.

Zvířata se pozorují denně s cílem zaznamenat příznaky toxicity. Zaznamená se doba uhynutí a doba, kdy se známky toxicity objeví a vymizí.

Zvířata se chovají jednotlivě v klecích. Zvířatům se aplikuje zkoušená látka denně nejlépe 7 dní v týdnu po dobu 28 dnů. Zvířata ve všech satelitních skupinách určených pro následná pozorování by neměla být dalších 14 dnů exponována, aby se posoudilo zotavení z toxických účinků, nebo jejich přetrvávání. Doba expozice by měla být nejméně šest hodin denně.

Zkoušená látka se nanese rovnoměrně na plochu, která činí asi 10 % celkového povrchu těla. V případě vysoce toxických látek může být tato plocha menší; co největší část této plochy by se však měla pokrýt co nejslabší a nejstejnoměrnější vrstvou.

Během expozice se zkoušená látka udržuje ve styku s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Zkušební plocha se dále vhodným způsobem překryje, aby se mulový obvaz a zkoušená látka fixovaly a aby zvířata zkoušenou látku nepožila. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplné znehybnění však nelze doporučit. Jako alternativní metody je možno použít „ochranného límce“.

Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky zkoušené látky, pokud možno vodou nebo jiným vhodným způsobem očištění kůže.

Všechna zvířata se pozorují denně a zaznamenávají se příznaky toxicity, včetně doby jejich nástupu, stupně a trvání. Pozorování zahrnují změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Každý týden se zvířata váží. Doporučuje se také, aby byla každý týden zjištěna spotřeba potravy. Pravidelné pozorování zvířat je nezbytné k tomu, aby se zajistilo, že u zvířat nedochází ke ztrátám, např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po ukončení studie se všechna přeživší zvířata z jiných než satelitních skupin pitvají. Zvířata v agónii a zvířata, která se trápí nebo trpí bolestí, se ihned vyřadí, humánně utratí a pitvají.

Na konci zkušebního období se u všech zvířat, včetně kontrolních, provedou tato vyšetření:

• 1) hematologické vyšetření: stanovit alespoň hematokrit, koncentraci hemoglobinu, počet erytrocytů, celkový a diferenciální počet leukocytů a srážlivost krve;
• 2) klinické biochemické vyšetření krve: stanovení alespoň jednoho parametru funkce jater a ledvin: alaninaminotransferasa v séru (dříve známá jako glutamátpyruváttransaminasa), aspartátaminotransferasa séra (dříve známá jako glutamátoxalacetáttransaminasa), močovinový dusík, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru.

Mezi jiná stanovení, která mohou být potřebná pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukosy na lačno, analýza lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy.

Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro širší vyšetření pozorovaných účinků.

U všech zvířat použitých ve studii se provede celková pitva. Alespoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně, tj. normální a exponovaná kůže, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny, srdce a cílové orgány (orgány s lézemi nebo změnami velikosti), je třeba uchovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření.

U skupiny, které byla aplikována vysoká dávka, a u kontrolní skupiny se provede histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Orgány a tkáně, u nichž se ve skupině s nejvyšší koncentrací objeví poškození způsobená zkoušenou látkou, se podrobí histologickému vyšetření i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat ze satelitní skupiny se provede histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, na kterých byly pozorovány účinky u ostatních exponovaných skupin.

Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou exponovanou skupinu uvede počet zvířat na začátku zkoušky a počet zvířat, která vykazují jednotlivé typy léze.

Všechny výsledky se zhodnotí vhodnou statistickou metodou. Lze použít jakoukoli uznanou statistickou metodu.

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

• údaje o zvířatech (druh, kmen, původ, podmínky chovu, strava atd.),

• zkušební podmínky (včetně typu obvazu: okluzivní nebo neokluzivní),

• úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,

• dávka, při které nedochází k účinkům, pokud je to možné,

• údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávky,

• doba uhynutí během studie, nebo zda zvířata přežila do konce zkoušky,

• toxické a jiné účinky,

• doba pozorování každého neobvyklého příznaku a jeho další vývoj,

• údaje o spotřebě potravy a o tělesné hmotnosti,

• provedená hematologická vyšetření a výsledky,

• provedená klinická biochemická vyšetření a výsledky,

• pitevní nálezy,

• podrobný popis všech histopatologických nálezů,

• statistické zpracování výsledků, kde je to možné,

• diskuse a výsledky,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B (D).

Viz obecný úvod, část B (E).

Tato zkušební metoda je rovnocenná pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 473 (2016). Je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument OECD, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které byly v těchto pokynech ke zkoušení provedeny (1).

Zkouška na chromozómové aberace u savců in vitro má identifikovat chemické látky, které způsobují strukturní chromozómové aberace v kultivovaných buňkách savců (2) (3) (4). Rozlišují se dva typy strukturních aberací: chromozómové a chromatidové. Při zkouškách na chromozómové aberace in vitro by mohla vzniknout polyploidie (včetně endoreduplikace). Aneugenní látky mohou vyvolat polyploidii, avšak z polyploidie samotné nevyplývá aneugenický potenciál a může prostě ukazovat na narušení buněčného cyklu nebo na cytotoxicitu (5). Tato zkouška není určena k měření aneuploidie. K detekci aneuploidie by bylo možné doporučit zkoušku na přítomnost mikrojader in vitro (6).

Ke zkoušce na chromozómové aberace in vitro mohou být použity stabilizované buněčné linie nebo primární buněčné kultury lidského původu nebo pocházející z hlodavců. Použité buňky by měly být vybrány na základě schopnosti růstu v kultuře, stálosti karyotypu (včetně počtu chromozómů) a spontánní četnosti výskytu chromozómových aberací (7). Údaje, které jsou v současné době k dispozici, neumožňují předkládat jednoznačná doporučení, avšak naznačují, že při hodnocení chemické nebezpečnosti je důležité zvážit stav p53, genetickou stálost (stálost karyotypu), reparační schopnost DNA a původ buněk (lidské versus pocházející z hlodavců) vybraných ke zkoušení. Uživatelům této zkušební metody se proto doporučuje, aby při detekování indukce chromozómových aberací zvážili vliv těchto i jiných buněčných charakteristik na vlastnosti buněčné linie.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

Zkoušky prováděné in vitro zpravidla vyžadují použití exogenního zdroje metabolické aktivace, pokud nejsou buňky metabolicky kompetentní s ohledem na zkoušené chemické látky. Systém exogenní metabolické aktivace zcela nenapodobuje podmínky in vivo. Je třeba se zcela vyvarovat podmínek, které by vedly k falešným pozitivním výsledkům, tj. k poškození chromozómů, jež není způsobeno přímou interakcí mezi zkoušenou chemickou látkou a chromozómy; takové podmínky zahrnují změny pH nebo osmolality (8) (9) (10), interakce se složkami média (11) (12) nebo nadměrné úrovně cytotoxicity (13) (14) (15) (16).

Tato zkouška se používá k odhalování chromozómových aberací, jež mohou být výsledkem klastogenního působení. Analýza indukce chromozómových aberací by se měla provádět pomocí buněk v metafázi. Je proto důležité, že buňky by měly dosáhnout mitózy jak v exponovaných, tak v neovlivněných kulturách. Při zkoušení vyráběných nanomateriálů mohou být potřebné určité úpravy metody, které však v této zkušební metodě nejsou popsány.

Před použitím této zkušební metody na směs za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by se mělo zvážit, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.

Buněčné kultury lidského a savčího původu jsou vystaveny zkoušené chemické látce za přítomnosti exogenního zdroje metabolické aktivace i bez něho, pokud ovšem nejsou použity buňky s dostatečnou schopností metabolismu (viz odstavec 13). Ve vhodných předem stanovených intervalech po začátku expozice buněčných kultur zkoušené chemické látce se přidá látka zastavující metafázi (např. colcemid nebo kolchicin), buňky se shromáždí, obarví a u buněk v metafázi je mikroskopicky analyzována přítomnost chromozómových a chromatidových aberací.

Mohou být použity různé buněčné linie (např. vaječník křečka čínského (CHO), plíce křečka čínského V79, plíce křečka čínského (CHL/IU, TK6) nebo primární buněčné kultury včetně lymfocytů periferní krve člověka nebo jiných savců (7). Volba buněčných linií by měla být odborně zdůvodněna. Použijí-li se primární buňky, mělo by se vzhledem k ochraně pokusných zvířat, tam, kde je to možné, zvážit použití primárních buněk lidského původu. V takovém případě se odběr vzorků provede v souladu s etickými zásadami a předpisy platnými pro člověka. Lymfocyty periferní krve člověka by měly být získány od mladých (přibližně ve věku 18–35 let) nekuřáků, o nichž není známo, že by trpěli nemocemi nebo že by byli nedávno vystaveni genotoxickým činitelům (např. chemickým látkám, ionizujícímu záření) na úrovních, které by mohly zvýšit spontánní výskyt chromozómových aberací. Tím by se mělo zajistit, že spontánní výskyt chromozómových aberací bude nízký a stálý. Spontánní výskyt chromozómových aberací se s věkem zvyšuje a tento trend je více patrný u žen než u mužů (17) (18). Pokud se společně používají buňky pocházející od více než jednoho dárce, měl by být počet dárců uveden. Je nezbytné prokázat, že buňky se dělily od počátku ošetření zkoušenou chemickou látkou až do odběru buněk k analýze. Buněčné kultury jsou udržovány ve fázi exponenciálního růstu buněk (buněčné linie) nebo jsou stimulovány k dělení (primární kultury lymfocytů), aby bylo možné exponovat buňky v různých stadiích buněčného cyklu, protože citlivost stadií na zkoušené chemické látky nemusí být známa. Primární buňky, které k dělení potřebují stimulaci mitogenními látkami, během expozice zkoušené chemické látce již zpravidla nejsou dále synchronizovány (např. lidské lymfocyty po 48hodinové mitogenní stimulaci). Použití synchronizovaných buněk v průběhu expozice se nedoporučuje, avšak lze je akceptovat v odůvodněných případech.

Pro udržování kultur by mělo být použito vhodné kultivační médium a inkubační podmínky (kultivační nádoby, případně zvlhčená atmosféra s 5 % CO₂, inkubační teplota 37 °C). U buněčných linií by se měla pravidelně kontrolovat stabilita modální hodnoty počtu chromozómů a mělo by se zjišťovat, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty (7) (19). Pokud jsou kultury kontaminované nebo se modální hodnota počtu chromozómů změnila, neměly by se dotyčné kultury používat. Pro buněčné linie nebo primární kultury použité ve zkušební laboratoři by měla být stanovena normální délka buněčného cyklu, která by měla být v souladu s buněčnými charakteristikami uvedenými v literatuře (20).

Buněčné linie: buňky se pomnoží z kmenových kultur, nasadí se do kultivačního média v takové hustotě, aby u buněk v suspenzích nebo v monovrstvách pokračoval exponenciální růst až do sběru buněk (např. mělo by se zamezit konfluenci u buněk rostoucích v monovrstvách).

Lymfocyty: krev ošetřená antikoagulantem (např. heparinem) nebo oddělené lymfocyty se kultivují (např. po dobu 48 hodin u lidských lymfocytů) za přítomnosti mitogenu [např. fytohemaglutinin (PHA) u lidských lymfocytů], aby se indukovalo dělení buněk před expozicí zkoušené chemické látce.

Při použití buněk, které mají nedostatečnou endogenní metabolickou schopnost, by se měly použít exogenní metabolizující systémy. Nejčastěji používaným systémem, který je standardně doporučován, pokud není zdůvodněno použití jiného systému, je postmitochondriální frakce (S9) doplněná kofaktory. Tato frakce se připravuje z jater hlodavců (zpravidla potkanů) exponovaných látkami indukujícími enzymy, jako je Aroclor 1254 (21) (22) (23) nebo kombinace fenobarbitalu a β-naftoflavonu (24) (25) (26) (27) (28) (29). Posledně jmenovaná kombinace není v rozporu se Stockholmskou úmluvou o perzistentních organických znečišťujících látkách (30) a bylo prokázáno, že je stejně účinná jako Aroclor 1254 pro indukování oxidáz se smíšenou funkcí (24) (25) (26) (28). Frakce S9 je v konečném testovacím médiu obvykle používána v koncentracích od 1 % do 2 % obj., ale koncentraci je možné zvýšit až na 10 %. V průběhu aplikace by se neměly používat látky, jež snižují mitotický index, zejména látky, které tvoří komplexy s vápníkem (31). Volbu typu a koncentrace systému exogenní metabolické aktivace nebo metabolického induktoru, který se použije, je třeba provádět s ohledem na typ zkoušených chemických látek

Pevné zkoušené chemické látky by měly být před aplikací na buňky rozpuštěny ve vhodných rozpouštědlech a popřípadě zředěny (viz odstavec 23). Kapalné zkoušené látky mohou být přidány přímo k testovacímu systému a/nebo mohou být před aplikací zředěny. Plynné a těkavé zkoušené chemické látky by se měly zkoušet za použití vhodně upravených standardních protokolů, například prostřednictvím ošetření buněk v neprodyšně uzavřených kultivačních nádobách (32) (33) (34). Zkoušená chemická látka by měla být připravena bezprostředně před aplikací, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

Rozpouštědlo by mělo být zvoleno tak, aby optimalizovalo rozpustnost zkoušené chemické látky, aniž by nepříznivě ovlivnilo provádění zkoušky, např. měnilo růst buněk, ovlivňovalo integritu zkoušené chemické látky, reagovalo s kultivačními nádobami, narušovalo systém metabolické aktivace. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodného rozpouštědla (nebo kultivačního média). Dobře zavedenými rozpouštědly jsou například voda nebo dimethylsulfoxid. Podíl organických rozpouštědel by zpravidla neměl být větší než 1 % obj. a podíl vodných rozpouštědel (fyziologického roztoku nebo vody) v konečném expozičním médiu by neměl být větší než 10 % obj. Použijí-li se jiná než dobře zavedená rozpouštědla (např. ethanol nebo aceton), mělo by být jejich použití podloženo údaji o jejich kompatibilitě se zkoušenou chemickou látkou a zkušebním systémem a o tom, že nejsou v použité koncentraci genotoxické. Pokud takové podpůrné údaje neexistují, je důležité zařadit neexponované kontroly (viz dodatek 1) prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné škodlivé nebo klastogenní účinky.

Při stanovení nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky by neměly být použity koncentrace, které jsou schopny vyvolat falešnou pozitivní odpověď, jako např. koncentrace, jež vyvolávají nadměrnou cytotoxicitu (viz odstavec 22), srážení kultivačního média (viz odstavec 23) nebo zřetelné změny pH nebo osmolality (viz odstavec 5). Pokud zkoušená chemická látka v době jejího přidání způsobuje zřetelnou změnu hodnoty pH média, pH může být upraveno pufrováním konečného expozičního média tak, aby nedošlo k falešným pozitivním výsledkům a aby byly zachovány vhodné kultivační podmínky.

Provádí se měření buněčné proliferace, aby bylo zajištěno, že dostatečný počet ošetřených buněk prodělal během zkoušky mitózu a že expozice je prováděna při vhodných úrovních cytotoxicity (viz odstavce 18 a 22). Cytotoxicita by měla být stanovena v hlavním experimentu s metabolickou aktivací a bez ní za použití vhodných indikátorů buněčné smrti a růstu. Hodnocení cytotoxicity při předběžné zkoušce může být užitečné a může napomoci k lepšímu určení koncentrací, jež mají být použity při hlavní zkoušce, avšak předběžná zkouška není povinná. Pokud se provede, nemůže nahradit měření cytotoxicity při hlavním experimentu.

Vhodnými metodami pro posouzení cytotoxicity v cytogenetických zkouškách jsou relativní zdvojnásobení populace (RPD) nebo relativní nárůst počtu buněk (RICC) (13) (15) (35) (36) (55) (příslušné vzorce viz dodatek 2). V případě dlouhodobé expozice a dobách odběru delších než 1,5násobek normální délky buněčného cyklu po zahájení zkoušky (tj. celkově delších než trojnásobek délky buněčného cyklu) by použití RPD mohlo vést k podhodnocení cytotoxicity (37). Za těchto okolností měření RICC může být lepším ukazatelem nebo v případě použití RPD by hodnocení cytotoxicity po 1,5násobku normální délky buněčného cyklu mohlo být užitečné.

U lymfocytů v primárních kulturách je mírou cytotoxických/cytostatických účinků mitotický index (MI), avšak ten je ovlivněn tím, po jaké době od expozice se měří, použitým mitogenem a možným narušením buněčného cyklu. MI je však přijatelný, protože jiné metody stanovení cytotoxicity mohou být obtížné a nepraktické a nemusí platit pro cílovou populaci lymfocytů rostoucích v reakci na stimulaci pomocí PHA.

Ačkoli doporučenými parametry cytotoxicity jsou pro buněčné linie RICC a RPD a pro primární kulturu lymfocytů MI, mohly by další užitečné informace poskytnout i jiné ukazatele (např. integrita buněk, apoptóza, nekróza, buněčný cyklus).

Měly by se vyhodnotit nejméně tři zkušební koncentrace (nepočítaje v to kontroly s rozpouštědlem a pozitivní kontroly), které splňují kritéria přijatelnosti (vhodná cytotoxicita, počet buněk atd.). Bez ohledu na typy buněk (buněčné linie nebo primární kultury lymfocytů) mohou být pro každou zkušební koncentraci použity buď jednotlivé exponované kultury nebo replikáty.I když je doporučováno použití duplicitních kultur, jednu kulturu lze rovněž akceptovat za předpokladu, že v této jediné kultuře je hodnocen stejný celkový počet buněk jako v duplicitních kulturách. Použití jedné kultury je opodstatněné zejména v případě, že jsou posuzovány více než 3 koncentrace (viz odstavec 31). Výsledky získané z duplicitních nezávislých kultur při dané koncentraci lze pro účely analýzy údajů sloučit (38). U zkoušených látek, jež vykazují malou cytotoxicitu nebo nevykazují žádnou cytotoxicitu, budou obvykle vhodné přibližně dvojnásobné až trojnásobné intervaly koncentrací. V případě cytotoxicity by měly zvolené zkušební koncentrace pokrývat rozpětí od koncentrace vyvolávající cytotoxicitu, jak je popsáno v odstavci 22, po koncentrace, při nichž dochází ke střední a nízké cytotoxicitě nebo nedochází k žádné cytotoxicitě. Mnohé zkoušené chemické látky vykazují strmé křivky závislosti odezvy na koncentraci, a aby bylo možné získat údaje při nízké a střední cytotoxicitě nebo podrobně studovat závislost účinku na dávce, může být nezbytné zvolit menší rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a/nebo více než tři koncentrace (ať už pro jednu kulturu, nebo replikáty), zejména v případě kdy je požadován opakovaný experiment (viz odstavec 47).

Je-li maximální koncentrace odvozena od cytotoxicity, měla by být nejvyšší koncentrace zvolena tak, aby se dosáhlo 55 ± 5 % cytotoxicity za použití doporučených parametrů cytotoxicity (tj. snížení RICC a RPD u buněčných linií a snížení MI u primárních kultur lymfocytů na 45 ± 5 % u souběžné negativní kontroly). Je třeba dbát na to, aby byly interpretovány pouze ty pozitivní výsledky, které jsou vykazovány při vyšší hranici tohoto rozmezí cytotoxicity 55 ± 5 % (13).

V případě špatně rozpustných zkoušených chemických látek, které nejsou cytotoxické při koncentracích nižších, než je jejich rozpustnost, by nejvyšší analyzovaná koncentrace měla na konci expozice zkoušené chemické látce vyvolat zákal nebo sraženinu viditelnou pouhým okem nebo pomocí inverzního mikroskopu. Dokonce i v případech, kdy k výskytu cytotoxicity dochází při koncentracích vyšších, než je rozpustnost, se doporučuje testovat pouze při jedné koncentraci vyvolávající zákal nebo viditelné sraženiny, neboť sraženina může vést k falešným účinkům. Při koncentraci, kdy vzniká sraženina, je třeba dbát na to, aby sraženina nemohla ovlivňovat provádění zkoušky (např. barvení nebo hodnocení). Užitečné může být stanovit rozpustnost v kultivačním médiu před pokusem.

Není-li pozorována sraženina nebo omezení cytotoxicity, měla by nejvyšší zkušební koncentrace odpovídat 10 mM, 2 mg/ml nebo 2 μl/ml, podle toho, která z uvedených hodnot je nejnižší (39) (40) (41). Pokud u zkoušené chemické látky není stanoveno její složení, např. u látek s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexních reakčních produktů nebo biologického materiálu (UVCB) (42), přírodního extraktu atd., může v případě nízké cytotoxicity být horní koncentrace vyšší (např. 5 mg/ml), aby se zvýšila koncentrace každé ze složek. Je však třeba poznamenat, že u humánních léčivých přípravků se tyto požadavky mohou lišit (43).

Pro každý časový interval sběru buněk by měly být použity souběžné negativní kontroly (viz odstavec 15) skládající se ze samotného rozpouštědla v kultivačním médiu a zpracované stejným způsobem jako exponované kultury.

Souběžné pozitivní kontroly jsou nutné pro prokázání schopnosti laboratoře identifikovat klastogeny za daných experimentálních podmínek a pro prokázání účinnosti exogenního systému metabolické aktivace, všude kde je to možné. Příklady pozitivních kontrol jsou uvedeny v tabulce 1 níže. V odůvodněných případech mohou být použity jiné pozitivní kontrolní chemické látky. Jelikož zkoušky na buňkách savců in vitro za účelem stanovení genetické toxicity jsou dostatečně standardizované, může se použití pozitivních kontrol omezit na experimenty s kontrolními klastogeny vyžadujícími metabolickou aktivaci. Pokud je provedena souběžně se zkouškou bez aktivace se stejnou dobou trvání expozice, tato jediná odpověď v pozitivní kontrole prokáže činnost metabolického aktivačního systému a citlivost testovacího systému. Dlouhodobá expozice (bez S9) by však měla mít svou vlastní pozitivní kontrolu, protože doba trvání expozice bude odlišná než při zkoušce za použití metabolické aktivace. Každá pozitivní kontrola by měla být použita při jedné nebo více koncentracích, u nichž se očekává, že poskytnou reprodukovatelný a detekovatelný nárůst oproti pozadí, čímž se prokáže citlivost testovacího systému (tj. aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo identita kódovaného preparátu), a reakce by neměla být narušena cytotoxicitou přesahující limitní hodnoty stanovené ve zkušební metodě.

Tabulka 1. Referenční chemické látky doporučené pro posouzení způsobilosti laboratoře a pro výběr pozitivních kontrol.

Proliferující buňky se vystaví zkoušené chemické látce jak za přítomnosti metabolického aktivačního systému, tak bez něho.

Pro důkladné hodnocení, které by bylo zapotřebí pro vyvození závěru o negativním výsledku, by měly být splněny všechny tři následující zkušební podmínky za použití krátkodobé expozice s metabolickou aktivací a bez ní a dlouhodobé expozice bez metabolické aktivace (viz odstavce 43, 44 a 45):

• buňky by měly být vystaveny zkoušené chemické látce bez metabolické aktivace na dobu 3–6 hodin a měly by být odebrány po takové době od zahájení aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (18),

• buňky by měly být vystaveny zkoušené chemické látce s metabolickou aktivací na dobu 3–6 hodin a měly by být odebrány po takové době od zahájení aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (18),

• buňky by měly být vystaveny nepřetržité expozicí bez metabolické aktivace až do odběru v době, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu. Určité chemické látky (např. analogy nukleosidů) lze snáze detekovat při dobách aplikace nebo odběru delších než 1,5násobek délky cyklu (24).

V případě, že kterékoli z výše uvedených experimentálních uspořádání vedlo k pozitivní odpovědi, nebude nutné zkoumat kterýkoli z ostatních režimů aplikace.

Do buněčné kultury se obvykle 1–3 hodiny před ukončení kultivace přidá colcemid nebo kolchicin. Pro přípravu preparátů pro analýzu chromozómů se každá buněčná kultura zpracovává zvlášť. Příprava preparátů pro analýzu chromozómů zahrnuje hypotonizaci buněk, fixaci a obarvení buněk. Na konci doby expozice v trvání 3–6 hodin se v monovrstvách mohou vyskytovat mitotické buňky (které se vyznačují okrouhlým tvarem a odchlipováním od povrchu). Jelikož lze tyto mitotické buňky snadno oddělit, mohou být při odstranění média obsahujícího zkoušenou chemickou látku ztraceny. Pokud v době sběru buněk existují důkazy podstatného nárůstu počtu mitotických buněk v porovnání s kontrolami, což pravděpodobně ukazuje na zastavení mitózy, pak by buňky měly být odebrány odstředěním a přidány zpět do kultur, aby se zabránilo ztrátě buněk, u nichž probíhá mitóza a mohou zde vznikat chromozómové aberace.

Všechny preparáty, včetně pozitivních a negativních kontrol, by měly být před mikroskopickou analýzou chromozómových aberací nezávisle kódovány. Poněvadž při fixaci u částu buněk v metafázi často dochází ke ztrátě chromozómů, měly by tudíž vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu rovném modální hodnotě +/- 2.

Aby bylo možno vyhodnotit zkoušenou chemickou látku jako jasně negativní, u každé koncentrace a kontroly by mělo být hodnoceno alespoň 300 dobře rozprostřených metafází. Jsou-li využívány k replikám, mělo by být těchto 300 buněk rovnoměrně rozděleno mezi tyto kultury. Pokud je pro každou koncentraci použita jediná kultura (viz odstavec 21), mělo by být hodnoceno alespoň 300 dobře rozprostřených metafází v této jedné kultuře. Hodnocení 300 buněk má tu výhodu, že se zvyšuje statistická síla zkoušky a navíc budou zřídka pozorovány nulové hodnoty (předpokládá se, že pouze u 5 % buněk) (44). Počet hodnocených metafází lze snížit, je-li pozorován velký počet chromozómových aberací a zkoušená chemická látka je považována za jasně pozitivní.

Měly by být hodnoceny buňky se strukturními chromozómovými aberacemi včetně gapů a s vyloučením gapů. Zlomy a gapy jsou definovány v Dodatku 1 podle (45) (46). Chromatidové a chromozómové aberace by měly být zaznamenávány odděleně a klasifikovány podle podtypů (zlomy, výměny). Postupy používané v laboratoři by měly zajistit, aby analýzu chromozómových aberací prováděli dobře odborně připravení hodnotitelé a aby tato analýza byla případně podrobena odborné revizi.

Ačkoli je účelem zkoušky detekovat strukturní chromozómové aberace, je důležité zaznamenat četnost výskytu polyploidií a endoreduplikací, jsou-li tyto jevy pozorovány (viz odstavec 2).

Aby laboratoř prokázala dostatečnou zkušenost s testem před rutinním použitím, měla by provést sérii experimentů s referenčními pozitivními chemickými látkami, jež působí prostřednictvím různých mechanismů, a s různými negativními kontrolami (s použitím různých rozpouštědel/vehikul). Odpovědi těchto pozitivních a negativních kontrol by měly být v souladu s odbornou literaturou. Toto se nepoužije na laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají k dispozici databázi historických údajů, jak je definována v odstavci 37.

U vybraných pozitivních chemických látek (viz tabulka 1 v odstavci 26) by měla být testována krátká a dlouhá expozice za nepřítomnosti metabolické aktivace a rovněž krátká expozice za přítomnosti metabolické aktivace, aby byla prokázána způsobilost pro detekci klastogenních chemických látek a stanovení účinnosti systému metabolické aktivace. Rozsah koncentrací by u vybraných chemických látek měl být zvolen tak, aby poskytl opakovatelná zvýšení účinku v jednotlivých koncentracích ve srovnání s úrovní pozadí, aby se tak prokázala citlivost a dynamické rozpětí testovacího systému.

Laboratoř by měla stanovit:

• historické rozmezí a distribuci pozitivních kontrolních účinků,

• historické rozmezí a distribuci negativních kontrolních účinků (neexponovaných kultur, s rozpouštědlem).

Při prvním získávání údajů o historické distribuci negativních kontrol by měly být výsledky provedených negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji, pokud existují. S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by aktuální negativní kontroly v ideálním případě spadat do 95 % rozmezí této distribuce (44) (47). Historická databáze negativních kontrol dané laboratoře by měla být vytvořena na základě nejméně 10 experimentů, nejlépe však by měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek. V laboratořích by měly být uplatňovány metody řízení jakosti, jako např. kontrolní diagramy (např.C-charts nebo X-bar charts (48)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje o pozitivních a negativních kontrolách a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“ (44). Další doporučení, jak získat a používat historické údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (47).

Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich souladu se stávajícími historickými kontrolními databázemi laboratoře. Jakýkoli větší změna by měla vést k zavedení nové historické kontrolní databáze.

Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat výskyt buněk s chromozómovými aberacemi z jedné kultury nebo ze souhrnu replikovaných kultur, jak je popsáno v odstavci 21. Výsledky aktuálních negativních kontrol by v ideálním případě měly spadat do 95 % rozmezí distribuce v historické databázi negativních kontrol laboratoře (44) (47). Pokud jsou údaje z aktuálních negativních kontrol mimo 95 % rozmezí, může být přijatelné je zahrnout do dosavadní distribuce kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existuje důkaz o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz odstavec 37), a důkaz o tom, že nedošlo k technické nebo lidské chybě.

Měl by se vyhodnotit procentuální podíl buněk se strukturními chromozómovými aberacemi. Chromatidové a chromozómové aberace klasifikované podle podtypů (zlomy, výměny) by měly být uvedeny odděleně spolu s jejich počty a četností v experimentálních a kontrolních kulturách. Gapy se zaznamenávají a uvádějí odděleně, ale nezahrnují se do celkové četnosti výskytu aberací. Zaznamená se procentuální podíl polyploidie a/nebo endoreduplikovaných buněk, pokud jsou pozorovány.

Měly by být zaznamenány výsledky souběžného stanovení cytotoxicity u všech exponovaných kultur a negativních a pozitivních kontrolních kultur v hlavních experimentech pro hodnocení aberací.

Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé kultury. Všechny údaje by měly být shrnuty ve formě tabulek.

Přijetí zkoušky je založeno na následujících kritériích:

• souběžná negativní kontrola je považována za přijatelnou pro přidání do historické databáze negativních kontrol laboratoře, jak je popsáno v odstavci 39,

• souběžné pozitivní kontroly (viz odstavec 26) by měly vyvolat odpovědi, které jsou slučitelné s odpověďmi uvedenými v historické databázi pozitivních kontrol, a měly by vyvolat statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou,

• měla by být splněna kritéria buněčné proliferace při kontrole s rozpouštědlem (odstavce 17 a 18),

• test je proveden za všech tří popsaných experimentálních uspořádání, pokud jedno z nich nevedlo k pozitivním výsledkům (viz odstavec 28),

• je analyzovatelný adekvátní počet buněk a koncentrací (odstavce 31 a 21),

• kritéria pro výběr nejvyšší koncentrace jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 22, 23 a 24.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud v některé ze zkoumaných experimentálních uspořádání (viz odstavec 28):

• a) alespoň jedna ze zkušebních koncentrací vykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou;
• b) pokud je prokázána závislost účinku na dávce pomocí vhodného statistického trend-testu;
• c) pokud kterýkoli z výsledků je mimo distribuci historických údajů o negativních kontrolách (např. 95 % kontrolních limitů dle Poissonova rozdělení; viz odstavec 39).

Jsou-li splněna všechna tato kritéria, má se za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat chromozómové aberace v kultivovaných savčích buňkách v tomto testovacím systému. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (49) (50) (51).

Za předpokladu, že byla splněna všechna kritéria přijatelnosti, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně negativní, pokud za všech zkoumaných experimentálních uspořádání (viz odstavec 28):

• a) žádná ze zkušebních koncentrací nevykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou;
• b) hodnocení pomocí vhodného statistického trend-testu ukáže, že nedochází k nárůstu účinku v závislosti na koncentraci;
• c) všechny výsledky spadají do rámce distribuce historických údajů o negativních kontrolách (např. 95 % kontrolních limitů dle Poissonova rozdělení; viz odstavec 39).

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka není schopna vyvolávat chromozómové aberace v kultivovaných savčích buňkách v tomto testovacím systému.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odpovědi se nepožaduje.

V případě, že odpověď není ani jasně negativní, ani jasně pozitivní, jak je popsáno výše, nebo s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku, by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším šetřením. Užitečné by mohlo být hodnocení většího počtu buněk (je-li vhodné) nebo provedení opakovaného experimentu, případně s použitím upravených zkušebních podmínek (např. rozsah koncentrací, jiné podmínky metabolické aktivace (např. koncentrace S9 nebo původu S9)).

V ojedinělých případech dokonce ani po dalším šetření nebude možné na základě daného souboru údajů učinit závěr, zda jsou výsledky pozitivní či negativní, a proto bude učiněn závěr, že odpověď na zkoumanou chemickou látku je neurčitá.

Nárůst počtu polyploidních buněk může znamenat, že zkoušená chemická látka má schopnost potlačit mitotické procesy a indukovat numerické chromozómové aberace (52). Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozómy může znamenat, že zkoušené chemické látky mají schopnost potlačit progresi buněčného cyklu (53) (54) (viz odstavec 2). Výskyt polyploidních buněk a buněk s endoreduplikovanými chromozómy by se proto měl zaznamenat odděleně.

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

• Zkoušená chemická látka:

  • zdroj, číslo šarže a je-li k dispozici, datum použitelnosti,

  • stabilita zkoušené chemické látky samotné, je-li známa,

  • rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle, je-li známa,

  • měření pH, případně osmolality a sraženiny v kultivačním médiu, do něhož byla přidána zkoušená chemická látka.

• Jednosložková látka:

  • fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti,

  • chemická identifikace, jako např. název IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChl, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné, atd.

• Vícesložková látka, UVCB a směsi:

  • charakterizovaná v co možná největší míře chemickou identitou (viz výše), kvantitativním zastoupením a důležitými fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek.

• Rozpouštědlo:

  • zdůvodnění volby rozpouštědla,

  • měl by se též uvést procentuální podíl rozpouštědla v konečném kultivačním médiu.

• Buňky:

  • typ a zdroj buněk,

  • vlastnosti karyotypu a vhodnost použitého typu buněk,

  • nepřítomnost mykoplasmat v případě buněčných linií,

  • u buněčných linií informace o délce buněčného cyklu, době zdvojnásobení nebo proliferační index,

  • pohlaví dárců krve, věk a další důležité informace o dárci, zda byla použita plná krev nebo separované lymfocyty, použitý mitogen,

  • případně počet pasáží v případě buněčných linií,

  • metody udržování buněčných kultur v případě buněčných linií,

  • modální hodnota počtu chromozómů v případě buněčných linií.

• Zkušební podmínky:

  • identifikace chemické látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka expozice buněk,

  • koncentrace zkoušené chemické látky vyjádřená jako konečná koncentrace v kultivačním médiu (např. v μg nebo mg/ml nebo mM kultivačního média),

  • odůvodnění výběru koncentrací a počtu kultur, včetně např. údajů o cytotoxicitě a mezích rozpustnosti,

  • složení média, případně koncentrace CO₂, vlhkost,

  • koncentrace (a/nebo objem) rozpouštědla a zkoumané chemické látky přidaných do kultivačního média,

  • inkubační teplota,

  • inkubační doba,

  • délka expozice,

  • doba od expozice do odběru buněk k vyhodnocení,

  • případně hustota buněk při nasazení,

  • typ a složení použitého metabolického aktivačního systému (zdroj S9, metoda přípravy směsi S9, koncentrace nebo objem směsi S9 a S9 v konečném kultivačním médiu, kontroly jakosti S9),

  • chemické látky použité v pozitivních a negativních kontrolách, konečné koncentrace pro jednotlivé podmínky expozice,

  • metody přípravy preparátů a použitý postup barvení,

  • kritéria přijatelnosti zkoušek,

  • kritéria hodnocení aberací,

  • počet analyzovaných metafází,

  • metody měření cytotoxicity,

  • jakékoli doplňkové informace týkající se cytotoxicity a použité metody,

  • kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou,

  • metody použité ke stanovení pH, osmolality a sraženiny.

• Výsledky:

  • počet exponovaných buněk a počet sklizených buněk v každé kultuře, jestliže byly použity buněčné linie,

  • měření cytotoxicity, např. RPD, RICC, MI, případná další pozorování, existují-li,

  • v případě buněčných linií informace o délce buněčného cyklu, době zdvojnásobení nebo proliferační index,

  • známky srážení a doba k jejich stanovení,

  • definice aberací, včetně gapů,

  • počet hodnocených buněk, počet buněk s chromozómovými aberacemi a typy chromozómových aberací zvlášť pro každou exponovanou a kontrolní kulturu, včetně gapů a s vyloučením gapů,

  • změny ploidie (polyploidní buňky a buňky s endoreduplikovanými chromozómy, uvedené odděleně), byly-li pozorovány,

  • pokud možno závislost odezvy na koncentraci,

  • údaje o souběžné negativní (rozpouštědlo) a pozitivní kontrole (s koncentracemi a rozpouštědly),

  • historické údaje o negativních (rozpouštědlo) a pozitivních kontrolách, s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami a 95 % rozpětím distribuci, stejně jako počet údajů,

  • statistické analýzy, případné p hodnoty.

• Rozbor výsledků.

• Závěry.

• 1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
• 2) Evans, H.J. (1976), „Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens“, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, s. 1-29.
• 3) Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), „The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture“ in Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, s. 427-432.
• 4) Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, s. 1-175.
• 5) Muehlbauer, P.A. et al. (2008), „Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, s. 318-327.
• 6) Kapitola B.49 této přílohy: Zkouška na přítomnost mikrojader v buňkách savců in vitro.
• 7) ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.
• 8) Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, s. 147-204.
• 9) Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, s. 297-305.
• 10) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, s. 789-886.
• 11) Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, s. 177-183.
• 12) Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, s. 439-452.
• 13) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, s. 191-201.
• 14) Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, s. 1-256.
• 15) Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, s. 36-44.
• 16) Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, s. 316-326.
• 17) Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, s. 305-309.
• 18) Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, s. 95-106.
• 19) Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, s. 261-287.
• 20) Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, s.163-167.
• 21) Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, s. 347-363.
• 22) Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3–4, s. 173-215.
• 23) Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, s. 83-90.
• 24) Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, s. 277-290.
• 25) Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, s. 55–65.
• 26) Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, s. 175-177.
• 27) Matsushima, T. et al. (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, s. 85-88.
• 28) Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, s. 241-261.
• 29) Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, s. 51-59.
• 30) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). K dispozici na: http://www.pops.int/.
• 31) Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, s. 225-8.
• 32) Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, s. 91-103.
• 33) Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, s. 795-801.
• 34) Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, s. 122-130.
• 35) Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, s. 1-3.
• 36) Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 77-83.
• 37) Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1–2, s. 86–87.
• 38) Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141-154.
• 39) OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. K dispozici na vyžádání.
• 40) Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1–2, s. 32-56.
• 41) Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, s. 36-43.
• 42) EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
• 43) USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. K dispozici na adrese: https://federalregister.gov/a/2012-13774.
• 44) OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS)“, Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
• 45) ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.
• 46) Scott, D. et al. (1990), „Metaphase chromosome aberration assays in vitro“, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 62-86.
• 47) Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, s. 87-90.
• 48) Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.
• 49) Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.
• 50) Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, s. 1-175.
• 51) Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 141-154.
• 52) Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, s. 29-46.
• 53) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, s. 403-413.
• 54) Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, s. 1362-1364.

Doporučuje se použít relativní nárůst počtu buněk (RICC = Relative Increase in Cell Counts) nebo relativní zdvojnásobení populace (RPD = Relative Population Doubling), jelikož oba tyto ukazatele zohledňují poměr buněčné populace, která se rozdělila.

kde:

Zdvojnásobení populace = [log (počet buněk po expozici ÷ počáteční počet buněk)] ÷ log 2.

Například hodnota 53 % RICC nebo RPD označuje 47 % cytotoxicity/cytostáze a 55 % cytotoxicity/cytostáze měřené pomocí MI znamená, že skutečný MI je 45 % kontroly.

V každém případě by měl být změřen počet buněk před expozicí a počet buněk v exponované kultuře a v negativní kontrolní kultuře.

V minulosti byl jako parametr cytotoxicity užíván RCC (tj. počet buněk v exponovaných kulturách / počet buněk v kontrolních kulturách), nyní se již nedoporučuje, protože může cytotoxicitu podhodnotit.

V negativních kontrolních kulturách by mělo být zdvojnásobení populace slučitelné s požadavkem na odběr buněk po takové době od aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu, a mitotický index by měl být natolik vyšší, aby se získal dostatečný počet buněk v mitóze a aby bylo možné spolehlivě vypočítat snížení o 50 %.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 475 (2016). Je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument OECD, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které byly v těchto pokynech ke zkoušení provedeny (1).

Zkouška na chromozómové aberace v buňkách kostní dřeně savců in vivo je zvláště významná k posouzení genotoxicity, neboť zde probíhá aktivní metabolismus in vivo, farmakokinetika a procesy reparace DNA, které přispívají k účinku testované látky, jakkoli mohou být různé u různých druhů. Zkouška in vivo je rovněž užitečná pro další výzkum genotoxicity zjištěné v systémech in vitro.

Zkouška na chromozómové aberace u savců in vivo je používána pro detekci strukturních chromozómových aberací indukovaných zkoušenou chemickou látkou v buňkách kostní dřeně savců, obvykle hlodavců (2) (3) (4) (5). Rozlišují se dva typy strukturních aberací – chromozómové a chromatidové. U většiny genotoxických chemických látek jsou indukované aberace chromatidového typu, avšak chromozómové aberace se rovněž vyskytují. Poškození chromozómů a související jevy jsou příčinou mnoha geneticky podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho důkazů o tom, že pokud tyto léze a související jevy způsobují změny v onkogenech a v tumor-supresorových genech, mají podíl na indukci rakoviny u člověka a v experimentálních systémech. Při zkouškách na chromozómové aberace in vivo mohou vznikat polyploidie (včetně endoreduplikací). Z nárůstu polyploidie samotné však nevyplývá aneugenický potenciál a může prostě ukazovat na narušení buněčného cyklu nebo na cytotoxicitu. Tato zkouška není určena k detekci aneuploidie. Pro detekci aneuploidie in vivo a in vitro lze doporučit mikronukleus test v savčích erytrocytech in vivo (kapitola B.12 této přílohy) nebo zkoušku in vitro na přítomnost mikrojader v buňkách savců (kapitola B.49 této přílohy).

Definice použitých termínů jsou uvedeny v dodatku 1.

Při této zkoušce jsou běžně používáni hlodavci, avšak v některých případech, je-li to vědecky zdůvodněno, mohou být vhodné i jiné druhy. Cílovou tkání je v této zkoušce kostní dřeň, poněvadž je vysoce vaskularizovanou tkání a obsahuje populaci buněk s rychlým cyklem, které se snadno izolují a zpracovávají. Vědecké zdůvodnění použití jiných druhů než potkanů a myší by mělo být uvedeno ve zprávě. Jsou-li použity jiné druhy než hlodavci, doporučuje se detekci chromozómových aberací v buňkách kostní dřeně začlenit do jiné vhodné zkoušky toxicity.

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená chemická látka (chemické látky) nebo reaktivní metabolit (metabolity) nedostanou do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.

Před použitím této zkušební metody na směs za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by se mělo zvážit, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.

Zvířata se vhodným způsobem vystaví zkoušené chemické látce a ve vhodném okamžiku po expozici se humánně utratí. Před utracením se zvířatům podá látka zastavující metafázi (např. kolchicin nebo colcemid). Z buněk kostní dřeně se poté připraví preparáty chromozómů, obarví se a analyzují se chromozómové aberace buněk v metafázi.

Aby bylo možné před zahájením rutinního zkoušení zjistit, zda laboratoř má s danou zkouškou dostatečné zkušenosti, měla by prokázat schopnost reprodukovat očekávané výsledky z publikovaných údajů (např. (6)), pokud jde o četnost chromozómových aberací, nejméně se dvěma pozitivními kontrolními chemickými látkami (včetně slabých reakcí indukovaných nízkými dávkami u pozitivních kontrol), např. látkami uvedenými v tabulce 1, a s kontrolami s kompatibilním vehikulem/rozpouštědlem (viz odstavec 22). Při těchto experimentech by se měly používat dávky, jež poskytují reprodukovatelné nárůsty v závislosti na dávce, a měly by prokázat citlivost a dynamické rozpětí zkušebního systému ve sledované tkáni (kostní dřeň) za použití hodnotící metody, jež má být v laboratoři uplatňována. Tento požadavek neplatí pro laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají dostupnou databázi historických údajů, jak je definována v odstavcích 10–14.

V průběhu šetření způsobilosti by laboratoř měla stanovit:

• historické rozmezí a distribuci pozitivních kontrolních účinků a

• historické rozmezí a distribuci negativních kontrolních účinků.

Při prvním získávání údajů o dosavadní distribuci negativních kontrol by měly být výsledky provedených negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji, pokud existují. S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by souběžné negativní kontroly v ideálním případě spadat do 95 % rozmezí této distribuce. Historická databáze negativních kontrol laboratoře by měla být statisticky robustní, aby byla zajištěna schopnost laboratoře posuzovat distribuci svých údajů o negativních kontrolách. V literatuře se doporučuje, že nezbytným minimem může být 10 experimentů, nejlépe však by databáze měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek. V laboratořích by měly být uplatňovány metody řízení jakosti, jako např. kontrolní diagramy (např.C-charts nebo X-bar charts (7)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“. Další doporučení, jak získat a používat dosavadní údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (8).

Pokud laboratoř neprovedla dostatečný počet experimentů, aby mohla během ověření šetření způsobilosti (popsaného v odstavci 9) stanovit statisticky robustní distribuci negativních kontrol (viz odstavec 11), je přijatelné, aby distribuce byla stanovena během prvních rutinních zkoušek. Uplatňování tohoto přístupu by mělo vycházet z doporučení uvedených v literatuře (8) a výsledky negativních kontrol získané při těchto experimentech by měly zůstat v souladu s publikovanými údaji o negativních kontrolách.

Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich dopadu na výsledné údaje tak, aby zůstaly v souladu se stávající historickou kontrolní databází laboratoře. Pouze případy větších rozdílů ve zkušebním protokolu by měly vést k zavedení nové historické kontrolní databáze, přičemž její odlišnost od dřívější distribuce se stanoví na základě odborného posouzení (viz odstavec 11). V průběhu opětovného stanovení nemusí být k provedení aktuální zkoušky nutná úplná databáze negativních kontrol, pokud laboratoř prokáže, že hodnoty jejích souběžných negativních kontrol zůstávají v souladu s její předchozí databází nebo s odpovídajícími publikovanými údaji.

Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat výskyt strukturních chromozómových aberací (s vyloučením gapů) u každého zvířete. Výsledky souběžných negativních kontrol by v ideálním případě měly být v 95 % rozmezí distribuce negativních kontrol v historické databázi laboratoře. Pokud jsou údaje ze souběžných negativních kontrol mimo 95 % rozmezí, může být přijatelné je zařadit mezi dosavadní distribuci kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existuje důkaz o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz odstavec 11), a neexistuje důkaz o tom, že by došlo k technické nebo lidské chybě.

Měly by být použity běžně používané laboratorní kmeny zdravých mladých pohlavně dospělých zvířat. Běžně je používán potkan, ale vhodná může být také myš. Použit může být i jakýkoli jiný vhodný druh savce, je-li ve zprávě poskytnuto vědecké zdůvodnění.

Teplota v místnosti pro zvířata by u hlodavců měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by v ideálním případě měla být 50–60 %, ale minimálně 40 % a neměla by pokud možno přesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody. Výběr potravy může být ovlivněn nutností zajistit dostatečné mísení se zkoušenou látkou, je-li látka podávána touto cestou. Hlodavci by měli být chováni v malých skupinách (nejvýše po pěti v každé kleci) téhož pohlaví a se stejnou aplikací, pokud se nepředpokládá agresivní chování, přednostně v klecích s pevnou podlahou s vhodným obohacením životního prostředí. Zvířata mohou být umístěna v klecích individuálně, pouze je-li to vědecky odůvodněné.

Obvykle se používají zdravá mladá dospělá zvířata (u hlodavců ideálně ve věku 6–10 týdnů na počátku expozice, ale přijatelná jsou i zvířata poněkud starší), která se náhodně přiřadí do kontrolních a experimentálních skupin. Jednotlivá zvířata se jednoznačně identifikují humánní, co nejméně invazivní metodou (např. kroužkováním, označením štítkem, pomocí mikročipu nebo biometrické identifikace, avšak nikoli nastřihnutím ucha nebo prstu dolní končetiny) a nechají se v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Mělo by se zabránit vzájemné kontaminaci pozitivní kontroly a zkoušené chemické látky. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti zvířat daného pohlaví.

Pevné zkoušené chemické látky by se měly rozpustit nebo suspendovat ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech nebo by měly být přimíchány do potravy nebo pitné vody před podáním dávky zvířatům. Kapalné zkoušené chemické látky mohou být podávány přímo nebo mohou být před podáním zředěny. Pro účely expozice inhalací lze zkoušené chemické látky v závislosti na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech podávat jako plyn, páru nebo pevný/kapalný aerosol. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování a nestanoví vhodné podmínky pro skladování.

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých hladinách dávek toxické účinky a mělo by být vyloučeno podezření, že reaguje se zkoušenou chemickou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo referenčními údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejprve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul. Jako příklad běžně používaných kompatibilních rozpouštědel/vehikul lze uvést vodu, fyziologický roztok, roztok methylcelulosy, roztok sodné soli karboxymethylcelulosy, olivový olej a kukuřičný olej. Neexistují-li historické nebo publikované kontrolní údaje prokazující, že zvolené atypické rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné strukturní aberace nebo jiné zhoubné účinky, měla by být provedena počáteční studie za účelem stanovení přijatelnosti kontroly s tímto rozpouštědlem/vehikulem.

V každé zkoušce by měla být obvykle zařazena jedna skupina zvířat vystavených pozitivní kontrolní chemické látce. Od toho lze upustit, jestliže zkušební laboratoř prokázala způsobilost k provádění zkoušky a stanovila historické rozmezí pozitivních kontrol. Není-li zařazena souběžná pozitivní kontrolní skupina, měly by být v každém experimentu zařazeny hodnotící kontroly (fixované a neobarvené preparáty). Tyto hodnotící kontroly lze získat tak, že se do hodnocení studie zařadí vhodné referenční vzorky, které byly získány a uchovány ze samostatného experimentu s pozitivními kontrolami prováděného pravidelně (např. každých 6–18 měsíců) v laboratoři, kde se provádí daná zkouška, například během testování způsobilosti a poté pravidelně podle potřeby.

Chemické látky pro pozitivní kontrolu by měly spolehlivě vyvolat pozorovatelné zvýšení výskytu buněk se strukturními chromozómovými aberacemi nad spontánní úroveň. Dávky pozitivní kontroly by měly být zvoleny tak, aby byly účinky zřetelné, ale aby hodnotitel okamžitě nezjistil identitu kódovaného preparátu. Je přijatelné, aby látka v pozitivní kontrole byla podávána jiným způsobem než zkoušená chemická látka, podle odlišného harmonogramu expozice, a aby se odběr vzorků prováděl pouze v jediném okamžiku. Pro pozitivní kontrolu navíc může být vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické třídy, je-li to vhodné. Příklady pozitivních kontrolních chemických látek jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1. Příklady pozitivních kontrolních chemických látek

V každém expozičním intervalu by měla být zařazena souběžná negativní kontrolní skupina zvířat, které jinak podstupují stejný proces jako exponované skupiny až na to, že nejsou vystavena zkoušené chemické látce. Používá-li se při podávání zkoušené chemické látky rozpouštědlo/vehikulum, měla by toto rozpouštědlo/vehikulum dostávat i kontrolní skupina. Pokud však dosavadní údaje o negativních kontrolách v různých intervalech expozice v dané zkušební laboratoři prokazují konzistentní údaje o variabilitě zvířat a četnosti buněk se strukturními aberacemi, může být pro negativní kontrolu nezbytný pouze jeden interval expozice. Je-li u negativních kontrol použit jediný odběr buněk, měl by se provést v prvním (nejkratším) intervalu expozice použitém ve studii.

Obecně je známo, že účinky zjištěné v mikronukleus testu jsou podobné u samců a samic (9) a předpokládá se, že tomu tak bude i u strukturních chromozómových aberací; většinu studií proto je možné provést s kterýmkoli z obou pohlaví. Existence údajů prokazujících významné rozdíly mezi samci a samicemi (např. rozdíly v systémové toxicitě, metabolismu, biologické dostupnosti, toxicita pro kostní dřeň atd. získané např. ve studii ke stanovení rozsahu) by byla důvodem pro použití zvířat obojího pohlaví. V tomto případě může být vhodné provést studii s oběma pohlavími, např. jako součást studie toxicity po opakovaných dávkách. V případě použití obou pohlaví by mohlo být vhodné použít faktoriálního uspořádání experimentu. Podrobnosti ohledně toho, jak analyzovat údaje získané při tomto uspořádání experimentu, jsou uvedeny v dodatku 2.

Velikost skupin při zahájení studie by měla být stanovena tak, aby poskytla minimálně pět analyzovatelných zvířat jednoho pohlaví, nebo každého pohlaví, jsou-li použita obě, z každé skupiny. Je-li expozice člověka chemickým látkám specifická pro určité pohlaví, jako je tomu například u některých léčivých přípravků, měla by být zkouška provedena se zvířaty odpovídajícího pohlaví. Určitým vodítkem pro maximální typické požadavky na počet zvířat může být, že studie s buňkami kostní dřeně při dvou odběrech se třemi skupinami exponovanými dávce jednou souběžnou negativní kontrolní skupinou plus jednou pozitivní kontrolní skupinou (každá skupina složena z pěti zvířat jednoho pohlaví) by vyžadovala 45 zvířat.

Jestliže se provádí předběžná studie pro stanovení rozsahu dávek, poněvadž nejsou k dispozici vhodné údaje, jež by mohly pomoci při stanovení dávek, pak by měla být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, které se použijí v hlavní studii (10). Cílem studie by mělo být zjistit maximální tolerovanou dávku, která je definována jako nejvyšší dávka, která bude po dobu trvání zkoušky tolerována bez příznaků toxicity omezující studii (např. vyvolání poklesu tělesné hmotnosti nebo cytotoxicity hematopoetického systému, avšak nikoli smrti nebo příznaků bolesti, utrpení nebo strádání, kdy je nezbytné zvířata humánně utratit (11)).

Nejvyšší dávku lze rovněž definovat jako dávku, která vyvolává určité známky toxicity pro kostní dřeň.

Výjimku z kritérií pro stanovení dávek mohou představovat chemické látky, jež vykazují saturaci toxikokinetických vlastností nebo indukují detoxifikační procesy, které mohou vést ke snížení expozice po dlouhodobé aplikaci a jež by měly být hodnoceny v každém jednotlivém případě.

Aby bylo možné získat informace o dávce a účinku, měla by úplná studie zahrnovat negativní kontrolní skupinu a minimálně tři úrovně dávek, které jsou zpravidla odstupňovány faktorem 2, avšak nepřevyšujícím 4. Pokud ve studii ke stanovení rozsahu dávek nebo na základě stávajících údajů zkoušená chemická látka nevyvolává toxicitu, měla by nejvyšší dávka při jednorázovém podávání odpovídat 2000 mg/kg tělesné hmotnosti. Pokud však zkoušená chemická látka způsobuje toxicitu, měla by být největší podávanou dávkou maximální tolerovaná dávka a úrovně dávek by měly přednostně pokrývat rozmezí od maximální dávky až po dávku vyvolávající malou toxicitu nebo nevyvolávající žádnou toxicitu. Je-li toxicita pro cílovou tkáň (kostní dřeň) pozorována na všech testovaných úrovních dávek, doporučuje se další studie s netoxickými dávkami. Studie, jejichž cílem je úplnější charakteristika kvantitativních informací o dávce a účinku, mohou vyžadovat zařazení doplňkových skupin zvířat exponovaných dalším dávkám. Pro některé typy zkoušených chemických látek (např. humánních léčivých přípravků), na něž se vztahují specifické požadavky, se tyto limity mohou lišit.

Pokud experimenty pro určení rozsahu dávek nebo stávající údaje získané u příbuzných kmenů zvířat naznačují, že aplikace limitní dávky (viz níže) nevyvolá pozorovatelné toxické účinky (ani pokles proliferace kostní dřeně nebo jiné příznaky cytotoxicity cílové tkáně), a není-li na základě studií genotoxicity in vitro nebo na základě údajů o látkách, které mají příbuznou strukturu, očekávána genotoxicita, nepovažuje se úplná studie se třemi úrovněmi dávek za nutnou, za předpokladu, že bylo prokázáno, že zkoušená chemická látka (látky) dosahuje (dosahují) cílové tkáně (kostní dřeně). V takových případech může být postačující jediná úroveň expozice v limitní dávce. Při delší než 14denní aplikaci je limitní dávka 1000 mg/kg tělesné hmotnosti/den. Při 14denní a kratší aplikaci je limitní dávka 2000 mg/kg tělesné hmotnosti/den.

Při plánování zkoušky by měl být zvážen předpokládaný způsob expozice člověka. Proto lze zvolit odůvodněné způsoby expozice např. stravou, v pitné vodě, lokálně, subkutánně, nitrožilně, orálně (pomocí žaludeční sondy), inhalací, intratracheálně nebo implantací. Způsob podávání by měl být v každém případě zvolen tak, aby zajistil odpovídající expozici cílové tkáně (tkání). Intraperitoneální injekce se obecně nedoporučují, protože se nejedná o předpokládaný způsob expozice člověka, a mohla by být použita pouze s konkrétním vědeckým zdůvodněním. Je-li zkoušená chemická látka přimíchána do potravy nebo pitné vody, zejména v případě jednorázové dávky, mělo by se dbát na to, aby prodleva mezi příjmem krmiva a vody a odběrem vzorku byla dostatečná, aby umožnila detekci účinků (viz odstavce 33–34). Maximální objem kapaliny, který může být najednou podán žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti pokusného zvířete. Toto množství by obvykle nemělo překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít maximálně 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití objemů větších než tento by mělo být odůvodněno. Až na dráždivé a žíravé zkoušené chemické látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující podávání konstantního objemu v závislosti na tělesné hmotnosti při všech úrovních dávky.

Zkoušené chemické látky jsou obvykle podávány jednorázově, ale mohou být podávány také ve dvou dávkách (tzn. dvě nebo více dávek v týž den v rozmezí ne více než 2–3 hodiny), aby bylo usnadněno podávání velkých objemů. Za těchto okolností, nebo je-li zkoušená chemická látka podávána inhalací, by měl být harmonogram odběru buněk stanoven na základě doby podání poslední dávky nebo ukončení expozice.

Pro tuto zkoušku je k dispozici málo údajů o vhodnosti protokolu s opakovanými dávkami. Avšak za situace, kdy je žádoucí integrovat tuto zkoušku se zkouškou toxicity po opakovaných dávkách, by se mělo dbát na to, aby nedošlo ke ztrátě mitotických buněk s poškozenými chromozómy, což může nastat u toxických dávek. Taková integrace je přijatelná, pokud nejvyšší dávka je větší než limitní dávka nebo je stejná (viz odstavec 29) a pokud je exponované skupině podávána limitní dávka po dobu trvání expozice. Je-li žádoucí integrace s jinými studiemi, měl by být za vhodnou zkoušku na chromozómových aberacích in vivo považován mikronukleus test (zkušební metoda B.12).

Vzorky kostní dřeně by měly být odebrány ve dvou různých intervalech od jednorázové aplikace. U hlodavců by se odběr měl provádět po takové době od aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (jenž trvá obvykle 12–18 hodin od expozice). Poněvadž doba nezbytná pro příjem a metabolismus zkoušené chemické látky (látek) a rovněž pro účinky na kinetiku buněčného cyklu může mít vliv na optimální časový interval pro detekci chromozómových aberací, doporučuje se provést další odběr po 24 hodinách od prvního odběru. V prvním intervalu expozice by měly být aplikovány všechny exponované skupiny a proveden odběr buněk. V dalším intervalu (intervalech) expozice je potřebné podat pouze nejvyšší dávku. Je-li na základě vědeckého odůvodnění aplikace rozložena do více než jednoho dne, měl by být odběr zpravidla proveden po takové době od poslední aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu.

Po expozici a před odběrem vzorků se zvířatům intraperitoneálně podá vhodná dávka látky zastavující metafázi (např. colcemidu nebo kolchicinu) a po vhodné době se u nich odeberou vzorky. U myši je tato doba do odebrání vzorku přibližně 3–5 hodin a u potkana je to 2–5 hodin. Z kostní dřeně se odeberou buňky, zhotoví se nátěry, ty se fixují a obarví a buňky se analyzují se na chromozómové aberace (12).

Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maximálního účinku po podání látky. Nejméně dvakrát denně po dobu podávání dávek by měla být provedena prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Všechna zvířata by měla být zvážena na počátku studie, nejméně jednou týdně během studií s opakovanou dávkou a při utracení. Při studiích s alespoň týdenním trváním by se alespoň jednou týdně měla změřit spotřeba krmiva. Pokud je zkoušená chemická látka podávána v pitné vodě, měla by se spotřeba vody měřit při každé výměně vody a alespoň jednou týdně. Zvířata, která vykazují neletální indikátory nadměrné toxicity, by měla být humánně utracena před uplynutím doby zkoušky (11).

Ve vhodnou dobu (vhodné doby) by měl být odebrán vzorek krve, aby mohlo být provedeno vyšetření hladiny zkoušené chemické látky v plazmě za účelem prokázání, že došlo k expozici kostní dřeně, pokud je to požadováno a pokud neexistují jiné údaje o expozici (viz odstavec 44).

Buňky kostní dřeně se získávají z femuru nebo tibie zvířat ihned po humánním utracení, hypotonizují se a fixují. Buňky v metafázi se poté zavedenými metodami nanesou na podložní sklíčka a obarví se (viz (3) (12)).

Všechny preparáty, včetně preparátů pozitivních a negativních kontrol, by měly být před analýzou označeny samostatným kódem určeným náhodným výběrem tak, aby hodnotiteli nebyly známy zkušební podmínky.

Jako měřítko cytotoxicity by měl být u všech exponovaných zvířat (včetně pozitivních kontrol), neexponovaných zvířat pro negativní kontrolu a zvířat pro negativní kontrolu s vehikulem/rozpouštědlem stanoven mitotický index, a to alespoň u 1000 buněk na jedno zvíře.

U každého zvířete by mělo být analyzováno alespoň 200 metafází na strukturní chromozómové aberace včetně gapů a s vyloučením gapů (6), Pokud však z historické databáze negativních kontrol vyplývá, že střední četnost spontánního výskytu strukturních chromozómových aberací v dané laboratoři je < 1 %, mělo by se zvážit vyhodnocení dalších buněk. Chromatidové a chromozómové aberace by měly být zaznamenávány odděleně a klasifikovány podle podtypů (zlomy, výměny). Postupy používané v laboratoři by měly zajistit, aby analýzu chromozómových aberací prováděli dobře odborně připravení hodnotitelé a a aby tato analýza případně byla podrobena odborné revizi. Vzhledem k tomu, že při přípravě preparátů často dochází k poškození části buněk v metafázi s následnou ztrátou chromozómů, měly by vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu nejméně 2n ± 2, kde n je haploidní počet chromozómů pro daný druh.

Údaje pro jednotlivá zvířata by měly být zpracovány ve formě tabulky. U každého zvířete by měl být uveden mitotický index, počet hodnocených buněk v metafázi, počet aberací na každou buňku v metafázi a procentuální podíl buněk se strukturními chromozomovými aberacemi. Pro exponované a kontrolní skupiny by měly být uvedeny různé typy strukturních chromozómových aberací s jejich počtem a četností. Gapy, jakož i polyploidní buňky a buňky s endoreplikovanými chromozómy se zaznamenávají odděleně. Četnost výskytu gapů se zaznamenává, ale do analýzy celkové četnosti strukturních aberací se nezahrnuje. Neexistuje-li důkaz o rozdílu v odpovědi mezi pohlavími, mohou být pro účely statistické analýzy tyto údaje sloučeny. Uvedeny by měly být i údaje o toxicitě u zvířat a klinické příznaky.

Přijatelnost zkoušky určují tato kritéria:

• a) údaje o souběžné negativní kontrole jsou považovány za přijatelné pro přidání do historické kontrolní databáze laboratoře (viz odstavce 11–14);
• b) souběžné pozitivní kontroly nebo hodnotící kontroly by měly vyvolat odpovědi, které jsou slučitelné s odpověďmi uvedenými v historické databázi pozitivních kontrol, a měly by vyvolat statisticky významný nárůst v porovnání s negativní kontrolou (viz odstavce 20–21);
• c) byl analyzován přiměřený počet dávek a buněk;
• d) kritéria pro výběr nejvyšší dávky jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 25–28.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud:

• a) alespoň jedna z exponovaných skupin vykazuje statisticky významné zvýšení výskytu buněk se strukturními chromozómovými aberacemi (s vyloučením gapů) v porovnání se souběžnou negativní kontrolou;
• b) hodnocení pomocí vhodného statistického trend-testu alespoň v jednom čase odběru ukáže závislost tohoto nárůstu na dávce; a
• c) všechny tyto výsledky jsou mimo distribuci dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení).

Je-li v určitém konkrétním čase odběru zkoumána pouze nejvyšší dávka, je zkoušená chemická látka považována za jasně pozitivní, pokud existuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou a výsledky jsou mimo distribuci dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení). Doporučení ohledně vhodných statistických metod lze najít v literatuře (13). Při provádění analýzy dávky a odezvy by měly být analyzovány alespoň tři skupiny exponované různé dávce. Při statistických testech by mělo být zvíře použito jako experimentální jednotka. Pozitivní výsledky zkoušky na chromozómové aberace znamenají, že zkoušená látka indukuje strukturální chromozómové aberace v kostní dřeni druhu zvířat použitého k testování.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, je zkoušená chemická látka považována za jasně negativní, pokud ve všech zkoumaných zkušebních podmínkách:

• a) žádná z exponovaných skupin nevykazuje statisticky významné zvýšení výskytu buněk se strukturními chromozómovými aberacemi (s vyloučením gapů) v porovnání se souběžnou negativní kontrolou;
• b) hodnocení pomocí vhodného statistického trend-testu v žádném čase odběru neukazuje nárůst v závislosti na dávce;
• c) všechny výsledky spadají do rámce distribuce dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení); a
• d) došlo k expozici kostní dřeně zkoušené chemické látce (látkám).

Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (13). Důkazy o expozici kostní dřeně zkoušené chemické látce mohou zahrnovat pokles mitotického indexu nebo měření hladiny zkoušené chemické látky (látek) v plazmě nebo v krvi. V případě nitrožilního podání není důkazů o expozici zapotřebí. Alternativně mohou být k prokázání expozice kostní dřeně použity údaje o absorpci, distribuci, metabolismu a exkreci (ADME) získané při nezávislé studii za použití stejného způsobu expozice a se stejným druhem. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená chemická látka za podmínek zkoušky neindukuje strukturní chromozómové aberace v kostní dřeni druhu zvířat použitého k testování.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odpovědi se nepožaduje.

V případech, kdy odpověď není jasně negativní nebo pozitivní, a s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku (např. slabý nebo okrajový nárůst), by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším vyšetřením u provedených experimentů. V některých případech by mohlo být užitečné analyzovat více buněk nebo provést opakovaný experiment za použití upravených zkušebních podmínek.

V ojedinělých případech dokonce ani po dalším šetření nebude možné na základě daných údajů učinit závěr, zda zkoušená chemická látka přináší pozitivní či negativní výsledky, a proto bude učiněn závěr, že výsledek studie je neurčitý.

Četnost polyploidie a endoreduplikovaných metafází v celkovém počtu metafází by se měla zaznamenat odděleně. Nárůst počtu polyploidních buněk / endoreduplikovaných buněk může znamenat, že zkoušená chemická látka má schopnost potlačit mitotické procesy nebo progresi buněčného cyklu (viz odstavec 3).

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

• Zkoušená chemická látka:

  • zdroj, číslo šarže a je-li k dispozici, datum použitelnosti,

  • stabilita zkoušené chemické látky, je-li známa.

• Jednosložková látka:

  • fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti,

  • chemická identifikace, jako např. název IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné, atd.

• Vícesložková látka, UVCB a směsi:

  • charakterizovaná v co možná největší míře chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a důležitými fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek.

• Příprava zkoušené chemické látky:

  • zdůvodnění volby vehikula,

  • rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa,

  • příprava potravy, pitné vody nebo inhalačních aplikačních forem,

  • analytická stanovení aplikační formy (např. stabilita, homogenita, nominální koncentrace), jsou-li prováděna.

• Pokusná zvířata:

  • použitý druh/kmen a odůvodnění jeho použití,

  • počet, stáří a pohlaví zvířat,

  • zdroj, podmínky chovu, strava atd.,

  • metoda jednoznačného označení zvířat,

  • u krátkodobých studií: hmotnost jednotlivých zvířat na začátku a na konci zkoušky; u studií delších než jeden týden: hmotnosti jednotlivých zvířat během studie a spotřeba potravy. Mělo by být uvedeno rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnota a směrodatná odchylka pro každou skupinu.

• Zkušební podmínky:

  • pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontroly,

  • údaje ze studie pro zjištění rozsahu dávek, pokud byla provedena,

  • zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

  • podrobné údaje o přípravě zkoušené chemické látky,

  • podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,

  • zdůvodnění způsobu a trvání podávání,

  • metody k ověření, že se zkoušená chemická látka (látky) dostala (dostaly) do obecné cirkulace nebo kostní dřeně,

  • skutečná dávka (v mg/kg tělesné hmotnosti na den) vypočítaná z koncentrace zkoušené chemické látky v potravě / pitné vodě (v ppm) a ze spotřeby, je-li to relevantní,

  • podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody.

  • způsob utracení,

  • způsob analgezie (pokud se používá),

  • podrobný popis harmonogramů aplikace a odběru vzorků a odůvodnění výběru,

  • metody přípravy preparátů,

  • metody stanovení toxicity,

  • identita chemické látky zastavující metafázi, její koncentrace, dávka a čas podání před odběrem vzorků,

  • postupy izolace a uchovávání vzorků,

  • kritéria hodnocení aberací,

  • počet buněk v metafázi analyzovaných u každého zvířete a počet buněk analyzovaných za účelem stanovení mitotického indexu,

  • kritéria přijatelnosti studie,

  • kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo neprůkaznou.

• Výsledky:

  • stav zvířat před zkouškou a během zkoušky, včetně známek toxicity,

  • mitotický index uvedený odděleně pro každé zvíře,

  • typ a počet aberací a buněk s aberacemi uvedený odděleně pro každé zvíře,

  • celkový počet aberací ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

  • počet buněk s aberacemi ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

  • změny ploidie, byly-li pozorovány, včetně četností polyploidie a/nebo endoreduplikovaných buněk,

  • podle možnosti závislost odpovědi na dávce,

  • případné statistické analýzy a metoda,

  • údaje dokládající, že došlo k expozici kostní dřeně,

  • údaje o souběžných negativních a pozitivních kontrolách s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

  • dosavadní údaje o negativních a pozitivních kontrolách s rozpětími, středními hodnotami, směrodatnými odchylkami a 95 % rozmezí distribuce a rovněž časové období, na které se údaje vztahují, a počet pozorování,

  • splněná kritéria pro pozitivní nebo negativní odpověď.

• Rozbor výsledků.

• Závěr.

• Odkazy.

• 1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
• 2) Adler, I.D. (1984), „Cytogenetic Tests in Mammals“, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, s. 275-306.
• 3) Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, s. 157–165.
• 4) Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 115-141.
• 5) Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, s. 305-312.
• 6) Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, s. 19-30.
• 7) Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
• 8) Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 87-90.
• 9) Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, s. 293-304.
• 10) Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, s. 313-319.
• 11) OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, N^o19, OECD Publishing, Paris.
• 12) Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, s. 147-163.
• 13) Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 184-232.

Při tomto pokusu se na každé úrovni koncentrace testuje minimálně 5 samců a 5 samic a výsledkem je uspořádání s použitím minimálně 40 zvířat (20 samců a 20 samic plus příslušné pozitivní kontroly).

Tento pokus, který je jedním z nejjednodušších faktoriálních pokusů, je rovnocenný dvoufaktorové analýze rozptylu, přičemž hlavními prvky jsou úroveň koncentrace a pohlaví. Údaje je možné analyzovat pomocí mnoha standardních statistických softwarových balíčků, např. SPSS, SAS, STATA, Genstat a také pomocí programu R.

Analýza dělí variabilitu v souboru údajů na variabilitu mezi pohlavími, variabilitu mezi úrovněmi koncentrace a variabilitu interakce mezi pohlavími a koncentracemi. Každý z těchto znaků se testuje oproti odhadu variability u replicitních zvířat ve skupinách zvířat stejného pohlaví, jimž je podávána stejná koncentrace látky. Veškeré podrobnosti základní metodiky jsou dostupné v mnoha standardních učebnicích statistiky (viz odkazy) a v „nápovědě“ statistických programů.

Analýza se provádí zkoumáním znaku interakce pohlaví x koncentrace v tabulce ANOVA(Statistikové, kteří používají metodu modelování, např. pomocí obecných lineárních modelů (GLM), mohou k této analýze přistupovat odlišným, byť srovnatelným způsobem, ale nebudou nutně odvozovat tradiční tabulku ANOVA, což se datuje zpět k algoritmickým postupům statistických výpočtů vyvinutým před érou počítačů.). Neexistuje-li významný znak interakce, kombinované hodnoty za obě pohlaví nebo za všechny úrovně koncentrace poskytují validní statistické testy variability mezi úrovněmi založené na zkoumání kumulovaného znaku vnitroskupinové variability pomocí analýzy ANOVA.

Analýza pokračuje rozdělením odhadu variability mezi koncentracemi na kontrasty, což zajišťuje test na lineární a kvadratické kontrasty odpovědí na všech úrovních koncentrace. Pokud existuje významná interakce pohlaví x koncentrace, lze tento znak také rozdělit na lineární a kvadratický člen kontrastů interakce pohlaví. Pomocí těchto znaků se testuje, zda jsou odpovědi na koncentraci u obou pohlaví paralelní, nebo zda je odpověď u každého pohlaví odlišná.

Odhad kumulované vnitroskupinové variability může být použit k párovému testování rozdílu mezi středními hodnotami. Tato srovnání by mohla být provedena mezi středními hodnotami u obou pohlaví a mezi středními hodnotami u různých úrovní koncentrace, např. za účelem porovnání s úrovněmi negativní skupiny. V případech, kdy existuje významná interakce, lze provádět srovnání mezi středními hodnotami při různých koncentracích v rámci jednotlivých pohlaví nebo mezi středními hodnotami u pohlaví při stejné koncentraci.

Existuje množství učebnic statistiky, které se zabývají teorií, uspořádáním, metodikou, analýzou a interpretací faktoriálních pokusů od nejjednodušších dvoufaktorových analýz až po složitější formy používané v metodice experimentálního uspořádání. Následující seznam není vyčerpávající. V některých pracích jsou uvedeny vypracované příklady srovnatelných uspořádání, v některých případech i s kódem pro provádění analýz pomocí různých počítačových programů.

• Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

• Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

• Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

• Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

• Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

• Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

• Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 474 (2016). Je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument OECD, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které byly v těchto pokynech ke zkoušení provedeny (1).

Mikronukleus test v savčích erytrocytech in vivo je zvláště významný k posouzení genotoxicity, neboť zde probíhá aktivní metabolismus in vivo, farmakokinetika a procesy reparace DNA, které přispívají k účinku testované látky, jakkoli mohou být různé u různých druhů. Zkouška in vivo je rovněž užitečná pro další výzkum genotoxicity zjištěné v systémech in vitro.

Mikronukleus test v savčích erytrocytech in vivo je používán k detekci poškození chromozómů nebo mitotického aparátu erytroblastů, které je indukováno zkoušenou chemickou látkou. V tomto testu se hodnotí tvorba mikrojader v erytrocytech odebraných z kostní dřeně nebo z buněk periferní krve, obvykle hlodavců.

Účelem mikronukleus testu v savčích erytrocytech je identifikovat chemické látky, které způsobují cytogenetické poškození, jehož výsledkem je tvorba mikrojader obsahujících nereplikující se (lagging) chromozómové fragmenty nebo celé chromozómy.

Když se erytroblast kostní dřeně mění na nezralý erytrocyt (někdy též označovaný jako polychromatický erytrocyt nebo retikulocyt), hlavní jádro je vypuzeno a mikrojádra, která při tom mohou vzniknout, zůstávají v cytoplasmě. Zviditelnění nebo detekce mikrojader jsou v těchto buňkách usnadněny tím, že neobsahují hlavní jádro. Nárůst výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry v exponovaných zvířatech je známkou indukovaných strukturních nebo numerických chromozómových aberací.

Nově vytvořené erytrocyty s mikrojádry se zjišťují a kvantifikují obarvením a poté následuje buď vizuální hodnocení pomocí mikroskopu, nebo automatizovaná analýza. Počítání dostačujícího počtu nezralých erytrocytů v periferní krvi nebo kostní dřeni dospělých zvířat se značně usnadní použitím automatizovaného hodnotícího systému. Tyto systémy jsou přijatelnými alternativami manuálního hodnocení (2). Z komparativních studií vyplývá, že tyto metody, při nichž se používají vhodné kalibrační standardy, mohou zajistit lepší mezilaboratorní a vnitrolaboratorní reprodukovatelnost a větší citlivost než manuální hodnocení pomocí mikroskopu (3) (4). Automatizované systémy pro měření četnosti erytrocytů s mikrojádry zahrnují kromě jiného průtokové cytometry (5), platformy pro analýzu obrazu (6)(7) a laserové skenovací cytometry (8).

Ačkoli se to v rámci tohoto testu obvykle neprovádí, lze odlišit chromozómové fragmenty od celých chromozómů podle řady kritérií. Tato kritéria zahrnují identifikaci přítomnosti nebo nepřítomnosti kinetochoru nebo centromerické DNA, jež jsou obojí charakteristické pro neporušené chromozómy. Nepřítomnost kinetochoru nebo centromerické DNA naznačuje, že mikrojádro obsahuje pouze fragmenty chromozómů, zatímco jejich přítomnost ukazuje na ztrátu chromozómů.

Definice použitých termínů jsou uvedeny v dodatku 1.

Cílovou tkání pro genetická poškození v tomto testu je kostní dřeň mladých dospělých hlodavců, protože v této tkáni vznikají erytrocyty. Detekce mikrojader v nezralých erytrocytech v periferní krvi je možná i u jiných druhů savců, u nichž byla prokázána dostatečná citlivost při detekci chemické látky, které v těchto buňkách způsobují strukturní nebo numerické chromozómové aberace (indukcí mikrojader v nezralých erytrocytech), a je-li uvedeno vědecké zdůvodnění. Hlavním konečným ukazatelem je četnost výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry. Četnost výskytu zralých erytrocytů, jež obsahují mikrojádra v periferní krvi, může být rovněž použita jako koncový ukazatel u druhů bez silné slezinné selekce proti buňkám s mikrojádry a jsou-li zvířata trvale exponována po dobu, jež přesahuje délku života erytrocytu u použitého druhu (např. 4 týdny nebo více u myši).

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená chemická látka (chemické látky) nebo reaktivní metabolit (metabolity) nedostanou do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.

Před použitím této zkušební metody na směs za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by se mělo zvážit, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.

Zvířata se vhodným způsobem vystaví zkoušené chemické látce. Použije-li se kostní dřeň, zvířata se ve vhodném okamžiku po expozici humánně utratí, odebere se kostní dřeň, připraví se preparát a obarví se (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Při použití periferní krve se krev ve vhodném okamžiku (vhodných okamžicích) po expozici odebere, připraví se preparát a obarví se (12) (16) (17) (18). Při akutní expozici je důležité zvolit takové časy odběru kostní dřeně nebo krve, kdy je možné detekovat indukci nezralých erytrocytů s mikrojádry související s expozicí. V případě odběru periferní krve musí též uplynout dostatek času, aby se tyto jevy mohly objevit v cirkulující krvi. Preparáty se analyzují na přítomnost mikrojader, a to vizualizací pomocí mikroskopu, analýzou obrazu, průtokovou cytometrií nebo laserovou skenovací cytometrií.

Aby bylo možné před zahájením rutinního zkoušení zjistit, zda laboratoř má s danou zkouškou dostatečné zkušenosti, měla by prokázat schopnost reprodukovat očekávané výsledky z publikovaných údajů (17) (19) (20) (21) (22), pokud jde o četnost výskytu mikrojader, nejméně se dvěma pozitivními kontrolními chemickými látkami (včetně slabých odpovědí indukovaných nízkými dávkami u pozitivních kontrol), např. látkami uvedenými v tabulce 1, a s kontrolami s kompatibilním vehikulem/rozpouštědlem (viz odstavec 26). Při těchto experimentech by se měly používat dávky, jež poskytují reprodukovatelné nárůsty v závislosti na dávce, a měly by prokázat citlivost a dynamické rozpětí zkušebního systému ve sledované tkáni (kostní dřeni nebo periferní krvi) za použití hodnotící metody, jež má být v laboratoři uplatňována. Tento požadavek neplatí pro laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají k dispozici historickou databázi, jak je definována v odstavci 14–18.

V průběhu šetření způsobilosti by laboratoř měla stanovit:

• historické rozmezí a distribuci pozitivních kontrolních účinků a

• historické rozmezí a distribuci negativních kontrolních účinků.

Při prvním získávání údajů o dosavadní distribuci negativních kontrol by měly být výsledky provedených negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji, pokud existují. S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by souběžné negativní kontroly v ideálním případě spadat do 95 % rozmezí této distribuce. Historická databáze negativních kontrol laboratoře by měla být statisticky robustní, aby byla zajištěna schopnost laboratoře posuzovat distribuci svých údajů o negativních kontrolách. V literatuře se doporučuje, že nezbytným minimem může být 10 experimentů, nejlépe však by databáze měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek. V laboratořích by měly být uplatňovány metody řízení jakosti, jako např. kontrolní diagramy (např.C-charts nebo X-bar charts (23)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“. Další doporučení, jak získat a používat dosavadní údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (24).

Pokud laboratoř neprovedla dostatečný počet experimentů, aby mohla během šetření způsobilosti (popsaného v odstavci 13) stanovit statisticky robustní distribuci negativních kontrol (viz odstavec 15), je přijatelné, aby distribuce byla stanovena během prvních rutinních zkoušek. Uplatňování tohoto přístupu by mělo vycházet z doporučení uvedených v literatuře (24) a výsledky negativních kontrol získané při těchto experimentech by měly zůstat v souladu s publikovanými údaji o negativních kontrolách.

Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich dopadu na výsledné údaje tak, aby zůstaly v souladu se stávající historickou kontrolní databází laboratoře. Pouze případy větších rozdílů ve zkušebním protokolu by měly vést k zavedení nové historické kontrolní databáze, přičemž její odlišnost od dřívější distribuce se stanoví na základě odborného posouzení (viz odstavec 15). V průběhu opětovného stanovení nemusí být k provedení aktuální zkoušky nutná úplná databáze negativních kontrol, pokud laboratoř prokáže, že hodnoty jejích souběžných negativních kontrol zůstávají v souladu s její předchozí databází nebo s odpovídajícími publikovanými údaji.

Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat výskyt nezralých erytrocytů s mikrojádry u každého zvířete. Výsledky souběžných negativních kontrol by v ideálním případě měly být v 95 % rozmezí distribuce v historické databázi negativních kontrol laboratoře. Pokud jsou údaje ze souběžných negativních kontrol mimo 95 % rozmezí, může být přijatelné je zařadit mezi dosavadní distribuci kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existuje důkaz o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz odstavec 15), a neexistuje důkaz o tom, že by došlo k technické nebo lidské chybě.

Měly by být použity běžně používané laboratorní kmeny zdravých mladých pohlavně dospělých zvířat. Použit lze myši, potkany nebo jiné vhodné druhy savců. Při použití periferní krve se musí stanovit, že detekci indukovaných mikrojader u zvoleného druhu neohrozí odstraňování buněk s mikrojádry z krevního oběhu ve slezině. Toto bylo jasně prokázáno u periferní krve myši a potkana (2). Vědecké zdůvodnění použití jiných druhů než potkanů a myší by mělo být uvedeno ve zprávě. Jsou-li použity jiné druhy než hlodavci, doporučuje se měření indukovaných mikrojader začlenit do jiné vhodné zkoušky toxicity.

Teplota v místnosti pro zvířata by u hlodavců měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by v ideálním případě měla být 50–60 %, ale minimálně 40 % a neměla by pokud možno přesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody. Výběr potravy může být ovlivněn nutností zajistit dostatečné mísení se zkoušenou látkou, je-li látka podávána touto cestou. Hlodavci by měli být chováni v malých skupinách (nejvýše po pěti v každé kleci) téhož pohlaví a se stejnou aplikací, pokud se nepředpokládá agresivní chování, přednostně v klecích s pevnou podlahou s vhodným obohacením životního prostředí. Zvířata mohou být umístěna v klecích individuálně, pouze je-li to vědecky odůvodněné.

Obvykle se používají zdravá mladá dospělá zvířata (u hlodavců ideálně ve věku 6–10 týdnů na počátku expozice, ale přijatelná jsou i zvířata poněkud starší), která se náhodně přiřadí do kontrolních a experimentálních skupin. Jednotlivá zvířata se jednoznačně identifikují humánní, co nejméně invazivní metodou (např. kroužkováním, označením štítkem, pomocí mikročipu nebo biometrické identifikace, avšak nikoli nastřihnutím ucha nebo prstu dolní končetiny) a nechají se v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Mělo by se zabránit vzájemné kontaminaci pozitivní kontroly a zkoušené chemické látky. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti zvířat daného pohlaví.

Pevné zkoušené chemické látky by se měly rozpustit nebo suspendovat ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech nebo by měly být přimíchány do potravy nebo pitné vody před podáním dávky zvířatům. Kapalné zkoušené chemické látky mohou být podávány přímo nebo mohou být před podáním zředěny. Pro účely expozice inhalací lze zkoušené chemické látky v závislosti na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech podávat jako plyn, páru nebo pevný/kapalný aerosol. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování a nestanoví vhodné podmínky pro skladování.

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých úrovních dávek toxické účinky a nemělo by být schopno chemické reakce se zkoušenými chemickými látkami. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo referenčními údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejprve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul. Jako příklad běžně používaných kompatibilních rozpouštědel/vehikul lze uvést vodu, fyziologický roztok, roztok methylcelulosy, roztok sodné soli karboxymethylcelulosy, olivový olej a kukuřičný olej. Neexistují-li historické nebo publikované kontrolní údaje prokazující, že zvolené atypické rozpouštědlo/vehikulum neindukuje mikrojádra nebo jiné zhoubné účinky, měla by být provedena počáteční studie za účelem stanovení přijatelnosti kontroly s tímto rozpouštědlem/vehikulem.

V každé zkoušce by měla být obvykle zařazena jedna skupina zvířat vystavených pozitivní kontrolní chemické látce. Od toho lze upustit, jestliže zkušební laboratoř prokázala způsobilost k provádění zkoušky a stanovila historické rozmezí pozitivních kontrol. Není-li zařazena souběžná pozitivní kontrolní skupina, měly by být v každém experimentu zařazeny hodnotící kontroly (fixované a nezbarvené preparáty nebo vzorky buněčné suspenze podle toho, co je vhodné pro danou hodnotící metodu). Tyto hodnotící kontroly lze získat tak, že se do hodnocení studie zařadí vhodné referenční vzorky, které byly získány a uchovány ze samostatného experimentu s pozitivními kontrolami prováděného pravidelně (např. každých 6–18 měsíců), například během testování způsobilosti a poté pravidelně podle potřeby.

Chemické látky pro pozitivní kontrolu by měly spolehlivě vyvolat pozorovatelné zvýšení výskytu buněk s mikrojádry nad spontánní úroveň. Při použití manuálního hodnocení za použití mikroskopie by dávky u pozitivní kontroly měly být zvoleny tak, aby byl účinek zřetelný, ale aby hodnotitel okamžitě nezjistil identitu kódovaného vzorku. Je přijatelné, aby látka v pozitivní kontrole byla podávána jiným způsobem než zkoušená chemická látka, podle odlišného harmonogramu expozice, a aby se odběr vzorků prováděl pouze v jediném okamžiku. Pro pozitivní kontrolu navíc může být vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické třídy, je-li to vhodné. Příklady pozitivních kontrolních chemických látek jsou uvedeny v tabulce 1.

ethyl-methansulfonát [CASRN 62-50-0]

methyl-methansulfonát [CASRN 66-27-3]

1-ethyl-1-nitrosomočovina [CASRN 759-73-9]

mitomycin C [CASRN 50-07-7]

cyklofosfamid (cyklofosfamid monohydrát) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

2,4,6-tris(aziridin-1-yl)- 1,3,5-triazin [CASRN 51-18-3]

kolchicin [CASRN 64-86-8] nebo vinblastin [CASRN 865-21-4] – jako aneugeny

V každém expozičním intervalu by měla být zařazena souběžná negativní kontrolní skupina zvířat, která jinak podstupují stejný proces jako exponované skupiny až na to, že nejsou vystavena zkoušené chemické látce. Používá-li se při podávání zkoušené chemické látky rozpouštědlo/vehikulum, měla by toto rozpouštědlo/vehikulum dostávat i kontrolní skupina. Pokud však dosavadní údaje o negativních kontrolách v různých intervalech expozice v dané zkušební laboratoři prokazují konzistentní údaje o variabilitě zvířat a četnosti buněk s mikrojádry, může být pro negativní kontrolu nezbytný pouze jeden odběr. Je-li u negativních kontrol použit jediný odběr, měl by se provést v prvním (nejkratším) intervalu expozice použitém ve studii.

Při použití periferní krve je u krátkodobých studií přijatelný vzorek odebraný před expozicí namísto souběžné negativní kontroly, pokud výsledné údaje jsou konzistentní s historickou kontrolní databází dané zkušební laboratoře. Bylo prokázáno, že u potkana vzorek s malými objemy odebraný před expozicí (např. méně než 100 μl/den) má minimální dopad na četnost výskytu mikrojader na pozadí (25).

Indukce mikrojader je v zásadě u samic a samců podobná, a většinu studií je proto možné provést s kterýmkoli z obou pohlaví (26). Existence údajů prokazujících významné rozdíly mezi samci a samicemi (např. rozdíly v systémové toxicitě, metabolismu, biologické dostupnosti, toxicita pro kostní dřeň atd. získané např. ve studii ke stanovení rozsahu dávek) by byla důvodem pro použití zvířat obojího pohlaví. V tomto případě může být vhodné provést studii s oběma pohlavími, např. jako součást studie toxicity po opakovaných dávkách. V případě použití obou pohlaví by mohlo být vhodné použít faktoriálního uspořádání experimentu. Podrobnosti ohledně toho, jak analyzovat údaje získané při tomto uspořádání experimentu, jsou uvedeny v dodatku 2.

Velikost skupin při zahájení studie by měla být stanovena tak, aby poskytla minimálně pět analyzovatelných zvířat jednoho pohlaví, nebo každého pohlaví, jsou-li použita obě, z každé skupiny. Je-li expozice člověka chemickým látkám specifická pro určité pohlaví, jako je tomu například u některých léčivých přípravků, měla by být zkouška provedena se zvířaty odpovídajícího pohlaví. Určitým vodítkem pro maximální typické požadavky na počet zvířat může být, že studie s kostní dření prováděné podle parametrů uvedených v odstavci 37 se třemi exponovanými skupinami a souběžnými negativními a kontrolními skupinami (každá skupina složena z pěti zvířat jednoho pohlaví) by vyžadovala 25 až 35 zvířat.

Provádí-li se studie pro zjištění rozsahu dávek, poněvadž nejsou k dispozici vhodné údaje, jež by mohly pomoci při stanovení dávek, měla by být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, které se použijí v hlavní studii (27). Cílem studie by mělo být zjistit maximální tolerovanou dávku, která je definována jako nejvyšší dávka, která bude po dobu trvání zkoušky tolerována bez příznaků toxicity omezující studii (např. vyvolání poklesu tělesné hmotnosti nebo cytotoxicity hematopoetického systému, avšak nikoli smrti nebo příznaků bolesti, utrpení nebo strádání, kdy je nezbytné zvířata humánně utratit (28)).

Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka vyvolávající v kostní dřeni toxicitu (např. snížení podílu nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů v kostní dřeni nebo v periferní krvi o více než 50 %, avšak nejméně na 20 % kontrolní hodnoty). Při analýze CD71 pozitivních buněk v periferním krevním oběhu (tj. pomocí průtokové cytometrie) tato velmi mladá frakce nezralých erytrocytů odpovídá na toxické podněty rychleji než větší kohorta nezralých erytrocytů s pozitivní RNA. Vyšší zjevná toxicita proto může být zřejmá při uspořádání s akutní expozicí, kdy se zkoumá frakce CD71 pozitivních nezralých erytrocytů v porovnání s těmi uspořádáními, jež identifikují nezralé erytrocyty na základě obsahu RNA. A proto, jestliže se při experimentech využívá pěti nebo méně dnů expozice, může být nejvyšší dávka chemické látky způsobující toxicitu definována jako dávka, která způsobuje statisticky významné snížení podílu nezralých CD71 pozitivních erytrocytů z celkového množství erytrocytů, avšak nikoli na úroveň menší než 5 % kontrolní hodnoty (29).

Výjimku z kritérií pro stanovení dávek mohou představovat chemické látky, jež vykazují saturaci toxikokinetických vlastností nebo indukují detoxifikační procesy, které mohou vést ke snížení expozice po dlouhodobé aplikaci, a jež by měly být hodnoceny v každém jednotlivém případě.

Aby bylo možné získat informace o dávce a účinku, měla by úplná studie zahrnovat negativní kontrolní skupinu a minimálně tři úrovně dávek, které jsou zpravidla odstupňovány faktorem 2, avšak nepřevyšujícím 4. Pokud zkoušená chemická látka ve studii ke stanovení rozsahu dávek nebo na základě existujících údajů nevyvolává toxicitu, měla by být nejvyšší dávka 1000 mg/kg tělesné hmotnosti/den při době podávání 14 dní nebo delší nebo 2000 mg/kg tělesné hmotnosti/den při dobách podávání kratších než 14 dní. Pokud však zkoušená chemická látka způsobuje toxicitu, měla by být největší podávanou dávkou maximální tolerovaná dávka a úrovně dávek by měly přednostně pokrývat rozmezí od maximální dávky až po dávku vyvolávající malou toxicitu nebo nevyvolávající žádnou toxicitu. Je-li toxicita pro cílovou tkáň (kostní dřeň) pozorována na všech testovaných úrovních dávek, doporučuje se další studie s netoxickými dávkami. Studie, jejichž cílem je úplnější charakteristika kvantitativních informací o dávce a odezvě, mohou vyžadovat zařazení doplňkových skupin zvířat exponovaných dalším dávkám. Pro některé typy zkoušených chemických látek (např. humánních léčivých přípravků), na něž se vztahují specifické požadavky, se tyto limity mohou lišit.

Pokud experimenty pro určení rozsahu dávek nebo existující údaje získané u příbuzných kmenů zvířat naznačují, že aplikace limitní dávky (viz níže) nevyvolá pozorovatelné toxické účinky (ani pokles proliferace kostní dřeně nebo jiné příznaky cytotoxicity cílové tkáně), a není-li na základě studií genotoxicity in vitro nebo na základě údajů o látkách, které mají příbuznou strukturu, očekávána genotoxicita, nepovažuje se úplná studie se třemi úrovněmi dávky za nutnou, za předpokladu, že bylo prokázáno, že zkoušená chemická látka (látky) dosahuje (dosahují) cílové tkáně (kostní dřeně). V takových případech může být postačující jediná úroveň expozice v limitní dávce. Pro 14denní a delší aplikaci je limitní dávka 1000 mg/kg tělesné hmotnosti/den. Pro kratší než 14denní aplikaci je limitní dávka 2000 mg/kg tělesné hmotnosti/den.

Při plánování zkoušky by měl být zvážen předpokládaný způsob expozice člověka. Proto lze zvolit odůvodněné způsoby expozice např. potravou, v pitné vodě, lokálně, subkutánně, nitrožilně, orálně (pomocí žaludeční sondy), inhalací, intratracheálně nebo implantací. Způsob podávání by měl být v každém případě zvolen tak, aby zajistil odpovídající expozici cílové tkáně (tkání). Intraperitoneální injekce se obecně nedoporučují, protože se nejedná o předpokládaný způsob expozice člověka, a mohla by být použita pouze s konkrétním vědeckým zdůvodněním. Je-li zkoušená chemická látka přimíchána do potravy nebo pitné vody, zejména v případě jednorázové dávky, mělo by se dbát na to, že prodleva mezi příjmem krmiva a vody a odběrem vzorku by měla být dostatečná, aby umožnila detekci účinků (viz odstavec 37). Maximální objem kapaliny, který může být najednou podán žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti pokusného zvířete. Toto množství by obvykle nemělo překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít maximálně 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití objemů větších než tento by mělo být odůvodněno. Až na dráždivé a žíravé zkoušené chemické látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující podávání konstantního objemu v závislosti na tělesné hmotnosti při všech úrovních dávky.

Přednostně se provádějí 2 nebo více aplikací v intervalu 24 hodin, zejména při začlenění tohoto testu do jiných studií toxicity. Alternativně lze podat jedinou dávku, pokud je to vědecky odůvodněno (např. chemické látky, o nichž je známo, že blokují buněčný cyklus). Zkoušené chemické látky mohou být podávány také ve dvou dávkách, tzn. dvě nebo více dávek v týž den v rozmezí ne více než 2–3 hodiny, aby bylo usnadněno podávání velkých objemů. Za těchto okolností, nebo je-li zkoušená chemická látka podávána inhalací, by měl být harmonogram odběru buněk stanoven na základě doby podání poslední dávky nebo ukončení expozice.

Zkouška může být prováděna na myších nebo potkanech jedním z těchto způsobů:

• a. zkoušená chemická látka se aplikuje zvířatům jednorázově. Vzorky kostní dřeně se odeberou alespoň dvakrát (od nezávislých skupin zvířat), přičemž první odběr se provede nejdříve 24 hodin po aplikaci a poslední nejpozději 48 hodin po aplikaci, pokud není známo, že zkoušená chemická látka má mimořádné dlouhý poločas rozpadu, a s přiměřeným odstupem mezi odběry. Odběr dříve než 24 hodin po aplikaci musí být zdůvodněn. Vzorky periferní krve se odeberou alespoň dvakrát (od téže skupiny zvířat), přičemž první odběr se provede nejdříve 36 hodin po aplikaci a poslední nejpozději 72 hodin po aplikaci a po prvním odběru se dodrží odpovídající odstup/y. V prvním intervalu expozice by měly být aplikovány všechny exponované skupiny a proveden odběr buněk. V dalším intervalu (intervalech) expozice je potřebné podat pouze nejvyšší dávku. Je-li po prvním odběru pozorována pozitivní odpověď, není další odběr nutný, pokud není potřeba získat kvantitativní informace o dávce a odezvě. Popsané doby odběrů jsou důsledkem kinetiky výskytu a vymizení mikrojader v těchto dvou tkáňových složkách;
• b. jsou-li podávány dvě dávky denně (např. dvě dávky v intervalu 24 hodin), měly by být vzorky při použití kostní dřeně odebrány jednou po 18 až 24 hodinách po poslední aplikaci a při použití periferní krve jednou po 36 až 48 hodinách po poslední aplikaci (30). Popsané doby odběrů jsou důsledkem kinetiky výskytu a vymizení mikrojader v těchto dvou tkáňových složkách;
• c. jsou-li podávány tři nebo více dávek denně (např. tři nebo více dávek v intervalu přibližně 24 hodin), měly by být vzorky při použití kostní dřeně odebrány nejpozději po 24 hodinách po poslední aplikaci a při použití periferní krve by měly být odebrány nejpozději po 40 hodinách po poslední aplikaci (31). Tato možnost aplikace vyhovuje pro kombinaci s kometovým testem (např. odběr vzorků po 2–6 hodinách po poslední aplikaci) se zkouškou mikrojader a pro integraci zkoušky mikrojader se studiemi toxicity po opakovaných dávkách. Z akumulovaných údajů vyplývá, že indukci mikrojader je možné pozorovat v těchto širších časových úsecích, pokud byly podány tři nebo více dávek (15).

Popřípadě mohou být použity jiné režimy podávání dávek nebo odběru vzorků, je-li to vědecky zdůvodněno a k usnadnění integrace s jinými zkouškami toxicity.

Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maximálního účinku po podání látky. Nejméně dvakrát denně po dobu podávání dávek by měla být provedena prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Všechna zvířata by měla být zvážena na počátku studie, nejméně jednou týdně během studií s opakovanou dávkou a při utracení. Při studiích s alespoň týdenním trváním by se alespoň jednou týdně měla změřit spotřeba krmiva. Pokud je zkoušená chemická látka podávána v pitné vodě, měla by se spotřeba vody měřit při každé výměně vody a alespoň jednou týdně. Zvířata, která vykazují neletální indikátory nadměrné toxicity, by měla být humánně utracena před uplynutím doby zkoušky (28). Za určitých okolností by mohla být sledována tělesná teplota zvířete, protože hypertermie a hypotermie indukovaná expozicí může způsobovat falešné výsledky (32) (33) (34).

Krevní vzorek by měl být odebrán ve vhodnou dobu (vhodné doby), aby mohlo být provedeno vyšetření hladiny zkoušené chemické látky v plazmě za účelem prokázání, že došlo k expozici kostní dřeně, pokud je to požadováno a pokud neexistují jiné údaje o expozici (viz odstavec 48).

Buňky kostní dřeně se obvykle získávají z femuru nebo tibie zvířat ihned po jejich humánním usmrcení. Buňky se odeberou a zavedenými metodami se preparují a obarví. Malé objemy periferní krve lze podle příslušných standardů dobrého zacházení se zvířaty získat buď postupem, který umožňuje přežití zkušebního zvířete, např. odběrem z ocasní žíly nebo jiné vhodné krevní cévy, anebo srdeční punkcí nebo odběrem vzorku z velké cévy při utracení zvířete. U erytrocytů získaných z kostní dřeně nebo z periferní krve je možné, v závislosti na metodě analýzy, buňky ihned supravitálně obarvit (16) (17) (18), připravit preparáty roztěrem a poté je obarvit pro mikroskopii nebo vhodně fixovat a obarvit pro analýzu pomocí průtokové cytometrie. Použitím barviva specifického pro DNA [např. akridinová oranž (35) nebo Hoechst 33258 a pyronin-Y (36)] se lze vyhnout některým artefaktům spojeným s použitím barviva nespecifického pro DNA. Tato výhoda nebrání použití konvenčních barviv (např. Giemsa pro analýzu pod mikroskopem). Přídavné systémy [např. celulosová kolona k odstranění buněk obsahujících jádra (37) (38)] lze použít za předpokladu, že se prokázalo, že jsou kompatibilní se systémy pro preparaci vzorků v laboratoři.

Jsou-li tyto metody použitelné, lze k identifikaci povahy mikrojader (chromozóm/chromozómový fragment) využít protilátky proti kinetochorům (39), hybridizační metodu FISH využívající pan-centromerické DNA-sondy (40), případně značení in situ pomocí primerů se specifickou pan-centromerickou vazbou spolu s vhodným kontrastním barvením DNA (41), aby bylo možné určit, zda mechanismus indukce mikrojader je důsledkem klastogenního a/nebo aneugenního působení. K rozlišení mezi klastogeny a aneugeny lze použít i jiné metody, pokud se ukázaly jako účinné.

Všechny preparáty nebo vzorky k analýze, včetně preparátů nebo vzorků pozitivní a negativní kontroly, by měly být před kterýmkoli typem analýzy označeny samostatným kódem a určeny náhodným výběrem tak, aby hodnotiteli používajícímu ruční postupy nebyly známy podmínky expozice; takové kódování není nutné při použití automatizovaných systémů hodnocení, které nejsou závislé na vizuální kontrole a nemohou být ovlivněny neobjektivností obsluhy. Pro každé zvíře se stanoví podíl nezralých erytrocytů z celkového (nezralé + zralé) množství erytrocytů, přičemž se v případě kostní dřeně použije celkově alespoň 500 erytrocytů a v případě periferní krve alespoň 2000 erytrocytů (42). U každého zvířete by se mělo vyšetřit alespoň 4000 nezralých erytrocytů na výskyt mikrojader v nezralých erytrocytech (43). Pokud z historické databáze negativních kontrol vyplývá, že střední četnost výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry v dané laboratoři je < 0,1 %, mělo by se zvážit vyhodnocení dalších buněk. Při analýze vzorků by podíl počtu nezralých erytrocytů z celkového počtu všech hodnocených erxtrocytů u exponovaných zvířat neměl být menší než 20 % podílu v kontrolách s vehikulem/rozpouštědlem při hodnocení pod mikroskopem a ne méně než přibližně 5 % podílu nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů v kontrolách s vehikulem/rozpouštědlem při hodnocení CD71 + nezralých erytrocytů cytometrickými metodami (viz odstavec 31) (29). Například ve zkoušce s kostní dření, která je hodnocena mikroskopicky, pokud by podíl nezralých erytrocytů v kostní dřeni u kontrol byl 50 %, horní limit toxicity by představoval 10 % nezralých erytrocytů.

Poněvadž slezina potkanů erytrocyty s mikrojádry zachycuje a ničí, v zájmu zachování vysoké citlivosti zkoušky při analýze periferní krve potkana se upřednostňuje omezit analýzu nezralých erytrocytů s mikrojádry na nejmladší frakci. Při použití automatizovaných analytických metod lze tyto nejnezralejší erytrocyty identifikovat na základě jejich vysokého obsahu RNA nebo vysoké hladiny transferinových receptorů (CD71+) vyjádřené na jejich povrchu (31). Z přímého srovnání různých metod barvení však vyplynulo, že uspokojivé výsledky lze získat různými metodami, včetně konvenčního zbarvení akridinovou oranží (3)(4).

Údaje pro jednotlivá zvířata by měly být zpracovány ve formě tabulky. Pro každé analyzované zvíře by měl být uveden počet vyšetřených nezralých erytrocytů, počet nezralých erytrocytů s mikrojádry a podíl nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů. Jestliže jsou myši exponovány nepřetržitě čtyři týdny nebo déle, měly by být také uvedeny údaje o počtu a podílu zralých erytrocytů s mikrojádry, byly-li shromažďovány. Uvedeny by měly být i údaje o toxicitě u zvířat a klinické příznaky.

Přijatelnost zkoušky určují tato kritéria:

• a. údaje o souběžné negativní kontrole jsou považovány za přijatelné pro přidání do historické kontrolní databáze laboratoře (viz odstavce 15–18);
• b. souběžné pozitivní kontroly nebo hodnotící kontroly by měly vyvolat odpovědi, které jsou slučitelné s odpověďmi uvedenými v historické databázi pozitivních kontrol, a měly by vyvolat statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou (viz odstavce 24–25);
• c. byl analyzován přiměřený počet dávek a buněk;
• d. kritéria pro výběr nejvyšší dávky jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 30–33.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud:

• a. alespoň jedna z exponovaných skupin vykazuje statisticky významné zvýšení výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry v porovnání se souběžnou negativní kontrolou;
• b. hodnocení pomocí vhodného statistického trend-testu alespoň v jednom čase odběru ukáže závislost tohoto nárůstu na dávce a
• c. všechny výsledky jsou mimo distribuci historických údajů o negativních kontrolách (např. mimo 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení).

Je-li v určitém konkrétním čase odběru zkoumána pouze nejvyšší dávka, je zkoušená chemická látka považována za jasně pozitivní, pokud existuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou a výsledky jsou mimo distribuci dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. mimo 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení). Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (44) (45) (46) (47). Při provádění analýzy dávky a účinku by měly být analyzovány alespoň tři skupiny exponované různé dávce. Při statistických testech by mělo být zvíře použito jako experimentální jednotka. Pozitivní výsledky mikronukleus testu znamenají, že zkoušená látka indukuje mikrojádra, jež jsou důsledkem chromozómového poškození nebo poškození mitotického aparátu erytroblastu testovaného druhu. V případě, že cílem zkoušky bylo detekovat centromery v mikrojádrech, pak indukce mikrojader obsahujících centromery (centromerickou DNA nebo kinetochory, jež ukazují na ztrátu celých chromozómů) zkoušenou chemickou látkou je důkazem, že zkoušená chemická látka je aneugenní.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, je zkoušená chemická látka považována za jasně negativní, pokud ve všech zkoumaných zkušebních podmínkách:

• a. žádná z exponovaných skupin nevykazuje statisticky významný nárůst výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry v porovnání se souběžnou negativní kontrolou;
• b. hodnocení pomocí vhodného statistického trend-testu v žádném čase odběru neukazuje nárůst účinku v závislosti na dávce;
• c. všechny výsledky spadají do rámce distribuce dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení); a
• d. došlo k expozici kostní dřeně zkoušené chemické látce (látkám).

Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (44) (45) (46) (47). Důkazy o expozici kostní dřeně zkoušené chemické látce mohou zahrnovat pokles poměru nezralých a zralých erytrocytů nebo měření hladiny zkoušené chemické látky v plazmě nebo krvi. V případě nitrožilního podání není důkazů o expozici zapotřebí. Alternativně mohou být k prokázání expozice kostní dřeně použity údaje o absorpci, distribuci, metabolismu a exkreci (ADME) získané při nezávislé studii za použití stejného způsobu expozice a se stejným druhem. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená chemická látka za podmínek zkoušky neprodukuje mikrojádra v nezralých erytrocytech druhu zvířat použitého k testování.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odpovědi se nepožaduje.

V případech, kdy odpověď není jasně negativní nebo pozitivní, a s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku (např. slabý nebo okrajový nárůst), by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším vyšetřením u provedených experimentů. V některých případech by mohlo být užitečné analyzovat více buněk nebo provést opakovaný experiment za použití upravených zkušebních podmínek.

V ojedinělých případech dokonce ani po dalším šetření nebude možné na základě daných údajů učinit závěr, zda zkoušená chemická látka přináší pozitivní či negativní výsledky, a proto bude učiněn závěr, že výsledek studie je neurčitý.

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

• Souhrn

• Zkoušená chemická látka:

  • zdroj, číslo šarže a je-li k dispozici, datum použitelnosti,

  • stabilita zkoušené chemické látky, je-li známa.

• Jednosložková látka:

  • fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti,

  • chemická identifikace, jako např. název IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné, atd.

• Vícesložková látka, UVCB a směsi:

  • charakterizovaná v co možná největší míře chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a důležitými fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek.

• Příprava zkoušené chemické látky:

  • zdůvodnění volby vehikula,

  • rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa,

  • příprava potravy, pitné vody nebo inhalačních aplikačních forem,

  • analytická stanovení aplikační formy (např. stabilita, homogenita, nominální koncentrace), jsou-li prováděna.

• Pokusná zvířata:

  • použitý druh/kmen a odůvodnění jeho použití,

  • počet, stáří a pohlaví zvířat,

  • zdroj, podmínky chovu, strava atd.,

  • metoda jednoznačného označení zvířat,

  • u krátkodobých studií: hmotnost jednotlivých zvířat na začátku a na konci zkoušky; u studií delších než jeden týden: hmotnosti jednotlivých zvířat během studie a spotřeba potravy. Mělo by být uvedeno rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnota a směrodatná odchylka pro každou skupinu.

• Zkušební podmínky:

  • údaje o pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontrole,

  • údaje ze studie pro zjištění rozsahu dávek, pokud byla provedena,

  • zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

  • podrobné údaje o přípravě zkoušené chemické látky,

  • podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,

  • zdůvodnění způsobu a trvání podávání,

  • metody k ověření, že se zkoušená chemická látka (látky) dostala (dostaly) do obecné cirkulace nebo do cílové tkáně,

  • skutečná dávka (v mg/kg tělesné hmotnosti na den) vypočítaná z koncentrace zkoušené chemické látky v potravě / pitné vodě (v ppm) a ze spotřeby, je-li to relevantní,

  • podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody.

  • způsob utracení,

  • způsob analgezie (pokud se používá),

  • podrobný popis harmonogramů aplikace a odběru vzorků a odůvodnění výběru konkrétního schématu,

  • metody přípravy preparátů,

  • postupy izolace a uchovávání vzorků,

  • metody stanovení toxicity,

  • kritéria hodnocení mikrojader v nezralých erytrocytech,

  • počet buněk analyzovaných u každého zvířete při stanovení četnosti výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry a při stanovení poměru mezi nezralými a zralými erytrocyty,

  • kritéria přijatelnosti studie,

  • případně metody, např. využití protilátek proti kinetochorům nebo sond DNA se specifickou vazbou na centromery, použité k určení toho, zda mikrojádra obsahují celé chromozómy nebo fragmenty chromozómů, pokud to připadá v úvahu.

• Výsledky:

  • stav zvířat před zkouškou a během zkoušky, včetně známek toxicity,

  • podíl nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů,

  • počet nezralých erytrocytů s mikrojádry uvedený samostatně pro každé zvíře,

  • střední hodnota ± směrodatná odchylka počtu nezralých erytrocytů s mikrojádry v každé skupině,

  • podle možnosti závislost účinku na dávce,

  • případné statistické analýzy a metody,

  • údaje o souběžné negativní a pozitivní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

  • dosavadní údaje o negativních a pozitivních kontrolách s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami a 95 % rozmezím distribuce a rovněž časové období, na které se údaje vztahují, a počet kontrolních souborů použitých pro distribuci,

  • údaje dokládající, že došlo k expozici kostní dřeně,

  • popisné údaje udávající, zda mikrojádra obsahují celé chromozómy nebo fragmenty chromozómů, pokud to bylo zjišťováno,

  • splněná kritéria pro pozitivní nebo negativní odpověď.

• Diskuze výsledků.

• Závěr.

• Odkazy.

• 1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
• 2) Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, s. 10-30.
• 3) MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, s. 92-107.
• 4) Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, s. 83-91.
• 5) Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, s. 139-145.
• 6) Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, s. 65-73.
• 7) Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, s. 149-154.
• 8) Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, s. 153-155.
• 9) Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, s. 187-190.
• 10) Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, s. 9-15.
• 11) Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, s. 61-118.
• 12) Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, s. 29-80.
• 13) MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, s. 555-558.
• 14) MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, s. 103-112.
• 15) MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, s. 513-522.
• 16) Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, s. 245-249.
• 17) CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, s. 83-98.
• 18) CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, s. 153-159.
• 19) Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, s. 239-273.
• 20) Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, s. 45-50.
• 21) Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test–study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, s. 419-424.
• 22) Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, s. 84-100.
• 23) Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
• 24) Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 87–90.
• 25) Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 108-120.
• 26) Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, s. 293-304.
• 27) Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, s. 313-319.
• 28) OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
• 29) LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, s. 222-228.
• 30) Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/– 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, s. 313-319.
• 31) Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, s. 234-252.
• 32) Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, s. 79-83.
• 33) Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, s. 7-14.
• 34) Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, s. 120-127.
• 35) Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, s. 241-247.
• 36) MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, s. 269-275.
• 37) Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, s. 91-104.
• 38) Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, s. 121-126.
• 39) Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, s. 411-415.
• 40) Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, s. 297-302.
• 41) Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, s. 99-104.
• 42) Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, s. 97-99.
• 43) OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
• 44) Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 115-141.
• 45) Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 184-232.
• 46) Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, s. 49-52.
• 47) Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, s. 233-241.

Při tomto pokusu se na každé úrovni koncentrace testuje minimálně 5 samců a 5 samic a výsledkem je uspořádání s použitím minimálně 40 zvířat (20 samců a 20 samic plus příslušné pozitivní kontroly).

Tento pokus, který je jedním z nejjednodušších faktoriálních pokusů, je rovnocenný dvoucestné analýze rozptylu, přičemž hlavními prvky jsou úroveň koncentrace a pohlaví. Údaje je možné analyzovat pomocí mnoha standardních statistických softwarových balíčků, např. SPSS, SAS, STATA, Genstat a také pomocí programu R.

Analýza dělí variabilitu v souboru údajů na variabilitu mezi pohlavími, variabilitu mezi úrovněmi koncentrace a variabilitu interakce mezi pohlavími a koncentracemi. Každý z těchto znaků se testuje oproti odhadu variability u replicitních zvířat ve skupinách zvířat stejného pohlaví, jimž je podávána stejná koncentrace látky. Veškeré podrobnosti základní metodiky jsou dostupné v mnoha standardních učebnicích statistiky (viz odkazy) a v „nápovědě“ statistických programů.

Analýza se provádí zkoumáním znaku interakce pohlaví x koncentrace v tabulce ANOVA(Statistikové, kteří používají metodu modelování, např. pomocí obecných lineárních modelů (GLM), mohou k této analýze přistupovat různým, byť srovnatelným způsobem, ale nebudou nutně odvozovat tradiční tabulku ANOVA, což se datuje zpět k algoritmickým postupům k výpočtu statistik vyvinutým před érou počítačů.). Neexistuje-li významný znak interakce, kombinované hodnoty za obě pohlaví nebo za všechny úrovně koncentrace poskytují validní statistické testy variability mezi úrovněmi založené na zkoumání kumulovaného znaku vnitroskupinové variability pomocí analýzy ANOVA.

Analýza pokračuje rozdělením odhadu variability mezi koncentracemi na kontrasty, což zajišťuje test na lineární a kvadratické kontrasty odpovědí na všech úrovních koncentrace. Pokud existuje významná interakce pohlaví x koncentrace, lze tento znak také rozdělit na lineární a kvadratický člen kontrastů interakce pohlaví. Pomocí těchto znaků se testuje, zda jsou odpovědi na koncentraci u obou pohlaví paralelní, nebo zda je odpověď u každého pohlaví odlišná.

Odhad kumulované vnitroskupinové variability může být použit k párovému testování rozdílu mezi středními hodnotami. Tato srovnání by mohla být provedena mezi středními hodnotami u obou pohlaví a mezi středními hodnotami u různých úrovní koncentrace, např. za účelem porovnání s úrovněmi negativní skupiny. V případech, kdy existuje významná interakce, lze provádět srovnání mezi středními hodnotami při různých koncentracích v rámci jednotlivých pohlaví nebo mezi středními hodnotami u pohlaví při stejné koncentraci.

Existuje množství učebnic statistiky, které se zabývají teorií, uspořádáním, metodikou, analýzou a interpretací faktoriálních pokusů od nejjednodušších dvoufaktorových analýz až po složitější formy používané v metodice „experimentálního uspořádání“. Následující seznam není vyčerpávající. V některých pracích jsou uvedeny vypracované příklady srovnatelných uspořádání, v některých případech i s kódem pro provádění analýz pomocí různých počítačových programů.

• Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

• Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

• Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

• Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

• Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

• Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

• Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Není uvedena.

Různé haploidní a diploidní kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae mohou být použity ke stanovení chemicky indukovaných genových mutací za přítomnosti metabolické aktivace nebo bez ní.

Jsou využívány přímé mutační systémy u haploidních kmenů, jako měření mutací z červených mutantů vyžadujících adenin (ade-1, ade-2) na dvojité bílé mutanty vyžadující adenin, a selektivní systémy, jako je indukce rezistence vůči kanavinu a cykloheximidu.

V nejlépe ověřeném reverzním mutačním systému se využívá haploidního kmene XV 18514C s nonsense mutacemi (ochre) ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 and trp 5-48, které jsou vratné působením mutagenů vyvolávajících záměnu bází, indukujících mutace ve specifickém místě nebo ochre-supresorové mutace. XV 185-14C nese rovněž marker his 1-7 missense mutaci, revertovanou převážně mutacemi v dalším místě, a marker hom 3-10, který je revertován posunovými mutageny.

U diploidních kmenů S. cerevisiae je jediným široce využívaným kmenem D₇, který je homozygotní pro ilv 1-92.

Nejsou stanovena.

Roztoky zkoušených chemických látek a kontrol se připraví těsně před zkoušením za použití vhodného vehikula. U organických látek, které nejsou rozpustné ve vodě, se použije nejvýše 2 % (obj.) roztok v organických rozpouštědlech, jako jsou ethanol, aceton nebo dimethylsulfoxid (DMSO). Konečná koncentrace vehikula nesmí významně ovlivnit životaschopnost buněk a charakteristiky růstu.

Buňky se exponují zkoušeným chemickým látkám jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného vnějšího metabolického aktivačního systému.

Nejčastěji používaným systémem je kofaktorem dotovaná postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců, upravovaná činidly indukujícími enzymy. Použití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí nebo postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.

Nejpoužívanější kmeny pro studie genových mutací jsou haploidní kmen XV 185-14C a diploidní kmen D₇. Jiné kmeny mohou být rovněž vhodné.

Pro určení počtu přežívajících a mutovaných buněk se použijí vhodná kultivační média.

Souběžně se nasadí pozitivní kontroly, neexponované kontroly a kontroly s rozpouštědlem. Pro každou specifickou mutační změnu se použijí odpovídající pozitivní kontrolní chemické látky.

Použije se nejméně pět dostatečně odstupňovaných koncentrací zkoušené chemické látky. U toxických látek nemá nejvyšší zkoušená koncentrace snižovat přežití na méně než 5–10 %. Látky, které jsou relativně nerozpustné ve vodě, se za použití vhodných postupů zkouší až k mezi rozpustnosti. Nejvyšší koncentrace u netoxických látek dobře rozpustných ve vodě se určí případ od případu.

Misky se inkubují v temnu čtyři až sedm dní při 28 až 30 ^oC.

Použijí se subkultury s četností spontánních mutací v obvyklém přijatelném rozmezí.

Pro stanovení počtu prototrofních buněk vznikajících genovými mutacemi a pro stanovení životaschopnosti buněk se použijí nejméně tři misky na jednu koncentraci. U experimentů s markery, jako je hom 3-10 s nízkou mutační rychlostí, se počet misek zvýší, aby byly získány statisticky relevantní údaje.

Expozice kmenů S. cerevisiae se obvykle provede v kapalném prostředí a zahrnuje buď buňky ve stacionární fázi, nebo rostoucí buňky. Výchozí experimenty se provedou na rostoucích buňkách: 1 – 5 × 10⁷ buněk/ml se za protřepávání vystaví zkoušené látce na dobu až 18 hodin při 28 až 37 ^oC; podle potřeby se v průběhu expozice přidá odpovídající množství metabolické aktivační směsi. Na konci expoziční doby se buňky centrifugují, promyjí a naočkují na vhodné kultivační médium. Po inkubaci se na miskách spočítají přežívající buňky a buňky s indukovanými genovými mutacemi. Jestliže je první experiment negativní, provede se druhý experiment s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první experiment pozitivní, potvrdí se vhodným nezávislým experimentem.

Údaje se zpracují v tabulkové formě a uvede se počet kolonií, počet mutací, četnost přežívajících buněk a četnost mutací. Všechny výsledky se potvrdí nezávislým experimentem. Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:

• použitý kmen,

• zkušební podmínky: buňky ve stacionární fázi nebo rostoucí buňky, složení médií, teplota a délka inkubace, metabolický aktivační systém,

• podmínky expozice: úrovně expozice, postup a délka expozice, teplota při expozici, pozitivní a negativní kontroly,

• počet kolonií, počet mutantů, četnost přežívajících buněk a četnost mutací, podle možnosti vztah dávky a účinku, statistické hodnocení údajů,

• diskuse o výsledcích,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Žádné.

Mitotickou rekombinaci u Saccharomyces cerevisiae lze detekovat mezi geny (obecněji mezi genem a jeho centromerou) a uvnitř genů. První případ je nazýván mitotické překřížení a vytváří reciproční produkty, zatímco druhý případ je většinou nereciproční a nazývá se genová konverze. Překřížení se obecně stanoví na základě tvorby recesivních homozygotních kolonií nebo sektorů vzniklých u heterozygotních kmenů, zatímco genová konverze se stanoví na základě tvorby prototrofních revertant vzniklých u auxotrofního heteroalelického kmene, který nese dvě různé defektní alely téhož genu. Nejčastěji používanými kmeny pro detekci mitotické genové konverze jsou D₄ (heteroalelický v ade 2 a trp 5) D₇ (heteroalelický v trp 5) BZ₃₄ (heteroalelický v arg 4) a JDl (heteroalelický v his 4 a trp 5). Mitotické překřížení produkující červené a růžové homozygotní sektory lze stanovit u D₅ nebo D₇ (který slouží rovněž k měření mitotické genové konverze a reverzních mutací v ilv 1-92 oba kmeny jsou heteroalelické pro komplementární alely ade 2.

Nejsou stanovena.

Roztoky zkoušených chemických látek a kontrol nebo referenčních sloučenin se připraví těsně před zkoušením za použití vhodného vehikula. U organických látek, které nejsou rozpustné ve vodě, se použije nejvýše 2 % (obj.) roztok v organických rozpouštědlech, jako jsou ethanol, aceton nebo dimethylsulfoxid (DMSO). Konečná koncentrace vehikula nesmí významně ovlivnit životaschopnost buněk a charakteristiky růstu.

Buňky se exponují zkoušeným chemickým látkám jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného vnějšího metabolického aktivačního systému. Nejčastěji používaným systémem je kofaktorem dotovaná postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců, upravovaná činidly indukujícími enzymy. Použití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí nebo postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.

Nejpoužívanějšími kmeny jsou diploidní kmeny D₄, D₅, D₇ a JD1. Jiné kmeny mohou být rovněž vhodné.

Pro určení počtu přežívajících buněk a četnosti mitotické rekombinace se použijí vhodná kultivační média.

Souběžně se nasadí pozitivní kontroly, neexponované kontroly a kontroly s rozpouštědlem. Pro každou specifickou rekombinační změnu se použijí odpovídající pozitivní kontrolní chemické látky.

Použije se nejméně pět dostatečně odstupňovaných koncentrací zkoušené chemické látky. Mezi faktory, které mají být zohledněny, patří cytotoxicita a rozpustnost. Nejnižší koncentrace nesmí mít vliv na životaschopnost buněk. U toxických látek nemá nejvyšší zkoušená koncentrace snižovat přežití na méně než 5–10 %. Látky, které jsou relativně nerozpustné ve vodě, se za použití vhodných postupů zkouší až k mezi rozpustnosti. Nejvyšší koncentrace u netoxických látek dobře rozpustných ve vodě se určí případ od případu.

Buňky mohou exponovány zkoušené chemické látce buď ve stacionární fázi, nebo během růstu po dobu až 18 hodin. Dlouhodobě exponované kultury však mají být mikroskopicky kontrolovány na tvorbu spor, jejichž přítomnost zkoušku znehodnocuje.

Misky se inkubují v temnu čtyři až sedm dní při 28 až 30 ^oC. Misky použité pro průkaz červených a růžových homozygotních sektorů tvořených mitotickým překřížením se před počítáním umístí v chladničce (při přibližně 4 ^oC) na další 1–2 dny, aby se mohly utvořit odpovídající pigmentované kolonie.

Použijí se subkultury s četností spontánní mitotické rekombinace v obvyklém přijatelném rozmezí.

Pro stanovení počtu prototrofních buněk vznikajících mitotickou genovou konverzí a pro stanovení životaschopnosti buněk se použijí nejméně tři misky na jednu koncentraci. Pro stanovení recesivní homozygocity tvořené mitotickým překřížením se počet misek zvýší, aby bylo dosaženo dostatečného počtu kolonií.

Expozice kmenů S. cerevisiae se obvykle provede v kapalném prostředí a zahrnuje buď buňky ve stacionární fázi, nebo rostoucí buňky. Výchozí experimenty se provedou na rostoucích buňkách. 1 – 5 × 10⁷ buněk/ml se za protřepávání vystaví zkoušené látce na dobu až 18 hodin při 28 až 37 ^oC; podle potřeby se v průběhu expozice přidá odpovídající množství metabolické aktivační směsi.

Na konci expoziční doby se buňky centrifugují, promyjí a naočkují na vhodné kultivační médium. Po inkubaci se na miskách spočítají přežívající buňky a počet indukcí mitotické rekombinace.

Jestliže je první experiment negativní, provede se druhý experiment s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první experiment pozitivní, potvrdí se vhodným nezávislým experimentem.

Údaje se zpracují v tabulkové formě a uvede se počet kolonií, počet rekombinací, četnost přežívajících buněk a četnost rekombinací.

Výsledky se potvrdí nezávislým experimentem.

Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:

• použitý kmen,

• zkušební podmínky: buňky ve stacionární fázi nebo rostoucí buňky, složení médií, teplota a délka inkubace, metabolický aktivační systém,

• podmínky expozice: úroveň expozice, postup a délka expozice, teplota při expozici, pozitivní a negativní kontroly,

• počet kolonií, počet rekombinací, četnost přežívajících buněk a četnost rekombinací, podle možnosti vztah dávky a účinku, statistické vyhodnocení údajů,

• diskuse o výsledcích,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Není uvedena.

Zkouška na neplánovanou syntézu DNA (UDS) umožňuje měřit reparační syntézu DNA po vyštěpení a nahrazení části DNA obsahující oblast poškození indukovaného chemickými nebo fyzikálními faktory. Zkouška je založena na inkorporaci značeného thymidinu (³H-TdR) do DNA savčích buněk, které nejsou v S-fázi buněčného cyklu. Inkorporace ³H-TdR je stanovena autoradiograficky nebo kapalinovou scintilační spektrometrií (LSC) DNA exponovaných buněk. Savčí buněčné kultury, pokud ne přímo primární buněčné kultury hepatocytů potkana, se exponují zkoušené látce jak v přítomnosti, tak i v nepřítomnosti vnějšího metabolického aktivačního systému. UDS může být také stanovena in vivo.

Nejsou stanovena.

Zkoušené chemické látky a kontroly nebo referenční látky se připraví v kultivačním médiu nebo se rozpustí nebo suspendují ve vhodných vehikulech a poté se pro účely stanovení zředí kultivačním médiem. Konečná koncentrace vehikula v kultuře nesmí ovlivňovat životaschopnost buněk.

Pro stanovení se použijí primární kultury hepatocytů potkana, lidských lymfocytů, nebo zavedených buněčných linií (lidských diploidních fibroblastů).

Buňky se exponují zkoušené chemické látce jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

Pro každý experimentální bod je potřeba nejméně dvou buněčných kultur pro autoradiografii a šesti kultur (nebo méně, jeli to vědecky zdůvodnitelné) pro metodu stanovení UDS pomocí LSC.

Do každého experimentu se nasadí souběžné pozitivní a negativní (neexponované a/nebo s vehikulem) kontroly v přítomnosti i v nepřítomnosti metabolického aktivačního systému.

Příkladem pozitivní kontroly pro stanovení s hepatocyty potkana je 7,12-dimethylbenzoanthracen (7,12-DMBA) nebo N-(fluoren-2-yl)acetamid (2-AAF). Příkladem pozitivní kontroly pro zavedené buněčné linie jak pro autoradiografii, tak i pro LSC prováděné bez metabolické aktivace je 4-nitrochinolin-N-oxid (4-NQO); N-nitrosodimethylamin je příkladem chemické látky pro pozitivní kontrolu při použití metabolického aktivačního systému.

Použije se několik koncentrací zkoušené látky v rozsahu přiměřeném pro stanovení odezvy. Nejvyšší koncentrace musí vyvolávat cytotoxické účinky. Látky, které jsou relativně nerozpustné ve vodě, se zkouší až k mezi rozpustnosti. Nejvyšší koncentrace u netoxických látek dobře rozpustných ve vodě se určí případ od případu.

Pro udržování kultur se použijí vhodná kultivační média, koncentrace CO₂, teplota a vlhkost. U zavedených buněčných linií musí být pravidelně kontrolováno, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty.

U primárních kultur hepatocytů se nepoužívá metabolický aktivační systém. Zavedené buněčné linie a lymfocyty se exponují zkoušené látce za přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

Zavedené buněčné linie se pomnoží ze zásobních kultur (trypsinací nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), naočkují se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubují se při teplotě 37 ^oC.

Krátkodobé kultury hepatocytů potkana se připravují tak, že se umožní, aby se čerstvě izolované hepatocyty přichytily ve vhodném médiu k povrchu kultivační nádoby.

Kultury lidských lymfocytů se založí vhodnou metodou.

Čerstvě izolované hepatocyty potkana se vhodnou dobu exponují zkoušené látce v médiu obsahujícím ³H-TdR. Po ukončení expozice se médium z buněk odstraní, buňky se promyjí, fixují a vysuší. Preparáty se ponoří do autoradiografické emulze (může být použita také sloupávací fólie), emulze se exponuje, vyvolá, obarví a vyhodnotí.

Autoradiografické techniky: Buněčné kultury se vhodnou dobu exponují zkoušené látce a poté se vystaví ³H-TdR. Doba expozice je závislá na druhu zkoušené látky, na aktivitě metabolického systému a na typu buněk. K zachycení vrcholu UDS je třeba ³H-TdR přidat současně se zkoušenou látkou nebo několik minut po expozici. Výběr mezi těmito postupy závisí na možné interakci mezi zkoušenou látkou a ³H-TdR. K rozlišení UDS od semikonzervativní replikace DNA se používá médium deficientní na arginin, nízký obsah séra nebo hydroxymočovina v kultivačním médiu, což působí inhibici semikonzervativní replikace DNA.

Stanovení UDS pomocí LSC: Před expozicí zkoušené látce se zablokuje vstup buněk do S-fáze, jak bylo uvedeno výše; buňky se poté exponují zkoušené látce způsobem popsaným pro autoradiografii. Na konci kultivace se DNA extrahuje z buněk a stanoví se celkový obsah DNA a rozsah zabudování ³H-TdR.

Použijí-li se ve výše uvedených metodách lidské lymfocyty, je v nestimulovaných kulturách suprese semikonzervativní replikace DNA zbytečná.

Při vyhodnocování UDS v buněčné kultuře se jádra v S-fázi nehodnotí. Pro každou koncentraci se hodnotí nejméně 50 buněk. Preparáty se před hodnocením opatří kódem. V každém preparátu se hodnotí několik náhodně vybraných vzájemně vzdálených polí. Množství zabudovaného ³H-TdR v cytoplazmě se určí v zóně o velikosti tří jader v cytoplazmě každé hodnocené buňky.

Pro stanovení UDS pomocí LSC se použije přiměřený počet kultur pro každou koncentraci a pro kontroly.

Všechny výsledky se potvrdí nezávislým experimentem.

Údaje se zpracují v tabulkové formě.

Rozsah zabudování ³H-TdR do cytoplazmy a počet zrn nalezených mimo buněčné jádro se zaznamenají odděleně.

Distribuci rozsahu zabudování ³H-TdR do cytoplazmy a počet zrn v jádře lze popsat střední hodnotou, mediánem a modem.

U LSC se rozsah zabudování ³H-TdR zaznamená v dpm/μg DNA. Distribuci zabudování lze popsat střední hodnotou dpm/μg DNA a směrodatnou odchylkou.

Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:

• použité buňky, hustota a počet pasáží v době expozice kultury, počet buněčných kultur,

• metody použité k udržování buněčné kultury, včetně média, teploty a koncentrace CO₂,

• zkoušená látka, vehikulum, koncentrace a zdůvodnění výběru koncentrací pro zkoušku,

• podrobné údaje o metabolickém aktivačním systému,

• plán expozice,

• pozitivní a negativní kontroly,

• použitá autoradiografická technika,

• postupy použité k blokování vstupu buněk do S-fáze,

• postupy použité k extrakci DNA a ke stanovení celkového obsahu DNA u metody LSC,

• vztah dávka/odezva, jeli to možné,

• statistické vyhodnocení,

• diskuse o výsledcích,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Žádné.

Stanovení výměny sesterských chromatid (SCE) je krátkodobou zkouškou zaměřenou na detekci reciproční výměny DNA mezi dvěma sesterskými chromatidami replikujícího se chromozomu. SCE představuje vzájemnou výměnu produktů replikace DNA v lokusech jevících se jako homogenní. Proces výměny pravděpodobně zahrnuje zlom a opětovné spojení DNA, ačkoliv zatím existuje málo znalostí o molekulárním základu tohoto procesu. Detekce SCE vyžaduje rozdílné značení sesterských chromatid; toho se dosahuje zabudováním bromdeoxyuridinu (BrdU) do chromosomální DNA na dobu dvou buněčných cyklů.

Savčí buňky in vitro se exponují zkoušené látce podle potřeby za přítomnosti i nepřítomnosti savčího vnějšího metabolického aktivačního systému a kultivují se po dobu dvou replikačních cyklů v médiu obsahujícím BrdU. Ke konci kultivace se buňky zpracují inhibitorem dělicího vřeténka (např. kolchicinem), aby se akumulovaly buňky v C-metafázi mitózy; kultury se sklidí a připraví se preparáty pro analýzu chromozomů.

Nejsou stanovena.

• Pro stanovení se mohou používat primární kultury (lidské lymfocyty) nebo zavedené buněčné linie (např. ovariální buňky křečka čínského). U buněk musí být pravidelně kontrolováno, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty.

• Použijí se vhodná kultivační média a inkubační podmínky (teplota, kultivační nádoby, koncentrace CO₂ a vlhkost).

• Před exponováním buněk se zkoušené látky rozpustí nebo suspendují v kultivačním médiu nebo ve vhodných vehikulech. Konečná koncentrace vehikula v kultuře nesmí ovlivnit životaschopnost buněk nebo rychlost růstu; vliv na četnost SCE se sleduje kontrolou s rozpouštědlem.

• Buňky se exponují zkoušené látce jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vnějšího savčího metabolického aktivačního systému. Pokud se použijí buněčné typy s vnitřní metabolickou aktivitou, mělo by být známo, že úroveň a vlastnosti této aktivity jsou vhodné pro zkoušenou třídu chemických látek.

Pro každý experimentální bod se použijí nejméně dvě kultury.

Do každého experimentu se nasadí pozitivní kontroly využívající jak přímo působící chemickou látku, tak látku vyžadující metabolickou aktivaci; rovněž se použije kontrola s vehikulem.

Příkladem pozitivní kontroly mohou být tyto látky:

• přímo působící látky:

  • ethyl-methansulfonát,

• nepřímo působící látky:

  • cyklofosfamid.

Podle potřeby se zařadí další pozitivní kontrola ze stejné třídy chemických látek, jako je zkoušená látka.

Zkoušejí se nejméně tři dostatečně odstupňované koncentrace zkoušené látky. Nejvyšší koncentrace musí vyvolat významné toxické účinky, avšak zároveň musí umožnit přiměřenou replikaci buněk. Látky, které jsou relativně nerozpustné ve vodě, se zkouší až k mezi rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace u netoxických látek dobře rozpustných ve vodě se určí případ od případu.

Zavedené buněčné linie se pomnoží ze zásobní kultury (např. trypsinací nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), naočkují se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubují se při teplotě 37 ^oC. Pro jednovrstevné kultury se stanoví takový počet buněk v kultivační nádobě, aby v době sklizně nepřesáhly 50 % konfluenci. Lze také použít suspensní kultury. Lidské lymfocytární kultury se připraví vhodnými postupy z heparinizované krve a inkubují při teplotě 37 ^oC.

Buňky v exponenciální fázi růstu se vhodnou dobu exponují zkoušené látce; ve většině případů stačí jedna až dvě hodiny, avšak expozice může být v určitých případech prodloužena až na dva úplné buněčné cykly. Buňky, které nemají dostatečnou vnitřní metabolickou aktivitu, musí být exponovány zkoušené chemické látce za přítomnosti i za nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expoziční doby se z buněk vymyje zkoušená látka a buňky se kultivují v přítomnosti BrdU po dva replikační cykly. Je možné rovněž exponovat buňky současně zkoušené látce a BrdU po dobu dvou buněčných cyklů.

Lidské lymfocytární kultury se exponují, dokud jsou v semisynchronizovaném stavu.

Buňky se analyzují v druhém mitotickém dělení po expozici, přičemž se zajistí, aby expozice chemické látce proběhla v nejcitlivějším stádiu buněčného cyklu. Všechny kultury s přidaným BrdU se udržují až do sklizně v temnu nebo za slabého osvětlení žárovkou, aby se minimalizovala fotolýza DNA, ve které je zabudován BrdU.

Jednu až čtyři hodiny před sklizní buněk se kultury zpracují inhibitorem dělicího vřeténka (např. kolchicinem). Každá kultura se sklidí a samostatně zpracuje pro přípravu preparátů pro analýzu chromosomů.

Preparáty pro analýzu chromosomů se připraví standardními cytogenetickými technikami. Barvení preparátů ke znázornění SCE lze provést několika technikami (např. fluorescenční metodou plus Giemsa).

Počet analyzovaných buněk závisí na spontánní četnosti SCE v kontrole. Obvykle se hodnotí nejméně 25 dobře rozprostřených metafází na kulturu. Preparáty se před analýzou opatří kódem. V lidských lymfocytech se analyzují pouze metafáze s 46 centromerami. U zavedených linií se analyzují pouze metafáze, které se liší o ± 2 centromery od modálního počtu centromer. Je třeba stanovit, zda se za SCE považuje změna v barvení v oblasti centromery. Všechny výsledky se potvrdí nezávislým experimentem.

Údaje se zpracují v tabulkové formě. Pro všechny exponované kultury a kontroly se samostatně zaznamená počet SCE pro každou metafázi a počet SCE/chromosom pro každou metafázi.

Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:

• použité buňky, metody udržování buněčné kultury,

• zkušební podmínky: složení média, koncentrace CO₂, koncentrace zkoušené látky, použité vehikulum, inkubační teplota, inkubační doba, délka expozice, použitý inhibitor mitózy, jeho koncentrace a délka jeho působení, typ použitého savčího metabolického aktivačního systému, pozitivní a negativní kontroly,

• počet kultur na každý experimentální bod,

• podrobné údaje o způsobu přípravy preparátů,

• počet analyzovaných metafází (odděleně pro každou kulturu),

• střední hodnota počtu SCE/buňku a SCE/chromosom (odděleně pro každou kulturu),

• kritéria hodnocení SCE,

• zdůvodnění výběru koncentrací,

• vztah dávka/odezva, jeli to možné,

• statistické vyhodnocení,

• diskuse o výsledcích,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Žádné.

Zkouška na recesivní letální mutace vázané na pohlaví (SLRL) u Drosophila melanogaster umožňuje detekci mutací, a to jak bodových mutací, tak i malých delecí v zárodečných buňkách hmyzu. Tato zkouška je zkouškou na přímé mutace vhodnou pro screening v přibližně 800 lokusech chromosomu X; to představuje asi 80 % všech lokusů chromosomu X. Chromosom X představuje přibližně jednu pětinu celého haploidního genomu.

Mutace v chromosomu X Drosophila melanogaster se fenotypicky projeví u samců nesoucích mutovaný gen. Když je mutace letální v hemizygotním stavu, lze na její přítomnost usuzovat z absence jednoho ze dvou typů samčích potomků, kteří se obvykle rodí heterozygotní samici. Ve zkoušce na SLRL se tyto skutečnosti využívají prostřednictvím speciálně označených a uspořádaných chromosomů.

Nejsou stanovena.

Mohou být použiti samci dobře definované divoké linie a samice linie Muller-5. Mohou být použity i jiné vhodně značené linie samic s vícenásobnou inversí chromosomu X.

Zkoušené látky se rozpustí ve vodě. Látky, které jsou nerozpustné ve vodě, se mohou rozpustit nebo suspendovat ve vhodných vehikulech (např. ve směsi ethanolu a Tween-60 nebo 80) a před aplikací se dále ředí vodou nebo fyziologickým roztokem. Použití dimethylsulfoxidu (DMSO) jako vehikula je třeba se vyhnout.

Citlivost a síla zkoušky se stanoví předem. Četnost spontánních mutací pozorovaná v příslušné kontrolní skupině významně ovlivní počet exponovaných chromosomů, které je třeba analyzovat.

Expozice zkoušené látce může být orální, injekční nebo může jít o expozici plynům nebo parám. Při orální aplikaci (zkrmování) se zkoušená látka podává v cukerném roztoku. Podle potřeby lze zkoušenou látku rozpustit v 0,7 % roztoku NaCl a injekčně nastříknout do hrudní nebo břišní dutiny.

Nasadí se negativní kontroly (s vehikulem) a pozitivní kontroly. Jsou-li k dispozici vhodné laboratorní údaje z dřívějších pokusů s kontrolami, není třeba nasazovat žádné souběžné kontroly.

Použijí se tři úrovně expozice. Pro předběžný orientační odhad se použije jedna úroveň expozice rovnající se buď maximální tolerované koncentraci, nebo úrovni vyvolávající známky toxicity. U netoxických látek se použije nejvyšší dosažitelná koncentrace.

Samci divokého typu (ve stáří 3–5 dnů) se exponují zkoušené látce a jednotlivě jsou připouštěni k více dosud nepřipuštěným samicím z linie Muller-5 nebo z jiné vhodně značené linie (s vícenásobnou inverzí chromosomu X). Samice se vymění za čerstvé dosud nepřipuštěné samice každé dva až tři dny, aby se pokryl celý buněčný cyklus zárodečných buněk. U potomků těchto samic se sleduje letální účinek odpovídající účinkům na zralé spermie, na spermatidy ve středním nebo pozdním stadiu, na časné spermatidy, spermatocyty a spermatogonie v době expozice.

Heterozygotní samice generace F₁ narozené z tohoto křížení se dále kříží jednotlivě (tj. jedna samice/zkumavku) se svými bratry. V generaci F₂ se v každé kultuře zaznamená absence samců divokého typu. Jestliže se v kultuře F₁ rodí samice nesoucí letální mutaci v rodičovském chromosomu X (tj. nejsou nalezeni žádní samci s ovlivněným chromosomem), testují se dcery těchto samic se stejným genotypem, aby se zjistilo, zda se letalita opakuje v příští generaci.

Údaje se zpracují v tabulkové formě; uvede se počet hodnocených chromosomů X, počet afertilních samců a počet chromosomů s letální mutací pro každou koncentraci, pro každé období křížení a pro každého exponovaného samce. Zaznamenává se počet klastrů různých velikostí na každého samce. Výsledky se potvrdí nezávislým experimentem.

Zkouška na recesivní letální mutace vázané na pohlaví se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami. Nahromadění recesivních letálních mutací vzniklých v jednom samci se zpracuje a zhodnotí vhodným statistickým způsobem.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:

• zdroje: použité linie nebo kmeny druhu Drosophila, věk hmyzu, počet exponovaných samců, počet sterilních samců, počet vzniklých kultur F₂, počet kultur F₂ bez potomků, počet zjištěných chromosomů nesoucích letální mutaci v každém stadiu zárodečných buněk,

• kritéria pro velikost exponovaných skupin,

• podmínky zkoušky: podrobný popis plánu expozice a odběru vzorků, úrovně expozice, údaje o toxicitě, podle potřeby negativní kontroly (s rozpouštědlem) a pozitivní kontroly,

• kritéria hodnocení letálních mutací,

• vztah expozice/účinek, jeli to možné,

• hodnocení údajů,

• diskuse o výsledcích,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Žádné.

Kultury savčích buněk lze použít pro detekci fenotypických změn in vitro indukovaných chemickými látkami spojovanými s maligní transformací in vivo. Často používanými buňkami jsou C3H10T_1/2, 3T3, SHE, buňky potkanů Fischer a zkouška se opírá o změny buněčné morfologie, tvorbu ložisek nebo změny v uchycení v polotuhém agaru. Méně často se používají systémy detekující ostatní fyziologické či morfologické změny v buňkách po expozici karcinogenním chemickým látkám. Žádný výsledek zkoušky in vitro není důkazem karcinogenity. Některé systémy jsou schopny detekovat promotory tumorů. Cytotoxicita se zjistí měřením účinku zkoušeného materiálu na schopnost vytvářet kolonie (účinnosti klonování) nebo rychlosti růstu kultur. Stanovením cytotoxicity lze zjistit, zda byla expozice zkoušené látce toxikologicky relevantní, nelze ji však použít k určení četnosti transformace ve všech experimentech, protože u některých mohlo dojít k prodloužení inkubace nebo k replatingu.

Nejsou stanovena.

Pro různé zkoušky transformace existuje řada použitelných buněčných linií a primárních kultur. Experimentátor musí zajistit, že buňky použité v testu transformace vykazují příslušné fenotypické změny po expozici známým karcinogenům a že zkouška používaná v jeho laboratoři je ověřena a že je dokumentována její validita a spolehlivost.

Použitá média a experimentální podmínky musí být vhodné pro použitou zkoušku na transformace.

Před exponováním buněk je možné zkoušené látky rozpustit nebo suspendovat v kultivačním médiu nebo ve vhodných vehikulech. Konečná koncentrace vehikula v kultuře nesmí ovlivnit životaschopnost buněk, rychlost růstu nebo výskyt transformace.

Buňky by měly být vystaveny zkoušené látce, a to s vhodnou metabolickou aktivací a bez ní. Pokud se použijí buněčné typy s vnitřní metabolickou aktivitou, mělo by být známo, že úroveň a vlastnosti této aktivity jsou vhodné pro zkoušenou třídu chemických látek.

Do každého experimentu se nasadí pozitivní kontroly využívající jak přímo působící chemickou látku, tak látku vyžadující metabolickou aktivaci; rovněž se použije kontrola s vehikulem.

Příkladem pozitivní kontroly mohou být tyto látky:

• přímo působící látky:

  • ethyl-methansulfonát,

  • propano-3-lakton,

• látky vyžadující metabolickou aktivaci:

  • N-(fluoren-2-yl)acetamid,

  • 4-dimethylaminoazobenzen,

  • 7,12-dimethylbenzoanthracen.

Podle potřeby se zařadí další pozitivní kontrola ze stejné třídy chemických látek, jako je zkoušená látka.

Použije se několik koncentrací zkoušené látky. Tyto koncentrace musí vyvolávat toxický účinek závislý na koncentraci, přičemž nejvyšší koncentrace má vést k nízké úrovni přežití buněk a úroveň přežití buněk při nejnižší koncentraci má být přibližně stejná jako u negativní kontroly. Látky, které jsou relativně nerozpustné ve vodě, se zkouší až k mezi rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace u netoxických látek dobře rozpustných ve vodě se určí případ od případu.

Buňky se exponují dostatečnou dobu v závislosti na použitém zkušebním systému; při delší expozici může být nezbytná opakovaná expozice spojená s výměnou média (a podle potřeby s výměnou čerstvé metabolické aktivační směsi). Buňky, které nemají dostatečnou vnitřní metabolickou aktivitu, musí být exponovány zkoušené chemické látce za přítomnosti i za nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expoziční doby se z buněk vymyje zkoušená látka a buňky se kultivují za vhodných podmínek, aby se mohl projevit sledovaný transformovaný fenotyp; poté se zaznamená výskyt transformace. Všechny výsledky se potvrdí nezávislým experimentem.

Údaje se zpracují v tabulkové formě; podle použité zkoušky jimi mohou být např. počet misek, počet misek s transformací nebo počet transformovaných buněk. Podle potřeby se přežití buněk vyjádří v procentech přežití v kontrolní kultuře a četnost transformací se vyjádří jako podíl transformovaných buněk a životaschopných buněk. Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:

• typ použitých buněk, počet buněčných kultur, metody udržování buněčných kultur,

• zkušební podmínky: koncentrace zkoušené látky, použité vehikulum, doba inkubace, délka a frekvence expozice, hustota buněk během expozice, typ použitého vnějšího metabolického aktivačního systému, pozitivní a negativní kontroly, specifikace sledovaného fenotypu, použitý selekční systém (podle potřeby), zdůvodnění výběru koncentrací,

• metody počítání životaschopných a transformovaných buněk,

• statistické vyhodnocení,

• diskuse o výsledcích,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Tato zkušební metoda byla odstraněna, protože již není uznávána jako vhodná pro získávání informací o toxikologických vlastnostech chemických látek pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006. Použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 2 části 0.

• Souběžná negativní kontrola odpovídá publikovaným normám pro historické údaje o negativní kontrole, které by obvykle měly být > 0 % a ≤ 1,5 % buněk s chromozomovými aberacemi, a historickým kontrolním údajům laboratoře, jsou-li k dispozici (viz odstavce 10 a 18).

• Souběžné pozitivní kontroly vyvolávají odezvy, které odpovídají publikovaným normám pro historické údaje o pozitivní kontrole a historickým pozitivním kontrolním údajům laboratoře, jsou-li k dispozici, a vyvolávají statisticky významný nárůst v porovnání s negativní kontrolou (viz odstavce 17, 18).

• Byl analyzován přiměřený počet buněk a dávek (viz odstavce 28 a 32).

• Kritéria pro výběr nejvyšší dávky jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 25 a 26.

• alespoň jedna ze zkoušených dávek vykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžně provedenou negativní kontrolou,

• nárůst je závislý na dávce alespoň při jednom odběru vzorků, a

• všechny výsledky jsou mimo přijatelné rozpětí negativních kontrolních údajů nebo distribuci historických údajů laboratoře o negativních kontrolách (např. mimo 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení), pokud jsou k dispozici.

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat chromozomové aberace ve spermatogoniích pokusných zvířat. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze též najít v literatuře (11) (18). Použité statistické testy by měly brát v úvahu zvíře jako experimentální jednotku.

• žádná ze zkušebních dávek nevykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžně provedenou negativní kontrolou,

• v žádném experimentálním uspořádání neexistuje nárůst v závislosti na dávce, a dále

• všechny výsledky jsou v přijatelném rozpětí negativních kontrolních údajů nebo distribuci historických údajů laboratoře o negativních kontrolách (např. v 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení), pokud jsou k dispozici.

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka není schopna vyvolávat chromozomové aberace ve spermatogoniích pokusných zvířat. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze též najít v literatuře (11) (18). Negativní výsledek nevylučuje možnost, že chemická látka může indukovat chromozomální aberace v pozdějších fázích vývoje, které nejsou studovány, nebo genové mutace.

• Shrnutí.

• Zkoušená chemická látka:

  • zdroj, číslo šarže, a je-li k dispozici, datum použitelnosti,

  • stabilita zkoušené chemické látky samotné, je-li známa,

  • rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle, jsou-li známy,

  • měření pH, případně osmolality a sraženiny v kultivačním médiu, do něhož byla přidána zkoušená chemická látka.

• Jednosložková látka:

  • fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

  • chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.

• Vícesložková látka, látka s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkt nebo biologický materiál a směsi:

  • charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek.

• Příprava zkoušené chemické látky:

  • zdůvodnění volby vehikula,

  • rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle/vehikulu,

  • příprava potravy, pitné vody nebo inhalačních aplikačních forem,

  • analytická stanovení aplikační formy (např. stabilita, homogenita, nominální koncentrace), pokud se provádí.

• Pokusná zvířata:

  • použitý druh/kmen a odůvodnění jeho použití,

  • počet a věk zvířat,

  • původ, podmínky chovu, strava atd.,

  • metoda jednoznačného označení zvířat,

  • u krátkodobých studií: hmotnost jednotlivých zvířat na začátku a na konci zkoušky, u studií trvajících déle než jeden týden: hmotnosti jednotlivých zvířat během studie a spotřeba potravy. Mělo by být uvedeno rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnota a směrodatná odchylka pro každou skupinu.

• Zkušební podmínky:

  • údaje o pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontrole,

  • údaje ze studie pro zjištění rozsahu dávek, pokud byla provedena,

  • zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

  • zdůvodnění způsobu podávání,

  • podrobnosti o přípravě zkoušené chemické látky,

  • podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,

  • zdůvodnění dob usmrcení,

  • metody zjišťování toxicity, včetně případně histopatologických nebo hematologických analýz a četnosti, s jakou jsou prováděna pozorování zvířat, a četnosti vážení,

  • metody ověřování, zda se zkoušená chemická látka dostala k cílové tkáni, nebo ověřování obecné cirkulace, pokud byly získány negativní výsledky,

  • skutečná dávka (v mg na kg tělesné hmotnosti za den) vypočtená z koncentrace zkoušené chemické látky v potravě / pitné vodě (v ppm) a případně ze spotřeby,

  • podrobnosti o jakosti krmení a vody,

  • podrobný popis harmonogramů aplikace a odběru vzorků a odůvodnění výběru konkrétního schématu,

  • způsob utracení,

  • způsob analgezie (pokud se používá),

  • postupy izolace tkání,

  • identifikace chemické látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka aplikace,

  • metody přípravy preparátů,

  • kritéria hodnocení aberací,

  • počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,

  • kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou.

• Výsledky:

  • stav zvířat před zkouškou a během zkoušky, včetně známek toxicity,

  • tělesná hmotnost a hmotnost orgánů při utracení (pokud se používá více režimů expozice, tělesná hmotnost stanovená v průběhu režimu aplikace),

  • známky toxicity,

  • mitotický index,

  • poměr spermatogonií v mitóze vzhledem k první a druhé metafázi meiózy nebo jiný průkaz expozice cílové tkáni,

  • typ a počet aberací uvedený samostatně pro každé zvíře,

  • celkový počet aberací ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

  • počet buněk s aberacemi ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami.

  • podle možnosti závislost odezvy na dávce,

  • použité statistické analýzy a metody,

  • údaje o souběžné negativní kontrole,

  • historické údaje o negativních kontrolách s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami a 95 % interval spolehlivosti (je-li k dispozici), nebo publikované historické údaje o negativních kontrolách použité pro přijatelnost výsledků zkoušky,

  • údaje o souběžné pozitivní kontrole,

  • změny ploidie, byly-li pozorovány, včetně četností polyploidie a/nebo endoreduplikovaných buněk.

• Diskuse o výsledcích

• Závěr

• (1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris
• (2) Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
• (3) Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.
• (4) Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.
• (5) Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.
• (6) Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.
• (7) Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.
• (8) Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.
• (9) Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.
• (10) Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313–324.
• (11) Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.
• (12) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.
• (13) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
• (14) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.
• (15) Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.
• (16) Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.
• (17) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
• (18) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
• (19) Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.
• (20) Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.
• (21) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.
• (22) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Viz obecný úvod, část E.

Viz obecný úvod, část E.

Žádné.

Jedná se o zkoušku na myších in vivo, při níž jsou vyvíjející se embrya exponována chemickým látkám. Cílovými buňkami u vyvíjejících se embryí jsou melanoblasty a cílovými geny jsou geny kontrolující pigmentaci srsti. Vyvíjející se embrya jsou heterozygotní pro řadu genů ovlivňujících barvu srsti. Mutace nebo ztráta (při různých genetických událostech) dominantní alely v genu melanoblastu je vyjádřena recesivním fenotypem v dceřiných buňkách vytvářejících skvrnu (spot) pozměněné barvy srsti narozené myši. Počet potomků s těmito skvrnami, mutacemi, se zaznamená a jejich četnost se porovná s četností u potomků exponovaných pouze rozpouštědlu. Spot test na myších detekuje předpokládané somatické mutace v embryonálních buňkách.

Nejsou stanovena.

Zkoušené chemické látky se pokud možno rozpustí nebo suspendují v isotonickém fyziologickém roztoku. Látky, které jsou nerozpustné ve vodě, se rozpustí nebo suspendují ve vhodných vehikulech. Použité vehikulum nesmí interferovat se zkoušenou látkou ani vyvolávat toxické účinky. Použijí se čerstvě připravené roztoky zkoušené látky.

Myši kmene T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c^chp/c^chp; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) se zkříží buď s kmenem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe), nebo s kmenem C57BL (nonagouti, a/a). Mohou být použita i jiná křížení za předpokladu, že budou vznikat nonagouti potomci, např. křížení mezi kmenem Nmri (nonagouti, a/a; albino, c/c) a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d).

Použije se dostatečný počet březích samic, aby byl zajištěn dostatečný počet živých potomků pro každou použitou úroveň dávky. Vhodná velikost vzorku závisí na počtu skvrn pozorovaných u exponovaných myší a na rozsahu kontrolních údajů. Negativní výsledky jsou přijatelné pouze tehdy, bylo-li hodnoceno nejméně 300 potomků samic exponovaných nejvyšší dávce.

Měly by být k dispozici souběžné kontrolní údaje od myší exponovaných pouze vehikulu (negativní kontroly). Ke zvýšení citlivosti testu mohou být použity kontrolní údaje z dřívějších pokusů provedených v téže laboratoři za předpokladu, že jsou homogenní. Není-li u zkoušené látky zjištěna mutagenita, měly by být k dispozici údaje z pozitivních kontrol, které byly tímto testem získány v poslední době v téže laboratoři při expozici chemické látce se známou mutagenitou.

Obvyklými způsoby podávání jsou orální aplikace sondou nebo intraperitoneální injekce březí myši. Podle potřeby se expozice provede inhalací nebo jiným vhodným způsobem.

Použijí se alespoň dvě úrovně dávek, z nichž jedna vyvolává známky toxicity nebo vede ke zmenšení velikosti vrhu. U netoxických látek se použije maximální dosažitelná koncentrace.

Zvířata se obvykle exponují pouze jednou v 8., 9., nebo 10. dni březosti, přičemž se za 1. den březosti považuje den, kdy byla zjištěna vaginální zátka. Tyto dny odpovídají 7,25, 8,25 a 9,25 dne po koncepci. Během těchto dnů lze provést postupné expozice.

U mláďat se mezi třetím a čtvrtým týdnem po vrhu spočítá a zaznamená počet skvrn. Rozlišují se tři kategorie skvrn:

• a) bílé skvrny o průměru 5 mm ve střední ventrální linii, u nichž se předpokládá, že vznikly zánikem buněk (WMVS);
• b) žluté skvrny typu agouti vyskytující se v okolí mléčných žláz, genitálií, hrdla, axil, oblasti slabin a uprostřed čela, u nichž se předpokládá, že vznikají v důsledku chybné diferenciace (MDS), a
• c) pigmentované a bílé skvrny náhodně rozmístěné v srsti, u nichž se předpokládá, že jsou výsledkem somatických mutací (RS).

Všechny tři kategorie se zaznamenají, avšak pouze poslední, RS, je geneticky relevantní. Obtíže s odlišením MDS od RS lze vyřešit pozorováním chlupů ve fluorescenčním mikroskopu.

Zaznamenávají se nápadné makroskopické morfologické malformace potomků.

Uvede se celkový počet sledovaných potomků a počet mláďat s jednou nebo více skvrnami vyvolanými podle předpokladu somatickými mutacemi. Údaje získané u kontrolních a exponovaných skupin se porovnávají vhodnými metodami. Uvedou se rovněž údaje vztažené na velikost vrhu.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:

• kmen použitý ke křížení,

• počet březích samic v experimentálních a v kontrolních skupinách,

• průměrná velikost vrhu v experimentálních a v kontrolních skupinách při vrhu a při odstavení,

• úroveň(úrovně) dávky zkoušené chemické látky,

• použité rozpouštědlo,

• den březosti, ve kterém byla podána zkoušená látka,

• způsob podání,

• celkový počet sledovaných potomků a počet potomků s kategoriemi skvrn WMVS, MDS a RS v experimentálních a kontrolních skupinách,

• makroskopické morfologické malformace,

• vztah dávka/odezva u kategorie skvrn RS, je-li to možné,

• statistické vyhodnocení,

• diskuse o výsledcích,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Tato zkušební metoda byla odstraněna, protože již není uznávána jako vhodná pro získávání informací o toxikologických vlastnostech chemických látek pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006. Použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 2 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Popisovaná metoda zkoušení subchronické orální toxicity se řídí hlavními zásadami metody OECD TG 409 (1998).

Při posouzení a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze stanovení subchronické orální toxicity s opakovanou aplikací provést až po získání prvních informací o toxicitě ze zkoušek akutní toxicity a toxicity při 28denní opakované aplikaci. 90denní studie poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by mohlo vzniknout vlivem opakované expozice v průběhu období rychlého růstu a mladé dospělosti. Studie poskytne informace o hlavních toxických účincích, určí cílové orgány a možnost akumulace a může poskytnout odhad hladiny bez pozorovatelného nepříznivého účinku, kterou lze použít při výběru úrovní dávek pro chronické studie a pro stanovení bezpečnostních kritérií pro expozici člověka.

Tato zkušební metoda umožňuje zjistit nepříznivé účinky vyvolané chemickou látkou na nehlodavcích a měla by být použita pouze tehdy, pokud:

• účinky pozorované v jiných studiích naznačují potřebu je objasnit nebo charakterizovat na dalším druhu, a to na nehlodavcích, nebo

• toxikokinetické studie naznačují, že použití specifického druhu nehlodavce je nejvhodnější volbou laboratorního zvířete, nebo

• existují jiné specifické důvody, které zdůvodňují použití nehlodavce.

Viz také obecný úvod, část B.

Dávka: množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost (v g, mg) nebo jako hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (např. v mg/kg) nebo jako konstantní koncentrace v potravě (v ppm).

Dávkování: obecný termín zahrnující dávku, četnost a trvání podávání látky.

NOAEL: anglická zkratka pro termín „no observed adverse effect level“ (hladina bez pozorovaného nepříznivého účinku) a odpovídá nejvyšší úrovni dávky nebo expozice, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky související s podáním látky.

Zkoušená látka se denně orálně podává v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat; každé skupině se podává jedna úroveň dávky 90 dnů. V průběhu období podávání se zvířata každý den pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, i zvířata, která do konce zkoušky přežila, se pitvají.

Obvykle používaným druhem nehlodavce je pes, musí jít o definované plemeno, často se používá beagle. Dále lze použít jiné druhy, např. prase nebo miniprase. Primáti se nedoporučují a jejich použití musí být odůvodněno. Použita by měla být mladá zdravá zvířata a v případě psů by podávání mělo začít nejlépe ve věku 4 až 6 měsíců, nejpozději v devíti měsících. Provádí-li se studie jako předběžná studie pro dlouhodobou studii chronické toxicity, měl by být v obou studiích použit tentýž živočišný druh a plemeno.

Použijí se mladá zdravá zvířata, která se aklimatizovala na laboratorní podmínky a která nebyla podrobena předchozím experimentálním postupům. Trvání aklimatizace závisí na vybraném testovacím druhu a původu zvířat. Doporučuje se nejméně 5 dnů pro psy nebo pro prasata chovaná pro tento účel ve vlastním chovu a nejméně 2 týdny pro zvířata z externích chovných zařízení. Musí být popsán druh, kmen, původ, pohlaví a hmotnost a/nebo věk pokusných zvířat. Zvířata by měla být náhodně přiřazena do kontrolních a experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Každému zvířeti by mělo být přiřazeno samostatné identifikační číslo.

Zkoušenou látku lze podávat v potravě nebo v pitné vodě, sondou nebo v kapslích. Metoda orálního podání závisí na účelu studie a na fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušeného materiálu.

Zkoušená látka se v případě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporučuje se zvážit použití vodného roztoku/suspense, potom použití roztoku/emulse v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku v jiných vehikulech. Pro nevodná vehikula by měla být známa jejich toxická charakteristika. Měla by být stanovena stálost zkoušené látky v podmínkách podávání.

Pro každou úroveň dávek se použije nejméně 8 zvířat (4 samice a 4 samci). Pokud se budou zvířata usmrcovat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před ukončením studie. Počet zvířat při zakončení studie musí být dostatečný pro smysluplné vyhodnocení toxických účinků. Na základě dřívějších poznatků o zkoušené chemické látce nebo jí blízce příbuzné látce by mělo být vzato v úvahu zařazení dodatečné satelitní skupiny 8 zvířat (4 zvířata každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou pro účely pozorování vratnosti nebo přetrvávání jakýchkoli toxických účinků v období po expozici. Trvání tohoto období po expozici by mělo být vhodně stanoveno s ohledem na pozorované účinky.

S výjimkou případů, kdy se provede limitní zkouška (viz bod 1.5.3), by měly být použity nejméně tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek je možno stanovit na základě výsledků studií při opakované aplikaci nebo orientačních studií a měly by zohlednit jakékoli existující toxikologické a toxikokinetické údaje dostupné pro zkoušenou sloučeninu nebo příbuzné materiály. Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha nebo biologické účinky zkoušené látky, měla by být nejvyšší úroveň dávky zvolena s cílem vyvolat toxicitu, ne však uhynutí nebo velké utrpení. Měla by být zvolena sestupná řada úrovní dávek s cílem prokázat účinky související s dávkou a nepřítomnost nepříznivých účinků při nejnižší úrovni dávky (NOAEL). Často je pro stanovení sestupných úrovní dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný interval mezi dávkami a je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu než použít velmi velké intervaly (odpovídající např. faktoru většímu než 6 až 10).

Kontrolní skupině se nepodává žádná látka, nebo se jí podává vehikulum, jestliže se při podávání zkoušené látky vehikulum používá. S výjimkou podávání zkoušené látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako se zvířaty v experimentální skupině. Jestliže je použito vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu. Jestliže se zkoušená látka podává v potravě a způsobuje-li omezení příjmu potravy, doporučuje se použít paralelně skupinu se stejným omezením potravy, aby se odlišil vliv snížení příjmu potravy nechutenstvím od toxikologických změn

V případě potřeby by měly být vzaty v úvahu následující charakteristiky vehikula a ostatních přísad: účinky na absorpci, distribuci, metabolismus nebo vylučování zkoušené látky; dále vlivu na chemické vlastnosti zkoušené látky, které mohou změnit její toxické vlastnosti, a účinky na spotřebu potravy nebo vody nebo na nutriční stav zvířat.

Pokud zkouška provedená podle postupů popsaných v této studii při jedné dávce nejméně 1000 mg/kg tělesné hmotnosti a den nevyvolá pozorovatelné nepříznivé účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití tří dávek nezbytná. Limitní zkouška se provádí s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek.

Zkoušená látka se zvířatům podává 7 dní v týdnu po dobu 90 dnů. Jakýkoli jiný režim podávání, např. 5 dní v týdnu, musí být zdůvodněn. Pokud se zkoušená látka podává sondou, podává se zvířatům v jediné dávce za použití žaludeční sondy nebo vhodné intubační kanyly. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. Zpravidla se udržuje co nejnižší objem. Až na dráždivé a žíravé látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující konstantní objem při všech úrovních dávky.

U látek podávaných v potravě nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství použité zkoušené látky neovlivňovalo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se zkoušená látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm), nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitá možnost musí být specifikována. Aplikuje-li se látka sondou nebo v kapslích, mělo by se tak stát každý den přibližně ve stejnou dobu a dávkování by mělo být podle potřeby upraveno tak, aby bylo konstantní vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete. Pokud je 90denní studie prováděna jako předběžná studie k dlouhodobé studii chronické toxicity, měla by být v obou studiích použita stejná potrava.

Doba pozorování by měla být nejméně 90 dní. Zvířata v satelitní skupině určená pro následná pozorování by měla být po vhodnou dobu bez expozice, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení, nebo toxické účinky přetrvávají.

Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maximálního účinku po podání látky. Zaznamenává se klinický stav zvířat. Nejméně dvakrát denně, obvykle na začátku a na konci každého dne, se provede prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality.

Nejméně jednou před prvním podáním látky a dále jednou týdně se provede důkladné klinické vyšetření všech zvířat (za účelem intraindividuálního srovnání). Toto pozorování by se mělo, pokud je to možné, provádět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru a přednostně pokaždé ve stejnou dobu. Je třeba se pokusit zajistit, aby byly rozdíly mezi podmínkami pozorování minimální. Příznaky toxicity by měly být pečlivě zaznamenány, včetně doby nástupu, stupně a trvání. Pozorování by mělo mimo jiné zahrnovat změny kůže, srsti, očí a sliznic, výskyt sekretů a exkretů a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé dýchání). Zaznamenávat by se měly změny chůze, polohy a reakce na manipulaci, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (např. nadměrného čistění nebo opakovaného kroužení) nebo jakékoli zvláštní chování.

Před podáním zkoušené látky a při zakončení studie by mělo být provedeno vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem nejlépe u všech zvířat, alespoň však ve skupině s vysokou dávkou a v kontrolní skupině. Jsou-li zjištěny změny na očích související s podáním látky, měla by být vyšetřena všechna zvířata.

Všechna zvířata by se měla nejméně jednou týdně zvážit. Měření spotřeby potravy by se mělo provádět nejméně jednou týdně. Pokud se látka podává v pitné vodě, měla by se nejméně jednou týdně měřit spotřeba vody. Spotřeba vody by měla být vzata v úvahu také v případě studií s podáváním v potravě nebo sondou, v jejichž průběhu může dojít ke změně příjmu tekutin.

Krevní vzorky by se měly odebírat z určeného místa a v případě potřeby by se měly skladovat za vhodných podmínek. Na konci zkušebního období se vzorky odeberou těsně před utracením zvířat nebo v jeho průběhu.

Na začátku studie a poté v měsíčních intervalech nebo uprostřed zkušebního období a na konci zkušebního období se provede hematologické vyšetření, včetně stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů, počtu trombocytů a srážlivosti krve, stanoví se protrombinový a trombinový čas.

Klinické biochemické analýzy za účelem vyšetření hlavních toxických účinků na tkáně a zejména na játra a ledviny se provedou na krevních vzorcích odebraných všem zvířatům na začátku zkušebního období a poté v měsíčních intervalech nebo uprostřed a na konci zkušebního období. Zkušební oblasti, které je vhodné stanovit jsou koncentrace elektrolytů, metabolismus cukrů a funkce jater a ledvin. Výběr specifických zkoušek ovlivní pozorování mechanismu účinku zkoušené látky. Před odběrem vzorků by měla být zvířata ponechána nalačno po dobu vhodnou pro daný druh. Navrhovaná vyšetření zahrnují stanovení vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glykémie nalačno, alaninaminotransferasy, aspartátaminotransferasy, ornitindekarboxylasy, gama-glutamyltranspeptidasy, dusíku močoviny, albuminu, kreatininu, celkového bilirubinu a celkových bílkovin v séru.

Analýzy moči za použití časově definovaného sběru by se měly provést alespoň na začátku, uprostřed a na konci studie. Analýzy moči zahrnují vyšetření vzhledu, objemu, osmolality nebo specifické hmotnosti, pH, bílkovin, glukosy a krve/krvinek. Zkoumání pozorovaného účinku (pozorovaných účinků) lze v případě potřeby rozšířit o další analýzy.

Dále by se mělo uvážit vyšetření indikátorů celkového poškození tkání. Mezi jiná stanovení, která mohou být potřebná pro úplné toxikologické hodnocení, patří analýza lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu a aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro širší vyšetření pozorovaných účinků. Tyto profily je třeba identifikovat pro chemické látky určitých skupin nebo případ od případu.

Obecně je třeba postupovat pružně v závislosti na druhu a na pozorovaných a/nebo předpokládaných účincích dané látky.

U všech pokusných zvířat zařazených do studie by měla být provedena celková, podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra se žlučníkem, ledviny, nadledvinky, varlata, nadvarlata, vaječníky, děloha, štítná žláza (s příštítnými tělísky), brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat (kromě zvířat nalezených v agónii a/nebo zvířat utracených v průběhu zkoušky) by měly být zbaveny všech ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.

Následující tkáně by měly být přechovány v nejvhodnějším fixačním médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny tkáně s lézemi, mozek (reprezentativní oblasti, včetně předního mozku, mozečku a prodloužené míchy), mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, oči, štítná žláza, příštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, tenké i tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, žlučník, slinivka břišní, ledviny, nadledvinky, slezina, srdce, průdušnice a plíce, aorta, gonády, děloha, přídatné pohlavní orgány, samičí mléčná žláza, prostata, močový měchýř, žlučník (myší), lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis), přednostně v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (a/nebo čerstvý nátěr z nasáklé kostní dřeně) a kůže. Podle klinických nebo jiných nálezů může být nezbytné zkoumat i další tkáně. Všechny orgány považované za možné cílové orgány pro působení zkoušené látky by měly být uchovány.

Celkové histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání by mělo být provedeno nejméně u všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny s vysokou dávkou. Toto vyšetření by mělo být rozšířeno na zvířata všech ostatních dávkových skupin, pokud jsou u skupiny s vysokou dávkou pozorovány změny orgánů vyvolané zkoušenou dávkou.

Měly by být zkoumány všechny makroskopické léze.

V případě použití satelitní skupiny by mělo být provedeno histopatologické vyšetření tkání a orgánů, na kterých byly pozorovány účinky u exponovaných skupin.

Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat nalezených uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů a dobu úmrtí nebo humánního utracení, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis toxických příznaků, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého toxického účinku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat vykazujících každý typ léze.

Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by měla být zvolena již při plánování studie.

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

• fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,

• identifikační údaje,

• vehikulum (je-li potřeba): zdůvodnění volby vehikula, není-li použita voda.

• použitý druh a kmen,

• počet, stáří a pohlaví zvířat,

• původ, podmínky chovu, strava atd.,

• hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky.

• zdůvodnění výběru úrovní dávek,

• podrobné údaje o složení látky nebo úpravě potravy, o dosažené koncentraci, stálosti a homogenitě přípravku,

• podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky,

• přepočet z koncentrace látky v potravě nebo ve vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg/kg tělesné hmotnosti (pokud jde o aplikaci v potravě nebo ve vodě),

• podrobné údaje o potravě a kvalitě vody.

• tělesná hmotnost/změny tělesné hmotnosti,

• spotřeba potravy a popřípadě spotřeba vody,

• údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávky, včetně příznaků toxicity,

• charakter, závažnost a trvání klinických projevů (zda byly vratné nebo nevratné),

• oftalmologické vyšetření,

• hematologické vyšetření s příslušnými výchozími hodnotami (normami),

• klinická biochemická vyšetření s příslušnými výchozími hodnotami,

• konečná tělesná hmotnost, hmotnost orgánů a poměry hmotnosti orgánů k tělesné hmotnosti,

• pitevní nálezy,

• podrobný popis všech histopatologických nálezů,

• údaje o absorpci, pokud jsou dostupné,

• popřípadě statistické vyhodnocení výsledků.

Rozbor výsledků.

Závěry.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Žádné.

Zkoušená látka se denně po dobu 90 dní nanáší na kůži v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, každé skupině jedna úroveň dávky. V průběhu období aplikace se zvířata každý den pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula, i zvířata, která do konce zkoušky přežila, se pitvají.

Nejsou stanovena.

Nejméně pět dní před zkouškou jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu. Před zkouškou se provede náhodný výběr zdravých mladých dospělých zvířat, která se přiřadí do experimentálních a kontrolních skupin. Krátce před zahájením zkoušky se zvířatům ostříhá srst na zádech. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést asi 24 hodin před zkouškou. Ostříhání nebo oholení je obvykle třeba opakovat přibližně v týdenních intervalech. Při stříhání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se neporanila kůže. Pro aplikaci zkoušené látky se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže, která má být zbavena srsti, a o velikosti krycího obvazu je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat. Při zkouškách pevných látek, které mohou být podle potřeby rozetřeny na prach, se zkoušená látka dostatečně navlhčí vodou, popřípadě vhodným vehikulem, aby se zajistil dobrý styk s kůží. Kapalné zkoušené látky se zpravidla aplikují neředěné. Aplikace se provádí pět až sedm dnů v týdnu.

Může být použit dospělý potkan, králík nebo morče. Lze použít i jiné živočišné druhy, ale jejich použití musí být zdůvodněno. Na začátku zkoušky by nemělo rozpětí odchylek hmotností překročit ± 20 % příslušné střední hodnoty. Provádíli se subchronická dermální studie jako předběžná studie před dlouhodobou studií, měl by být v obou studiích použit stejný živočišný druh a kmen.

Pro každou úroveň dávek se použije nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmějí být březí. Pokud se budou zvířata usmrcovat v průběhu studie, zvýší se celkový počet o počet zvířat, která budou usmrcena před ukončením studie. Kromě toho může být satelitní skupině 20 zvířat (10 zvířat každého pohlaví) podávána vysoká úroveň dávky po dobu 90 dnů a 28 dnů po podávání se pozoruje vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.

Použijí se nejméně tři úrovně dávek a kontrolní skupina nebo, jeli použito vehikulum, kontrolní skupina s vehikulem. Doba expozice by měla být nejméně šest hodin denně. Zkoušená látka by měla být aplikována každý den přibližně ve stejnou dobu a dávkování by mělo být pravidelně (týdně nebo každých čtrnáct dnů) přizpůsobeno, aby bylo konstantní vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace zkoušené látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako se zvířaty v experimentální skupině. Používáli se pro usnadnění aplikace vehikulum, aplikuje se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, jaké obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka. Nejvyšší úroveň dávky by měla mít za následek toxické účinky, ale neměla by způsobit žádná uhynutí nebo by měla mít za následek malý počet uhynutí. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. V ideálním případě by střední úroveň dávky měla vyvolat minimální pozorovatelné toxické účinky. Použijeli se více než jedna mezilehlá úroveň dávky, měly by se úrovně lišit tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupinách s nízkou a střední úrovní dávky a v kontrolních skupinách by měla být četnost uhynutí nízká, aby bylo možné provést smysluplné hodnocení výsledků.

Vede-li aplikace zkoušené látky k závažnému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké úrovně dávky může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došloli k závažnému poškození kůže, je nutné zkoušku ukončit a provést ji znovu s nižšími koncentracemi.

Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg/kg nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, jeli známa, žádné toxické účinky, není další zkoušení potřebné.

Zvířata se pozorují denně s cílem zaznamenat příznaky toxicity. Zaznamenají se doba uhynutí a čas, ve kterém se objevily a opět odezněly toxické účinky.

Zvířata se chovají jednotlivě v klecích. Zvířatům se aplikuje zkoušená látka denně nejlépe 7 dní v týdnu po dobu 90 dnů.

Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, se pozorují dalších 28 dnů bez aplikace, aby se posoudilo zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Doba expozice by měla být nejméně šest hodin denně.

Zkoušená látka se nanese rovnoměrně na plochu, která činí asi 10 % celkového povrchu těla. V případě vysoce toxických látek může být tato plocha menší; měla by se však porýt co největší část této plochy co nejslabší a nejstejnoměrnější vrstvou.

Během expozice se zkoušená látka udržuje ve styku s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Zkušební plocha se dále vhodným způsobem překryje, aby se mulový obvaz a zkoušená látka fixovaly a aby zvířata zkoušenou látku nepožila. K zamezení požití látky je možno použít i prostředky pro omezení volnosti pohybu, úplné znehybnění se však nedoporučuje.

Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky zkoušené látky pokud možno vodou nebo jiným vhodným způsobem očištění kůže.

Všechna zvířata se pozorují denně a zaznamenávají se známky toxicity včetně doby nástupu, závažnosti a trvání. Pozorování v kleci zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Měření spotřeby potravy a hmotnosti zvířat se provádějí týdně. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat, např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Na konci zkoušky se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Zvířata nalezená v agónii se vyřadí, humánně utratí a pitvají.

U všech zvířat včetně kontrolních se obvykle provádějí následující vyšetření:

• a) oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným vhodným přístrojem se provede před podáním zkoušené látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, alespoň však u skupiny s nejvyšší dávkou a u kontrolních skupin. Jsou-li zjištěny oční změny, vyšetří se všechna zvířata;
• b) na konci zkoušky se provede hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erythrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve, změří se například doba srážlivosti, prothrombinový čas, thrombinový čas nebo počet trombocytů;
• c) na konci zkoušky se provede biochemická analýza krve. Pro tyto studie je vhodné analyzovat koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických zkoušek bude určen pozorováním způsobu účinku látky. Navrhovaná vyšetření zahrnují stanovení vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy na lačno (délka doby hladovění se volí podle živočišného druhu), hladiny sérové glutamát-pyruvát transaminasy(Nyní známá jako alaninaminotransferasa.), glutamát-oxalacetát transaminasy(Nyní známá jako aspartátaminotransferasa.), ornitindekarboxylasy, gama-glutamyltranspeptidasy, dusíku močoviny, albuminu, kreatininu, celkového bilirubinu a celkových bílkovin v séru. Mezi další stanovení, která mohou být nezbytná pro správné toxikologické hodnocení, patří stanovení lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu a aktivity cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být použity, je-li nezbytné provést širší vyšetření pozorovaných účinků;
• d) analýza moči se běžně nevyžaduje, provádí se pouze na základě očekávané nebo pozorované toxicity.

Pokud nejsou kontrolní údaje z dřívějších pozorování vhodné, zváží se stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem aplikace.

U všech zvířat se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny a varlata se co nejdříve po sekci zváží, aby nedošlo k vysychání. Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými lézemi, mozek – v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza/příštítná tělíska, všechny thymické tkáně, průdušnice a plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, gonády, děloha (přídatné pohlavní orgány), (kůže), jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, caecum, tračník, konečník, močový měchýř, reprezentativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, hrudní kost s kostní dření, (oči), (kost stehenní včetně kloubních ploch), (mícha ve třech úrovních – krční, střední hrudní a bederní) a (slzné žlázy). Tkáně v závorkách se vyšetřují pouze v případě, že lze na jejich postižení usuzovat z příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.

• a) Úplné histopatologické vyšetření normální a exponované kůže, orgánů a tkání se provede u všech zvířat kontrolní skupiny a u zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka.
• b) Vyšetří se všechny makroskopické léze.
• c) Vyšetří se cílové orgány v jiných dávkových skupinách.
• d) Použijí-li se potkani, plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední dávkou se histopatologicky vyšetří k zjištění příznaků infekce, neboť to umožňuje vhodné posouzení zdravotního stavu zvířat. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých byly zjištěny léze ve skupině s vysokou dávkou.
• e) V případě použití satelitní skupiny se provede histopatologické vyšetření tkání a orgánů, na kterých byly pozorovány účinky u exponovaných skupin.

Údaje se shrnou do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat vykazujících léze a procento zvířat vykazujících jednotlivé typy lézí. Výsledky se vyhodnotí vhodnou statistickou metodou. Může být použita jakákoli uznávaná statistická metoda.

Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:

• živočišný druh, kmen, původ, podmínky chovu, strava,

• zkušební podmínky,

• úrovně dávek (včetně vehikula, pokud je použito) a koncentrace,

• údaje o toxických reakcích podle pohlaví a dávky,

• úroveň bez účinku, pokud ji lze stanovit,

• doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,

• popis toxických nebo jiných účinků,

• doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky, a jejich další vývoj,

• údaje o spotřebě potravy a o tělesné hmotnosti,

• oftalmologické nálezy,

• provedená hematologická vyšetření a jejich výsledky,

• provedená biochemická vyšetření a jejich výsledky (včetně výsledků případných analýz moči),

• pitevní nálezy,

• podrobný popis všech histopatologických nálezů,

• statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné,

• diskuse o výsledcích,

• interpretace výsledků.

Viz obecný úvod, část B.

Viz obecný úvod, část B.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Tato zkušební metoda byla odstraněna, protože již není uznávána jako vhodná pro získávání informací o toxikologických vlastnostech chemických látek pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006. Použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 2 části 0.

Tato zkušební metoda byla odstraněna, protože již není uznávána jako vhodná pro získávání informací o toxikologických vlastnostech chemických látek pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006. Použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 2 části 0.

• látkovou bilanci a identifikaci metabolitů lze dostatečně vyhodnotit i při použití neznačené zkoušené chemické látky,

• analytická specifičnost a citlivost metody použité s neznačenou zkoušenou chemickou látkou je shodná nebo větší, než jaké by bylo možné dosáhnout s radioizotopově značenou zkoušenou chemickou látkou,

pak se radioizotopově značená chemická látka nemusí používat. Kromě toho lze použít jiné radioaktivní a stabilní izotopy, zejména pokud je příslušný prvek zodpovědný za toxicitu nebo je součástí toxické části zkoušené chemické látky. Je-li to možné, měla by být radioaktivní značka umístěna ve středové části molekuly, která je metabolicky stabilní (není zaměnitelná, nelze ji metabolicky odbourat jako CO₂ a nestává se součástí zásob jednouhlíkových jednotek v organismu). Někdy může být nutné označit více míst nebo specifických oblastí molekuly, aby bylo možné sledovat metabolický osud zkoušené chemické látky.

kde AUC je plocha pod křivkou závislosti koncentrace v plazmě na čase a exp je experimentální cesta podání (orální, dermální nebo inhalační).

• důkaz prodlouženého eliminačního poločasu v krvi naznačující možnou akumulaci zkoušené chemické látky v různých tkáních nebo

• zájem zjistit, zda bylo v konkrétních tkáních dosaženo ustáleného stavu (např. ve studiích s opakovanými dávkami může být zájem zjistit, zda bylo dosaženo ustáleného stavu v cílových tkáních v okamžiku, kdy bylo zdánlivě dosaženo ustáleného stavu zkoušené chemické látky v krvi).

• 1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.
• 2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
• 3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.
• 4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
• 5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
• 6) Kapitola B.45 této přílohy, Absorpce kůží: Metoda in vitro.
• 7) IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety.
• 8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
• 9) Kapitola B.44 této přílohy, Absorpce kůží: Metoda in vivo.
• 10) Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
• 11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.

Při posouzení a hodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určitých skupin látek vyvolat specifické typy neurotoxicity, které nemohou být zjištěny jinými studiemi toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byla pozorována pozdní neurotoxicita; tyto látky mají být podrobeny zkoumání touto metodou.

Screeningové zkoušky in vitro lze použít pro vyhledání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii; negativní nález ze zkoušek in vitro však neposkytuje důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neurotoxicitu.

Viz obecný úvod, část B.

Mezi „organické sloučeniny fosforu“ patří neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu pozorovanou u některých látek této skupiny.

Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se pozdním počátkem ataxie, distální axonopatií v míše a periferním nervu a dále inhibicí a stárnutím specifické esterasy (NTE – neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

Referenční látka může být zkoušena v pozitivní kontrolní skupině s cílem prokázat, že se v laboratorních podmínkách reakce pokusných druhů podstatně nezměnila.

Příkladem široce používané látky s pozdním toxickým účinkem je tri-o-tolyl-fosfát (CAS 78308, EINECS 2011035, název podle CAS: tris(2methylfenyl)fosfát), známá také pod názvem triokresylfosfát (TOCP).

Zkoušená látka se podává orálně v jediné dávce slepicím domácím, chráněným před možnými akutními cholinergními účinky. Zvířata se pozorují po dobu 21 dnů, zaznamenává se abnormální chování, ataxie a peréza. Biochemická vyšetření, zejména inhibice NTE (neropathy target esterase), se provádějí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny, obvykle 24 a 48 hodin po podání látky. Dvacet jedna dnů po podání látky se zbývající slepice usmrtí a provede se histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

Provede se náhodný výběr mladých zdravých dospělých slepic, které nejsou ovlivněny virovými onemocněními a farmakologickou léčbou a mají normální chůzi, přiřadí se do experimentální a kontrolní skupiny a nejméně 5 dnů před zahájením studie se aklimatizují na laboratorní podmínky.

Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

Zkoušená látka se obvykle podává orálně sondou, želatinovými tobolkami nebo srovnatelnou metodou. Kapaliny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu, jako je např. kukuřičný olej, pevné látky by se měly nechat rozpustit, protože velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. Toxické vlastnosti nevodných vehikul by měly být známy před zkouškou, a pokud nejsou známy, měly by být předem určeny.

Doporučuje se mladá nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus), stará 8–12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a slepice by měly být chovány za podmínek umožňujících volný pohyb.

Kromě experimentální skupiny by měla být použita kontrolní skupina s vehikulem a pozitivní kontrolní skupina. S výjimkou podání zkoušené látky se s kontrolní skupinou zachází stejně jako s experimentální skupinou.

V každé skupině by měl být použit dostatečný počet slepic, aby aspoň šest slepic mohlo být usmrceno pro biochemické vyšetření (tři v první a tři v druhý den po podání) a šest přežilo 21denní pozorování patologických příznaků.

Pozitivní kontrolní skupina může být zkoušena souběžně nebo mohou být použity údaje z nedávno použité kontrolní skupiny. Měla by zahrnovat nejméně šest slepic, kterým se podá látka, o níž je známo, že vyvolává pozdní neurotoxicitu, tři slepice pro biochemické vyšetření a tři slepice pro histopatologické vyšetření. Doporučuje se periodicky doplňovat historické údaje. Nové pozitivní kontrolní údaje by měly být doplněny, pokud provádějící laboratoř v průběhu testu změní některý základní prvek zkoušky (např. plemeno, stravu, podmínky chovu).

Měla by se provést předběžná studie za použití vhodného počtu slepic a skupin s různými úrovněmi dávek, aby bylo možné stanovit úroveň, která má být použita v hlavní studii. Pro stanovení přiměřené dávky v hlavní studii je v této předběžné studii nezbytná určitá letalita. Aby se však zabránilo úhynu vlivem akutních cholinergních účinků, lze použít atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že nemá vliv na pozdní neurotoxické reakce. Pro odhad nejvyšší neletální dávky zkoušených látek lze použít řadu metod (viz metoda B.1a). Při výběru dávky mohou být užitečné také dosavadní údaje o slepicích nebo jiné toxikologické informace.

Úroveň dávky zkoušené látky v hlavní studii by měla být co nejvyšší, přičemž se berou v úvahu výsledky předběžné studie výběru dávky a horní limit dávky 2000 mg/kg tělesné hmotnosti. Případný úhyn by neměl narušit dostatečný počet zvířat pro biochemická vyšetření (šest) a pro histologická vyšetření (šest) po 21 dnech. Aby se zabránilo úmrtí vlivem akutních cholinergních účinků, použije se atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že nemá vliv na pozdní neurotoxické účinky.

Pokud zkouška provedená podle postupů popsaných v této studii při jedné dávce nejméně 2000 mg/kg tělesné hmotnosti na den nevyvolá pozorovatelné toxické účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití vyšší dávky nezbytná. Limitní zkouška se použije s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek.

Doba pozorování by měla být 21 dnů.

Po podání přípravku chránícího před uhynutím na následky akutního cholinergního účinku se podá zkoušená látka v jedné dávce.

Pozorování by měla začít okamžitě po podání. Všechny slepice se pečlivě několikrát denně pozorují v průběhu prvních dvou dnů a poté nejméně jednou denně po dobu 21 dnů nebo do plánovaného usmrcení. Veškeré příznaky toxicity by měly být zaznamenány, včetně doby nástupu, typu, závažnosti a trvání abnormálního chování. Ataxie by měla být hodnocena podle nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice určené s patologickými příznaky vyjmou z klecí a podrobí zkoušce nucené motorické aktivity, jako např. stoupání po žebříku, aby se usnadnilo posouzení sebemenších toxických účinků. Zvířata v agónii a zvířata, která se trápí nebo trpí bolestí, se ihned vyřadí, humánně utratí a pitvají.

Všechny slepice se zváží těsně před podáním zkoušené látky a poté nejméně jednou týdně.

Šest slepic náhodně vybraných z každé experimentální skupiny a kontrolní skupiny s vehikulem a tři slepice z pozitivní kontrolní skupiny (pokud se zkouška souběžně provádí s touto skupinou) se usmrtí v prvních dnech po podání látky, mozek a lumbální mícha se vypreparují a vyšetří se na inhibici NTE. Dále může být rovněž vhodné vypreparovat n. ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici aktivity NTE. Zpravidla se usmrtí tři slepice z kontrolní skupiny a z každé experimentální skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách, zatímco tři slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrtí po 24 hodinách. Pokud pozorování klinických příznaků toxicity naznačuje, že se toxická látka v organismu vstřebává velmi pomalu (to lze často posoudit pozorováním doby nástupu cholinergních příznaků), může být vhodnější odebrat vzorek tkáně dvakrát ze tří zvířat mezi 24 až 72 hodinami po podání látky.

Na těchto vzorcích tkáně mohou být provedeny také analýza acetylcholinesterasy (AChE), je-li to považováno za vhodné. In vivo však může nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

Pitva

Pitva všech zvířat (usmrcených podle plánu a utracených v agónii) by měla zahrnovat posouzení stavu mozku a míchy.

Nervová tkáň zvířat, která přežila dobu pozorování a nebyla použita pro biochemické studie, by měla být mikroskopicky vyšetřena. Tkáně by měly být fixovány in situ, za použití perfúzních technik. Odebírá se mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha a periferní nervy. Řezy míchy by měly být odebrány z horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální oblasti. Měly by být odebrány řezy distální části n. tibialis a jeho větví k m. gastrocnemius a z n. ischiadicus. Řezy se barví vhodnými barvivy na myelin a axony.

Negativní výsledky získané pro výsledné účinky zvolené v této metodě (biochemická a histopatologická vyšetření a vyšetření změn chování) nevyžadují zpravidla další zkoušení pozdní neurotoxicity. Při dvojznačných nebo neprůkazných výsledcích těchto vyšetření může být nezbytné další sledování.

Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat vykazujících léze, účinky na chování nebo biochemické účinky, typ a závažnost těchto lézí nebo účinků a procento zvířat vykazující každý typ a závažnost léze nebo účinku.

Údaje z této studie by měly být vyhodnoceny z hlediska výskytu, závažnosti a korelace účinků na chování a biochemických a histopatologických nálezů a dále jakýchkoli dalších pozorovaných účinků na experimentální a kontrolní skupiny.

Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by měla být zvolena již při plánování studie.

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:

• 3.1 Pokusná zvířata:

  • použité plemeno,

  • počet a stáří zvířat,

  • původ, podmínky chovu atd.,

  • hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky.

• 3.2 Zkušební podmínky:

  • podrobné údaje o přípravě zkoušené látky, popřípadě o její stálosti a homogenitě,

  • zdůvodnění volby vehikula,

  • podrobné údaje o podání zkoušené látky,

  • podrobné údaje o stravě a o kvalitě vody,

  • zdůvodnění výběru úrovní dávek,

  • specifikace podávaných dávek, včetně podrobných informací o vehikulu, objemu a fyzikální formě podané látky,

  • identifikace jakéhokoli ochranného přípravku a podrobné informace o jeho podání.

• 3.3 Výsledky:

  • údaje o tělesné hmotnosti,

  • údaje o toxických reakcích podle skupin, včetně mortality,

  • charakter, závažnost a trvání klinických projevů (zda byly vratné nebo nevratné),

  • podrobný popis biochemických vyšetření a nálezů,

  • pitevní nálezy,

  • podrobný popis všech histopatologických nálezů,

  • popřípadě statistické vyhodnocení výsledků.

• Rozbor výsledků.

• Závěry.

Metoda je analogická metodě OECD TG 418.

Při posouzení a hodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určitých skupin látek vyvolat specifické typy neurotoxicity, které nemohou být zjištěny jinými studiemi toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byla pozorována pozdní neurotoxicita; tyto látky mají být podrobeny zkoumání touto metodou.

Screeningové zkoušky in vitro lze použít pro vyhledání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii; negativní nález ze zkoušek in vitro však neposkytuje důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neurotoxicitu.

28denní zkouška pozdní neurotoxicity poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by se mohlo projevit z opakovaných expozic během omezeného časového období. Poskytne informace o reakci na dávku a může poskytnout odhad úrovně bez pozorovatelných nepříznivých účinků, což může být užitečné při stanovení kritérií pro bezpečnou expozici člověka.

Viz také obecný úvod, část B.

Mezi „organické sloučeniny fosforu“ patří neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu pozorovanou u některých látek této skupiny.

Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se pozdním počátkem ataxie, distální axonopatií v míše a periferním nervu a dále inhibicí a stárnutím specifické esterasy (NTE – neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

Zkoušené látky se podávají denně orálně slepicím domácím po dobu 28 dnů. Zvířata se pozorují nejméně jednou denně, zaznamenává se abnormální chování, ataxie a paréza ještě 14 dnů po poslední dávce. Biochemická vyšetření, zejména inhibice NTE (neropathy target esterase), se provádějí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny, obvykle 24 a 48 hodin po podání látky. Dva týdny po poslední dávce se zbývající slepice usmrtí a provede se histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

Provede se náhodný výběr mladých zdravých dospělých slepic, které nejsou ovlivněny virovými onemocněními a farmakologickou léčbou a mají normální chůzi, přiřadí se do experimentální a kontrolních skupin a nejméně 5 dnů před zahájením studie se aklimatizují na laboratorní podmínky.

Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

Zkoušená látka se podává každý den, 7 dnů v týdnu, nejlépe orálně sondou nebo želatinovými tobolkami. Kapaliny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu, např. kukuřičný olej, pevné látky by se měly nechat rozpustit, protože velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. Toxické vlastnosti nevodných vehikul by měly být známy před zkouškou, a pokud nejsou známy, měly by být předem určeny.

Doporučuje se mladá nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus), stará 8–12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a slepice by měly být chovány za podmínek umožňujících volný pohyb.

Obecně by měly být použity nejméně tři experimentální skupiny a kontrolní skupina s vehikulem. S výjimkou podání zkoušené látky se s kontrolní skupinou s vehikulem zachází stejně jako s experimentální skupinou.

V každé skupině by měl být použit dostatečný počet slepic, aby aspoň šest slepic mohlo být usmrceno pro biochemické vyšetření (tři v první a tři v druhý den po podání) a šest přežilo 14denní pozorování patologických příznaků.

Při výběru úrovní dávek by měly být vzaty v úvahu tři výsledky akutní zkoušky pozdní neurotoxicity a jakékoli další dostupné údaje o toxicitě a kinetice zkoušené sloučeniny. Nejvyšší úroveň dávky by měla být vybrána s cílem vyvolat toxické účinky, nejlépe pozdní neurotoxicitu, ne však uhynutí nebo zjevné utrpení. Dále by měla být zvolena sestupná řada dávek s cílem prokázat, že existuje závislost účinku na dávce a že nejnižší dávka nevyvolává žádné projevy toxicity.

Pokud zkouška provedená podle postupů popsaných v této studii při jedné dávce nejméně 1000 mg/kg tělesné hmotnosti na den nevyvolá pozorovatelné toxické účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití vyšší dávky nezbytná. Limitní zkouška se provádí s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek.

Všechna zvířata by měla být pozorována nejméně jednou denně po dobu expozice a 14 dnů po ní až do provedení pitvy podle plánu.

Zvířatům se podává zkoušená látka sedm dnů v týdnu po dobu 28 dnů.

Pozorování by měla začít okamžitě po podání. Všechny slepice se pečlivě pozorují jednou denně každý den z 28 dnů expozice a 14 dnů po expozici nebo do plánovaného usmrcení. Veškeré příznaky toxicity by měly být zaznamenány, včetně doby nástupu, typu, závažnosti a trvání. Pozorování má zahrnovat abnormality chování, ale nemá se na ně omezovat. Ataxie by měla být hodnocena podle nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice s patologickými příznaky vyjmou z klecí a podrobí zkoušce nucené motorické aktivity, jako např. stoupání po žebříku, aby se usnadnilo posouzení sebemenších toxických účinků. Zvířata v agónii a zvířata, která se trápí nebo trpí bolestí, se ihned vyřadí, humánně utratí a pitvají.

Všechny slepice se zváží těsně před podáním zkoušené látky a poté nejméně jednou týdně.

Šest slepic náhodně vybraných z každé experimentální skupiny a kontrolní skupiny s vehikulem a tři slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrtí v prvních dnech po podání poslední dávky, mozek a lumbální mícha se vypreparují a vyšetří se na inhibici NTE. Dále může být vhodné vypreparovat n. ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici aktivity NTE. Zpravidla se usmrtí tři slepice z kontrolní skupiny a z každé experimentální skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách od poslední dávky. Pokud údaje z akutní studie nebo z jiných studií (např. toxikokinetických) naznačují, že jsou vhodné jiné doby usmrcení po poslední dávce než tyto doby, měly by být použity a zdůvodnění by mělo být uvedeno v dokumentaci.

Na těchto vzorcích tkáně mohou být provedeny také analýza acetylcholinesterasy (AChE), je-li to považováno za vhodné. In vivo však může nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

Pitva všech zvířat (usmrcených podle plánu a utracených v agónii) by měla zahrnovat posouzení stavu mozku a míchy.

Nervová tkáň zvířat, která přežila dobu pozorování a nebyla použita pro biochemické studie, by měla být mikroskopicky vyšetřena. Tkáně by měly být fixovány in situ, za použití perfúzních technik. Odebírá se mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha a periferní nervy. Řez míchy by měl být proveden z horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální oblasti. Měly by být odebrány řezy distální části n. tibialis a jeho větví k m. gastrocnemius a z n. ischiadicus. Řezy se barví vhodnými barvivy na myelin a axony. Nejprve by mělo být provedeno mikroskopické vyšetření fixované tkáně všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny s vysokou dávkou. Pokud se u skupiny s vysokou dávkou projeví účinky, mělo by být mikroskopické vyšetření provedeno také na slepicích ze skupiny se střední a nízkou dávkou.

Negativní výsledky získané pro výsledné účinky zvolené v této metodě (biochemická a histopatologická vyšetření a vyšetření změn chování) nevyžadují zpravidla další zkoušení pozdní neurotoxicity. Při dvojznačných nebo neprůkazných výsledcích těchto vyšetření může být nezbytné další sledování.

Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat vykazujících léze, účinky na chování nebo biochemické účinky, typ a závažnost těchto lézí nebo účinků a procento zvířat vykazující každý typ a závažnost léze nebo účinku.

Údaje z této studie by měly být vyhodnoceny z hlediska výskytu, závažnosti a korelace účinků na chování a biochemických a histopatologických nálezů a dále jakýchkoli dalších pozorovaných účinků na experimentální a kontrolní skupiny.

Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by měla být zvolena již při plánování studie.

Protokol o zkoušce obsahuje pokud možno tyto informace:

• 3.1 Pokusná zvířata:

  • použité plemeno,

  • počet a stáří zvířat,

  • původ, podmínky chovu atd.,

  • hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky.

• 3.2 Zkušební podmínky:

  • podrobné údaje o přípravě zkoušené látky, popřípadě o její stálosti a homogenitě,

  • zdůvodnění volby vehikula,

  • podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky,

  • podrobné údaje o stravě a o kvalitě vody,

  • zdůvodnění výběru úrovní dávek,

  • specifikace podávaných dávek, včetně podrobných informací o vehikulu, objemu a fyzikální formě podané látky,

  • zdůvodnění jiných časů odběru pro biochemické vyšetření, není-li použito 24 a 48 hodin.

• 3.3 Výsledky:

  • údaje o tělesné hmotnosti,

  • údaje o toxických reakcích podle skupin, včetně mortality,

  • úroveň bez pozorovatelných nepříznivých účinků,

  • charakter, závažnost a trvání klinických projevů (zda byly vratné nebo nevratné),

  • podrobný popis biochemických vyšetření a nálezů,

  • pitevní nálezy,

  • podrobný popis všech histopatologických nálezů,

  • popřípadě statistické zpracování výsledků.

• Rozbor výsledků.

• Závěry.

Metoda je analogická metodě OECD TG 419.

Tato zkušební metoda byla odstraněna, protože již není uznávána jako vhodná pro získávání informací o toxikologických vlastnostech chemických látek pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006. Použitelné zkušební metody pro danou sledovanou vlastnost jsou uvedeny v tabulce 2 části 0.

Tabulka 1 Seznam vhodných látek

Zkratky: aq = vodný; č. CAS = Chemical Abstracts Service Registry Number (registrační číslo CAS); VRM = validovaná referenční metoda; C = žíravý; NC = nežíravý.

Zkoušená chemická látka je pokládána za látku, která nemá na kůži leptavé účinky (nežíravá látka):

• i) je-li střední hodnota TER změřená pro tuto zkoušenou chemickou látku větší než 5 kΩ; nebo
• ii) je-li střední hodnota TER naměřená u zkoušené chemické látky menší nebo rovna (≤) 5 kΩ a

  • terčíky kůže nevykazují žádné zjevné poškození (např. perforaci), a

  • střední obsah barviva v terčíku kůže je nižší než (<) střední obsah barviva v terčíku kůže získaný souběžně při použití 10M HCl jako pozitivní kontroly (viz odstavec 30, kde jsou uvedeny hodnoty pozitivní kontroly).

Zkoušená chemická látka je pokládána za látku, která má na kůži leptavé účinky (žíravá látka):

• i) je-li střední hodnota TER naměřená u zkoušené chemické látky menší nebo rovna (≤) 5 kΩ a terčíky kůže jsou zjevně poškozeny (např. perforovány); nebo
• ii) je-li střední hodnota TER naměřená u zkoušené chemické látky menší nebo rovna (≤) 5 kΩ a

  • terčíky kůže nejsou zjevně poškozeny (např. perforovány), ale

  • střední obsah barviva v terčíku kůže je větší nebo roven (≥) střednímu obsahu barviva v terčíku kůže získanému souběžně při použití 10M HCl jako pozitivní kontroly (viz odstavec 30, kde jsou uvedeny hodnoty pozitivní kontroly).

• Zkoušené chemické látky a kontrolní látky

  • jednosložková látka: chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.,

  • vícesložková látka, UVCB a směs: charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek,

  • fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

  • zdroj, číslo šarže, jsou-li k dispozici,

  • případně ošetření zkoušených látek chemických/kontrolních látek před zkoušením (např. zahřátí, mletí),

  • stabilita zkoušené chemické látky, datum použitelnosti nebo datum opětovné analýzy, je-li známo,

  • podmínky skladování.

• Pokusná zvířata:

  • použitý kmen a pohlaví,

  • stáří zvířat použitých jako dárcovská zvířata,

  • zdroj, podmínky chovu, potrava atd.,

  • podrobnosti přípravy kůže.

• Zkušební podmínky:

  • kalibrační křivky zkušebního přístroje,

  • kalibrační křivky pro zkoušku účinnosti vázání barviva, pásmová propustnost použitá pro měření hodnot optické hustoty, případně rozsah linearity přístroje měřícího optické hustoty (např. spektrofotometru),

  • podrobnosti zkušebního postupu pro měření TER,

  • případně podrobnosti zkušebního postupu pro stanovení vázání barviva,

  • použité zkušební dávky, doba (doby) expozice a teplota (teploty) expozice,

  • informace o použitém postupu vymývání po expozici,

  • počet replik terčíků kůže použitých na jednu zkoušenou chemickou látku a kontroly (pozitivní a negativní kontrola),

  • popis jakýchkoli úprav zkušebního postupu,

  • odkaz na historické údaje modelu. Ty by měly zejména zahrnovat:

    • i) přijatelnost hodnot TER pozitivních a negativních kontrol (v kΩ) s odkazem na rozsahy odporu pozitivních a negativních kontrol;
    • ii) přijatelnost hodnot obsahu barviva u pozitivních a negativních kontrol (v μg/terčík) s odkazem na rozpětí obsahu barviva u pozitivních a negativních kontrol;
    • iii) přijatelnost výsledků zkoušek s odkazem na historickou variabilitu mezi replikami terčíků kůže,

  • popis použitých kritérií rozhodování / predikčního modelu.

• Výsledky:

  • údaje změřených hodnot TER a případně obsahu vázaného barviva pro jednotlivé zkoušené chemické látky a kontroly, pro každé provedení zkoušky (experiment) a každou repliku terčíků kůže (jednotlivá zvířata a jednotlivé vzorky kůže), střední hodnoty, směrodatné odchylky a variační koeficienty zpracované ve formě tabulky,

  • popis jakýchkoli pozorovaných účinků,

  • odvozená klasifikace s odkazem na použitý predikční model / kritéria rozhodování.

• Diskuse o výsledcích

• Závěry

• (1) United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Dostupné na webových stránkách: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].
• (2) Kapitola B.4 této přílohy, Akutní dráždivé/leptavé účinky na kůži.
• (3) Kapitola B.40a této přílohy, Kožní model in vitro.
• (4) Kapitola B.65 této přílohy, Zkušební metoda s využitím membránové bariéry in vitro.
• (5) Kapitola B.46 této přílohy, Dráždivost pro kůži in vitro: Zkušební metoda za použití rekonstruované lidské epidermis.
• (6) OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
• (7) Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.
• (8) Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.
• (9) Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.
• (10) Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.
• (11) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. Publikace NIH č. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.
• (12) EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.
• (13) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.
• (14) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. Publikace NIH č. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.
• (15) OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
• (16) Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol.24, 507-512.
• (17) Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.
• (18) Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.
• (19) TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.
• (20) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Devlopment, Paris.

• vnitřní průměr teflonové trubičky,

• taková délka elektrod vzhledem k teflonové trubičce a receptorové trubičce, aby se elektrody nedotýkaly terčíku kůže a aby standardní délka elektrody byla ve styku s roztokem MgSO₄,

• objem roztoku MgSO₄ v receptorové trubičce musí vzhledem k hladině v teflonové trubičce dávat takovou výšku kapaliny, jak je znázorněno na obrázku 1,

• terčík kůže musí být k teflonové trubičce připevněn tak, aby elektrický odpor představoval skutečnou míru vlastností kůže.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

Úplný popis této zkušební metody byl odstraněn. Rovnocenná mezinárodní zkušební metoda je uvedena v tabulce 2 části 0.

• strukturální a funkční podobnost s třídou, do níž patří zkoušená látka,

• známé fyzikálně-chemické vlastnosti,

• podklady ze zkoušky LLNA,

• podklady získané při použití jiných zvířecích modelů a/nebo lidí.

Tabulka 1 Bodové hodnocení erytému

—Den 1Každé zvíře se zváží a zaznamená se jeho hmotnost a jakékoli poznatky z klinického pozorování. Na hřbet každého ucha se aplikuje 25 μl vhodně zředěného roztoku zkoušené látky, samotné vehikulum nebo pozitivní kontrola (tu lze provádět buď souběžně, nebo lze použít pozitivní kontrolu z nedávné jiné zkoušky – v závislosti na postupech dané laboratoře při zohlednění odstavců 11–15).—Den 2 a den 3Zopakuje se postup aplikace provedený v den 1.—Den 4 a den 5Žádná aplikace.—Den 6Zaznamená se hmotnost každého zvířete. Přes ocasní žílu se všem pokusným i kontrolním myším vpíchne 250 μl fyziologického roztoku ve fosfátovém pufru (PBS) obsahujícího 20 μCi (7,4×10⁵ Bq) [³H]thymidinu (tritiovaného na methylu). Jinou možností je všem myším přes ocasní žílu vpíchnout 250 μl PBS obsahujícího 2 μCi (7,4×10⁴ Bq) [¹²⁵I]joddeoxyuridinu a 10^–5 M fluordeoxyuridinu. O pět hodin (5 hod.) později se zvířata humánně usmrtí. U každého zvířete se vyjmou lymfatické uzliny drenující aurikulární oblast obou uší a zpracují se v PBS (individuální přístup) nebo se lymfatické uzliny vyjmou na obou stranách u všech myší z celé zkušební skupiny a společně se uloží do PBS (přístup založený na sdružení exponované skupiny). Podrobnosti a grafické znázornění vyhledání uzlin a jejich disekce lze nalézt v literatuře (12). Pro účely dalšího sledování lokální kožní reakce v rámci hlavní studie lze do protokolu studie zařadit i další parametry, jako je bodové ohodnocení erytému ucha nebo údaje o tloušťce ucha (získané buď pomocí tloušťkoměru, nebo na základě stanovení hmotnosti části ucha vyseknuté speciálními kleštěmi při pitvě).

• Zkoušené a kontrolní látky:

  • identifikační údaje (např. číslo CAS a číslo ES, jsou-li k dispozici, zdroj, čistota, známé nečistoty, číslo šarže),

  • skupenství a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. prchavost, stálost, rozpustnost),

  • jedná-li se o směs, je nutno uvést její složení a poměrné procentuální zastoupení složek.

• Rozpouštědlo/vehikulum:

  • identifikační údaje (čistota, popřípadě koncentrace, použitý objem),

  • zdůvodnění volby vehikula.

• Pokusná zvířata:

  • zdroj myší z kmene CBA,

  • mikrobiologický stav zvířat, je-li znám,

  • počet a věk zvířat,

  • původ zvířat, podmínky chovu, strava atd.

• Zkušební podmínky:

  • podrobnosti o přípravě a aplikaci zkoušené látky,

  • zdůvodnění volby dávkování (včetně výsledků předběžné screeningové zkoušky, pokud byla provedena),

  • použité koncentrace vehikula a zkoušené látky a celkové aplikované množství zkoušené látky,

  • podrobnosti o jakosti vody a potravy (včetně druhu/zdroje stravy, zdroje vody),

  • podrobnosti o harmonogramech expozice a odběru vzorků,

  • metody měření toxicity,

  • kritéria pro označení studie za pozitivní nebo negativní,

  • údaje o případných odchylkách od protokolu a vysvětlení, jakým způsobem taková odchylka ovlivňuje koncepci studie a její výsledky.

• Kontrola spolehlivosti:

  • souhrn výsledků nejnovější kontroly spolehlivosti včetně informací o použité zkoušené látce, koncentraci a vehikulu,

  • údaje ze souběžných a/nebo dřívějších pozitivních nebo negativních kontrolních skupin zkoušených v dotyčné laboratoři,

  • pokud souběžná pozitivní kontrola nebyla součástí studie, je nutno uvést datum a laboratorní zprávu nejnovější periodické pozitivní kontroly a podrobnou zprávu s údaji z dřívějších pozitivních kontrol zkoušených v dotyčné laboratoři, které odůvodňují rozhodnutí neprovádět souběžné pozitivní kontroly.

• Výsledky:

  • hmotnost jednotlivých myší na počátku aplikace a v době plánovaného usmrcení, jakož i průměrná hodnota a příslušný chybový výraz (např. SD, SEM) za každou exponovanou skupinu,

  • u každého zvířete časový průběh nástupu příznaků toxicity, včetně podráždění kůže v místě aplikace, pokud k němu dojde,

  • tabulka hodnot DPM a hodnot SI od jednotlivých myší (individuální přístup) nebo průměrných/mediánových hodnot (sdružený přístup) za každou exponovanou skupinu,

  • průměrná hodnota DPM na zvíře a příslušný chybový výraz (např. SD, SEM) za každou exponovanou skupinu a výsledky analýzy odlehlých hodnot za každou exponovanou skupinu při použití individuálního přístupu,

  • vypočtená hodnota SI a příslušná míra variability, která zohledňuje variabilitu mezi jednotlivými zvířaty jak z testování zkoušené látky, tak z kontrolních skupin při použití individuálního přístupu,

  • závislost odezvy na dávce,

  • případné statistické analýzy.

• Rozbor výsledků:

  • stručný komentář k výsledkům, k analýze závislosti odezvy na dávce a k případným statistickým analýzám a dále závěr, zda se má zkoušená látka považovat za senzibilizátor kůže.

• (1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
• (2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node a. s.say; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165–169.
• (3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node a. s.say: developments and applications, Toxicol., 93, 13–31.
• (4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node a. s.say: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563–79.
• (5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node a. s.say: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999–1002.
• (6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node a. s.say: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985–997.
• (7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327–33.
• (8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for a. s.sessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node a. s.say: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49–59.
• (9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node a. s.say: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258–273.
• (10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node a. s.say: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274–286.
• (11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node a. s.say: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249–257.
• (12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf].
• (13) OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
• (14) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
• (15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281–284.
• (16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181–185.
• (17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. K dispozici na adrese: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf].
• (18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/].
• (19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf].
• (20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
• (21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96.
• (22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/].
• (23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
• (24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71–89.
• (25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. K dispozici na adrese: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html].
• (26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.
• (27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
• (28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206.
• (29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.
• (30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245–256.
• (31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506.
• (32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60–68.
• (33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.
• (34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023–1028.
• (35) OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Paris, France. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
• (36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, K dispozici na adrese: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm].
• (37) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].

• zkoušená látka se myši aplikuje lokálně na obě uši,

• proliferace lymfocytů by se měla měřit v lymfatických uzlinách drenujících místo aplikace zkoušené látky,

• proliferace lymfocytů by se měla měřit během indukční fáze senzibilizace kůže,

• u zkoušených látek by se měla nejvyšší zvolená dávka rovnat maximální koncentraci, která nevyvolává systémovou toxicitu a/nebo nadměrné lokální podráždění kůže u myší. U pozitivních srovnávacích látek by měla být nejvyšší dávka alespoň tak vysoká jako hodnoty EC3 odpovídající srovnávací látky pro metodu LLNA (viz tabulka 1), aniž by vyvolala systémovou toxicitu a/nebo nadměrné lokální podráždění kůže u myší,

• v každé studii by měly být zahrnuty souběžné kontroly s vehikulem a případně by se měla použít také souběžná pozitivní kontrola,

• na každou dávkovou skupinu by se měla použít alespoň čtyři zvířata,

• lze shromažďovat údaje za jednotlivá zvířata nebo souhrnné údaje.

Není-li některé z těchto kritérií splněno, potom nelze tyto standardy funkčnosti k validaci podobné nebo modifikované metody použít.

• srovnávací látky uvedené v seznamu zastupovaly druhy látek, u nichž se zpravidla zjišťuje jejich potenciál způsobovat senzibilizaci kůže a řadu reakcí, které lze měřit nebo predikovat pomocí metody LLNA,

• látky měly jasně definovanou chemickou strukturu,

• pro každou látku byly k dispozici údaje ze zkoušek na morčatech za použití metody LLNA (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD č. 406) (13) a (pokud možno) údaje ze zkoušek na lidech a

• látky byly snadno dostupné z komerčního zdroje.

Doporučené srovnávací látky jsou uvedeny v tabulce 1. Studie za použití navrhovaných srovnávacích látek by se měly hodnotit ve vehikulu, s nímž jsou uvedeny v tabulce 1. V situacích, kdy některá uvedená látka nemusí být k dispozici, lze při odpovídající zdůvodnění použít jiné látky, které splňují uvedená kritéria výběru.

Tabulka 1 Doporučené Srovnávací látky pro standardy FUNKčnosti k metodě LLNA

Zkratky: AOO = aceton s olivovým olejem (v objemovém poměru 4:1); Číslo CAS = Registrační číslo Chemical Abstracts Service; DMF = N,N-dimethylformamid; DMSO = dimethylsulfoxid; DNCB = 2,4-dinitrochlorbenzen; EC3 = odhadovaná koncentrace potřebná k dosažení hodnoty 3 indexu stimulace; HCA = 2-benzylidenoktanal; kap. = kapalina; LLNA = výsledek zkoušky s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin myší (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD č. 429) (2); M = výsledek zkoušky na morčatech (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD č. 406) (13); MEK = ethyl(methyl)keton; NA = nelze použít, neboť index stimulace je menší než 3; NC = nevypočítává se, protože údaje byly získány z jediné studie; pev. = pevná látka; Skup. = skupenství; Veh. = zkušební vehikulum.