Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

PŘÍLOHA I METODY ODBĚRU VZORKŮ

1. ÚČEL A OBLAST POUŽITÍ

Vzorky určené pro úřední kontrolu krmiv se odeberou podle níže popsaných metod. Takto získané vzorky se považují za reprezentativní pro vzorkované partie.

Účelem odběru reprezentativních vzorků je získat malou frakci z šarže takovým způsobem, aby stanovení jakékoli konkrétní vlastnosti této frakce odpovídalo střední hodnotě vlastnosti šarže. Šarže se vzorkuje opakovaným odběrem dílčích vzorků v různých místech šarže. Tyto dílčí vzorky se spojí smícháním tak, aby vznikl jeden souhrnný vzorek, z něhož se reprezentativním dělením připraví konečné reprezentativní vzorky.

Pokud na základě vizuální kontroly či jiných relevantních informací vykazují partie krmiva, které mají být vzorkovány, odlišnost v kvalitě od zbytku krmiva z téže šarže, oddělí se tyto partie od zbytku krmiva a zachází se s nimi jako se samostatnou dílčí šarží. Pokud není možné rozdělit krmivo do samostatných dílčích šarží, vzorkuje se krmivo jako jedna šarže. V takových případech se tato skutečnost uvede do protokolu o odběru vzorku.

Je-li krmivo vzorkované v souladu s ustanoveními tohoto nařízení označeno jako krmivo, které nesplňuje požadavky EU, a je-li částí šarže krmiva stejné třídy nebo popisu, má se za to, že všechno krmivo dané šarže vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Odběr vzorků může rovněž zahrnovat krmiva, která provozovatelé krmivářských podniků nabízejí k prodeji komunikačními prostředky na dálku v souladu s čl. 11 odst. 3 nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 767/2009(Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 767/2009 ze dne 13. července 2009 o uvádění na trh a používání krmiv, o změně nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1831/2003 a o zrušení směrnice Rady 79/373/EHS, směrnice Komise 80/511/EHS, směrnic Rady 82/471/EHS, 83/228/EHS, 93/74/EHS, 93/113/ES a 96/25/ES a rozhodnutí Komise 2004/217/ES (Úř. věst. L 229, 1.9.2009, s. 1).). Odběr vzorků krmiv nabízených k prodeji komunikačními prostředky na dálku se v zásadě uskutečňuje podle bodů uvedených v této příloze. Zvláštní aspekty odběru vzorků prodeje na dálku jsou popsány v bodě 11.

• Šarže (nebo partie): identifikovatelné množství krmiva, které má vykazovat jednotné vlastnosti, jako je původ, druh, typ balení, balírna, dodavatel nebo označení, a v případě výrobního procesu jednotka vyrobeného množství z jednoho výrobního zařízení za použití jednotných výrobních parametrů nebo řada takových jednotek, pokud jsou vyráběny kontinuálně a skladovány společně.

• Vzorkovaná partie: šarže nebo identifikovaná část šarže nebo dílčí šarže.

• Zapečetěný vzorek: vzorek zapečetěný tak, aby k němu nebyl možný přístup bez porušení nebo odstranění pečeti.

• Dílčí vzorek: množství odebrané v jednom bodě vzorkované partie.

• Souhrnný vzorek: souhrn dílčích vzorků odebraných ze stejné vzorkované partie.

• Redukovaný vzorek: část souhrnného vzorku, která se získá reprezentativní redukcí jeho množství.

• Konečný vzorek: část souhrnného vzorku (směsného), redukovaného vzorku nebo homogenizovaného souhrnného vzorku v závislosti na typu kontroly (viz bod 9.4).

• Laboratorní vzorek: vzorek určený pro laboratoř (v podobě přijímané laboratoří), přičemž může jít o vzorek konečný, redukovaný nebo souhrnný.

• Vzorek prodeje na dálku: vzorek šarže nebo partie krmiva nabízeného k prodeji komunikačními prostředky na dálku.

• Odběr vzorků provádí osoby k tomu oprávněné příslušným orgánem.

• U vzorku prodeje na dálku si příslušný orgán vyžádá od provozovatele krmivářského podniku určité množství krmiva komunikačními prostředky na dálku.

• Vzorek musí být zapečetěn tak, aby k němu nebyl možný přístup bez porušení nebo odstranění pečeti.

Značka pečeti by měla být jednoznačně identifikovatelná a jasně viditelná.

• Identifikace vzorku: vzorek musí být nesmazatelně označen a musí být identifikován tak, aby existovala jednoznačná vazba na protokol o odběru vzorku.

• Z každého souhrnného vzorku nebo redukovaného vzorku se odeberou tyto konečné vzorky: jeden pro účely kontroly (vymahatelnosti) a jeden pro provozovatele krmivářského podniku (vzorek pro účely obhajoby). Případně je možné odebrat jeden další konečný vzorek pro účely srovnání. Pokud je celý souhrnný vzorek homogenizovaný, konečné vzorky se odeberou z homogenizovaného souhrnného vzorku, pokud tento postup není v rozporu s pravidly členských států ohledně práv provozovatelů krmivářských podniků.

• V souladu s čl. 15 odst. 1 a 2 nařízení (EU) 2017/625 provozovatelé krmivářských podniků, je-li to nezbytné pro provádění úředního odběru vzorků a jestliže to příslušné orgány požadují:

  • poskytnou pracovníkům příslušných orgánů přístup k vybavení pod svou kontrolou, v případě nutnosti včetně poskytnutí vhodného zařízení pro odběr vzorků a osobních ochranných prostředků,

  • jsou pracovníkům příslušných orgánů nápomocni a spolupracují s nimi s cílem umožnit odběr vzorků, včetně toho, že pracovníkům příslušných orgánů krmiva zpřístupní.

Pro odběr vzorků krmiva v pohybu lze použít vhodná mechanická zařízení. Mechanické zařízení se považuje za vhodné, pokud odebírá vzorek alespoň z celé sekce pohybu krmiva.

Odběr vzorků z krmiva v pohybu (při silném průtoku) lze provádět automatickými vzorkovači.

Pokud je to možné a vhodné, měl by se při přípravě reprezentativních redukovaných vzorků používat přístroj určený k dělení vzorků do přibližně stejných částí.

• Kvantitativní požadavky v bodech 5.1 a 5.2 na počet dílčích vzorků jsou použitelné na vzorkované partie o velikosti maximálně 500 tun, z nichž lze odebírat vzorky reprezentativním způsobem. Popsaný postup odběru vzorků je rovněž platný pro množství přesahující předepsanou maximální velikost vzorkované partie, pokud se nepřihlíží k maximálnímu počtu dílčích vzorků uvedenému v tabulkách obsažených v bodech 5.1.1, 5.1.3 a 5.1.5, kdy se počet dílčích vzorků určí na základě vzorce druhé odmocniny uvedené v příslušné části postupu (viz bod 5.3) a velikost minimálního souhrnného vzorku odpovídajícím způsobem vzroste. To nebrání tomu, aby byly velké šarže rozděleny do menších dílčích šarží a aby byla každá dílčí šarže vzorkována v souladu s postupem popsaným v bodě 5.1 a 5.2.

• Velikost vzorkované partie musí být taková, aby bylo možné odebrat vzorky ze všech jejích částí.

• V případě velmi velkých šarží a dílčích šarží (> 500 tun) a v případě šarží, které jsou přepravovány nebo skladovány tak, že není možné z nich odebrat vzorky v souladu s postupem pro odběr vzorků stanoveným v bodě 5.1 a 5.2 tohoto bodu, se použije postup odběru vzorků stanovený v bodě 5.3.

• U vzorků prodeje na dálku příslušný orgán obvykle nezná velikost šarže, z níž je dané množství vzorků požadováno. Proto nelze použít postup uvedený v bodech 5.1 a 5.2. V takovém případě se použije postup popsaný v bodě 11.

• V případě, že musí provozovatel krmivářského podniku podle požadavků právních předpisů postupovat v souladu s tímto nařízením v rámci povinného systému monitorování, smí se odchýlit od kvantitativních požadavků stanovených v tomto bodě za účelem zohlednění provozních vlastností za podmínky, že provozovatel krmivářského podniku ke spokojenosti příslušného orgánu prokázal rovnocennost postupu odběru vzorků z hlediska reprezentativnosti, a poté, co obdrží povolení příslušného orgánu.

• Ve výjimečných případech, pokud není možné použít metodu odběru vzorků z hlediska kvantitativních požadavků z důvodu nepřijatelných hospodářských důsledků vyplývajících z poškození šarže (kvůli formě obalu, způsobu přepravy, způsobu skladování atd.), může být použita alternativní metoda odběru vzorků za předpokladu, že je co nejreprezentativnější a je v úplnosti popsána a zdokumentována.

Krmivo (pevné i tekuté) může být baleno v pytlích, plechovkách, barelech atd., které se v tabulce níže označují jako balení. Odběr vzorků z velkých balení (≥ 500 kg nebo litrů) musí být prováděn v souladu s ustanoveními platnými pro volně ložené krmivo (viz body 5.1.1 a 5.1.2).

Nejméně jeden blok nebo liz ke vzorkování na jednu vzorkovanou partii obsahující 25 jednotek, maximálně čtyři bloky nebo lizy.

V případě bloků nebo lizů o hmotnosti nejvýše jeden kg se za dílčí vzorek považuje obsah jednoho bloku nebo jednoho lizu.

Tyto kvantitativní požadavky na dílčí vzorky se použijí v těchto situacích:

• při kontrole aflatoxinů, námelu žitného, jiných mykotoxinů a škodlivých botanických nečistot v krmných surovinách,

• při kontrole křížové kontaminace některou ze složek, včetně geneticky modifikovaného materiálu, nebo látkou, u níž se předpokládá, že je v krmivu rozložena nerovnoměrně.

V případě, že má kontrolní orgán silné podezření, že k tomuto nerovnoměrnému rozložení dochází také v případě křížové kontaminace některou ze složek nebo látkou v krmných směsích, mohou se uplatnit kvantitativní požadavky stanovené v tabulce níže.

V případě velkých vzorkovaných partií (vzorkované partie o hmotnosti > 500 tun) se počet dílčích vzorků, které mají být odebrány, rovná součtu 40 dílčích vzorků + √ tun v souvislosti s kontrolou látek nebo produktů rozložených v krmivu rovnoměrně nebo 100 dílčích vzorků + √ tun v souvislosti s kontrolou složek nebo látek, které jsou v krmivu pravděpodobně rozloženy nerovnoměrně.

Požaduje se jeden souhrnný vzorek na jednu vzorkovanou partii.

Požaduje se provedení analýzy alespoň u jednoho konečného vzorku. Množství v konečném vzorku pro analýzu nesmí být nižší než:

V případě, že způsob přepravy nebo skladování šarže neumožňuje odběr dílčích vzorků z celé šarže, měl by se odběr z těchto šarží pokud možno provádět tehdy, když je šarže v pohybu.

V případě velkých skladů určených ke skladování krmiv by měli být provozovatelé nabádáni, aby do skladu nainstalovali zařízení, které umožní (automatický) odběr vzorků z celé skladované šarže.

V případě uplatňování postupů odběru vzorků stanovených v tomto bodě se o postupu odběru vzorků informuje provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce. V případě, že provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce tento postup odběru vzorků zpochybní, umožní provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce příslušnému orgánu odběr vzorků z celé šarže na náklady provozovatele.

Odběr vzorků z velkých šarží na lodích se pokud možno provádí tehdy, když je produkt v pohybu (dynamický odběr vzorků).

Odběr vzorků se provádí po nákladových prostorech (jednotka, kterou lze fyzicky oddělit). Nákladové prostory se však částečně jeden po druhém vyprazdňují, takže počáteční fyzické oddělení po přesunu do skladovacího zařízení již neexistuje. Odběr vzorků lze proto provádět při počátečním fyzickém oddělování nebo při oddělování po přesunu do skladovacího zařízení.

Vykládka lodi může trvat několik dní. Odběr vzorků musí být za běžných okolností prováděn v pravidelných intervalech po celou dobu trvání vykládky. Přítomnost úředního inspektora za účelem odběru vzorků po celou dobu vykládky však není vždy možná nebo vhodná. Je proto možné provést odběr vzorků u části (vzorkovaná partie) celé šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie.

V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Přítomnost inspektora je nezbytná, i když se úřední vzorek odebírá automaticky. Avšak v případě, že za účelem zabránění podvodům probíhá automatický odběr vzorků s předem stanovenými parametry, které nelze během odběru změnit, a že jsou dílčí vzorky odebírány do zapečetěné nádoby, je přítomnost inspektora nutná pouze na počátku odběru vzorků, dále pokaždé, kdy je nutno vyměnit nádobu se vzorky, a na konci odběru vzorků.

V případech, kdy je odběr vzorků prováděn statickým způsobem, se musí použít stejný postup jako pro shora přístupná skladovací zařízení (sila) (viz bod 8.4.1).

Odběr vzorků se musí provádět na (shora) přístupné části šarže/nákladového prostoru. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Odběr vzorků se musí provádět na přístupné části šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Odběr vzorků se musí provádět na přístupné části šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Odběr vzorků krmiva skladovaného v těchto silech nelze provádět statickým způsobem. Pokud je třeba odebrat vzorky krmiva v takovém silu a není možné jeho obsah přemístit, je třeba se dohodnout s provozovatelem, že je povinen informovat inspektora o tom, kdy bude silo vykládáno, a umožnit mu odběr vzorků, až bude krmivo v pohybu.

Při odběru vzorků se postupuje tak, že se 50 až 100 kg krmiva upustí do nádoby a z ní se odebere vzorek. Velkost souhrnného vzorku odpovídá celé šarži a počet dílčích vzorků se řídí množstvím krmiva upuštěného ze sila do nádoby pro účely odběru vzorků. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Vzorky z těchto šarží lze často odebírat pouze při vykládce. V některých případech není vyložení v místě dovozu nebo kontroly možné, a odběr vzorků by proto měl proběhnout ve chvíli, kdy se tyto kontejnery vykládají.

Vzorky musí být odebrány a připraveny bez zbytečného prodlení a musí být učiněna nutná předběžná opatření pro zajištění toho, aby produkt nebyl pozměněn či kontaminován. Nástroje, plochy a nádoby na vzorky musí být čisté a suché.

Odběry dílčích vzorků se musí provádět náhodně a rovnoměrně v celé vzorkované partii a velikost dílčích vzorků musí být přibližně stejná.

Velikost dílčího vzorku v případě objemných krmiv/pícnin s nízkou měrnou hmotností je alespoň 100 gramů, resp. 25 gramů.

V případě, že musí být v souladu s pravidly pro postup odběru vzorků stanovenými v bodě 8 odebráno méně než 40 dílčích vzorků, stanoví se velikost dílčích vzorků podle požadované velikosti souhrnného vzorku (viz bod 6).

V případě odběru vzorků z malých šarží baleného krmiva, kde je podle kvantitativních požadavků třeba odebrat omezený počet dílčích vzorků, se považuje za dílčí vzorek obsah jednoho původního balení, jehož obsah nepřesahuje jeden kg nebo jeden litr.

V případě odběru vzorků z baleného krmiva sestávajícího z malých balení (např. < 250 g) závisí velikost dílčího vzorku na velikosti balení.

V případě vzorků prodeje na dálku závisí velikost dílčího vzorku na velikosti balení a v jednotlivých případech může rovněž obsahovat méně než 100 g nebo 100 ml.

V příslušných případech lze odebrat vzorky v průběhu manipulace se vzorkovanou partií (nakládka či vykládka).

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5, odebere se část obsahu každého balení pomocí vzorkovače nebo lopatky. V případě potřeby se vzorky odeberou po vyprázdnění každého balení zvlášť.

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, jak je uvedeno v bodě 5, jejich obsah se v případě potřeby homogenizuje a z každého balení se odebere určité množství.

Dílčí vzorky mohou být odebrány během stáčení obsahu.

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5, provede se odběr v různých vrstvách.

Vzorky mohou být odebrány rovněž během stáčení obsahu, avšak až po odstranění prvních frakcí.

V obou případech nesmí být celkový objem odebraných vzorků nižší než 10 litrů.

Poté, co byl vybrán požadovaný počet bloků nebo lizů k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5, z každého bloku nebo lizu se odebere část. V případě podezření na nehomogenní blok nebo liz lze jako vzorek odebrat celý blok nebo liz.

V případě bloků nebo lizů o hmotnosti nejvýše 1 kg se za dílčí vzorek považuje obsah jednoho bloku nebo jednoho lizu.

Dílčí vzorky se smíchají, aby vznikl jeden souhrnný vzorek.

Materiál v souhrnném vzorku se pečlivě promísí(Hrudky se rozdrtí (v případě potřeby se nejprve oddělí a po rozdrcení se vrátí do vzorku).).

Každý vzorek se vloží do vhodné nádoby. Učiní se všechna nutná předběžná opatření pro to, aby během přepravy nebo skladování nedošlo ke změně složení vzorku, kontaminaci či narušení.

V případě kontroly složek nebo látek rozložených v krmivu rovnoměrně lze souhrnný vzorek reprezentativně zredukovat na nejméně 2,0 kg nebo 2,0 litru (redukovaný vzorek)(S výjimkou objemných krmiv/pícnin s nízkou měrnou hmotností.), nejlépe s pomocí mechanického nebo automatického děliče. Pro účely kontroly přítomnosti reziduí pesticidů v luštěninách, zrnech obilovin a ořeších činí minimální velikost redukovaného vzorku 3 kg. Pokud druh krmiva neumožňuje použít dělič nebo pokud dělič není k dispozici, lze vzorek redukovat kvartací.

Konečné vzorky (pro kontrolu, obhajobu a případně srovnání) ze souhrnného vzorku nebo z redukovaných vzorků se poté odeberou v přibližně stejném množství a v souladu s kvantitativními požadavky bodu 7.

V případě kontroly složek, včetně geneticky modifikovaného materiálu, nebo látek, které jsou v krmivu pravděpodobně rozloženy nerovnoměrně, musí být souhrnný vzorek:

Konečné vzorky z redukovaného vzorku se poté odeberou v přibližně stejném množství a v souladu s kvantitativními požadavky bodu 7.

Nádoby nebo balení se zapečetí a opatří štítkem tak, aby je nebylo možno bez poškození pečeti otevřít. Celý štítek musí být součástí pečeti. Vzorek lze rovněž uložit do nádoby, kterou lze uzavřít tak, aby ji nebylo možné bez nevratného poškození nádoby otevřít, což zabrání jejímu opakovaném použití.

Vzorek se společně s údaji nutnými pro osobu provádějící analýzu bez zbytečného prodlení zašle do určené zkušební laboratoře.

O každém vzorku musí být veden protokol, který umožní jednoznačně identifikovat každou vzorkovanou partii a její velikost.

Do protokolu se uvedou veškeré odchylky od postupu odběru vzorků stanoveného v tomto nařízení.

Protokol se kromě úřední kontrolní laboratoře dá k dispozici provozovateli krmivářského podniku a/nebo laboratoři určené provozovatelem krmivářského podniku.

• U vzorku prodeje na dálku se krmivo vyžádá od provozovatele krmivářského podniku komunikačními prostředky na dálku. V takovém případě se příslušný orgán při žádosti o krmivo nemusí provozovateli krmivářského podniku identifikovat úřední totožností a může použít krycí identitu.

• Souhrnný vzorek a konečné vzorky vzorku prodeje na dálku musí být odebrány ihned po obdržení zásilky osobami k tomu oprávněnými. K vytvoření souhrnného vzorku musí být z celkového opatřeného množství náhodně a rovnoměrně odebrán vhodný počet dílčích vzorků, které musí být pečlivě promíseny/homogenizovány, co nejvíce v souladu se zásadami stanovenými v bodě 5 a v bodech 9.2 a 9.3. Pokud je krmivo zabaleno do jednotlivých balení, měla by být opatřena alespoň čtyři balení, z nichž musí být odebrán alespoň jeden dílčí vzorek. Pokud se v jednotlivých případech prokáže, že opatřená balení pocházejí z různých šarží, musí být počet balení, z nichž mají být odebrány vzorky, snížen a omezen na balení pocházející z téže šarže. V případě analýzy vzorku prodeje na dálku na složky nebo látky, které jsou v krmivu rozloženy nerovnoměrně, musí být počet dílčích vzorků nejméně 2,5krát vyšší než u vzorků analyzovaných na látky rozložené v krmivu rovnoměrně.

  Ze souhrnného vzorku se poté odeberou odpovídající konečné vzorky (pro účely kontroly, obhajoby a případně srovnání), pokud možno v souladu se zásadami stanovenými v bodě 9.4, a v protokolu o odběru vzorku se uvede, že se jedná o vzorek prodeje na dálku. Příslušný orgán poté o odběru vzorků neprodleně informuje provozovatele krmivářského podniku. Provozovateli krmivářského podniku se rovněž oznámí, že jeden vzorek (pro účely obhajoby) bude, pokud je to možné, pro jeho potřebu uchován příslušným orgánem na určeném místě pro účely obhajoby nebo se zašle provozovateli krmivářského podniku nebo se odešle do laboratoře určené provozovatelem krmivářského podniku v souladu s platnými vnitrostátními předpisy.

  Je-li vzorek odeslán přímo do úřední laboratoře, musí být konečný vzorek připraven a zapečetěn v laboratoři osobami k tomu oprávněnými nebo za přítomnosti osob k tomu oprávněných. Protokol o odběru vzorku prodeje na dálku musí být zaslán neprodleně po vytvoření konečných vzorků příslušnému orgánu, který o odběru vzorků informuje provozovatele krmivářského podniku.

  Má se za to, že množství dodané provozovatelem krmivářského podniku příslušnému orgánu představuje část šarže krmiva stejné třídy nebo popisu. V souladu s článkem 15 nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 178/2002(Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 178/2002 ze dne 28. ledna 2002, kterým se stanoví obecné zásady a požadavky potravinového práva, zřizuje se Evropský úřad pro bezpečnost potravin a stanoví postupy týkající se bezpečnosti potravin (Úř. věst. L 31, 1.2.2002, s. 1).) platí, že pokud bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, a to i u vzorku prodeje na dálku, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření (v příslušných případech během inspekce na místě) neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

PŘÍLOHA II OBECNÁ USTANOVENÍ O METODÁCH ANALÝZY KRMIV

A. PŘÍPRAVA VZORKŮ PRO ANALÝZU

Postupy popsané v této příloze se týkají přípravy pro analýzu vzorků, které byly odeslány do kontrolních laboratoří po odběru v souladu s ustanoveními v příloze I.

Laboratorní vzorky musí být připraveny tak, aby byly navážky stanovené v metodách analýzy pro konečné vzorky homogenní a reprezentativní.

Kromě postupů popsaných v této příloze musí být dodrženy pokyny pro přípravu vzorku stanovené v normě EN ISO 6498.

Postup přípravy vzorku, jímž je třeba se řídit, závisí na tom, které metody analýzy se mají použít a které složky nebo látky se mají kontrolovat. Proto je velmi důležité, aby byl příslušný postup přípravy vzorku vhodný pro použitou metodu analýzy a kontrolované složky nebo látky.

Veškeré nezbytné úkony musí být prováděny tak, aby se pokud možno zabránilo kontaminaci vzorku a změnám jeho složení.

Mletí, míchání a prosévání se provádí okamžitě při minimálním vystavení vzorku vlivům vzduchu a světla. Nesmí se používat mlýnky a drtiče, jež by mohly vzorek znatelně zahřát.

V případě krmiv, která jsou obzvláště citlivá na teplo, se doporučuje ruční drcení. Rovněž je třeba zajistit, aby zdrojem kontaminace nebyl samotný přístroj.

Homogenizace vzorku přípravou suspenze smícháním s vodou za vysokých otáček v některých případech prokazatelně poskytuje homogennější podvzorky než suchá homogenizace/mletí, zejména v případě nerovnoměrně rozložených chemických látek. Homogenizace pomocí dostatečného suchého mletí by však také mohla poskytnout homogenní podvzorky.

V některých případech, například pro stanovení obsahu námelu žitného, škodlivých botanických nečistot atd., nelze homogenizaci vzorku provést mletím, ale dostatečným promícháním vzorku.

Pokud nelze přípravu provést bez zásadních změn obsahu vlhkosti ve vzorku, stanoví se obsah vlhkosti před přípravou a po přípravě na základě metody uvedené v části A přílohy III.

Zkoušená část se odebírá z konečného homogenizovaného vzorku. Dělení vzorku kvartací se nedoporučuje, protože zkoušené části vzniklé tímto dělením mohou být zatíženy velkou chybou.

• Konečný vzorek se promíchá a odebere do vhodné čisté a suché nádoby se vzduchotěsným uzávěrem. Opět se promíchá s cílem zajistit úplnou homogenizaci bezprostředně před odvážením množství pro analýzu (zkoušená část).

• Nestanoví-li metody analýzy jinak, konečný vzorek se suší tak dlouho, dokud se jeho obsah vlhkosti nesníží na úroveň 8 až 12 %, a sice postupem pro předsoušení popsaným v bodě 4.3 metody pro stanovení obsahu vlhkosti uvedené v části A přílohy III. Poté se postupuje podle bodu 3.1.1.

• Konečný vzorek se odebere do vhodné čisté a suché nádoby se vzduchotěsným uzávěrem. Důkladně se promíchá s cílem zajistit úplnou homogenizaci bezprostředně před odvážením množství pro analýzu (zkoušená část).

• Konečné vzorky, které nemohou být připraveny jedním z výše uvedených postupů, se upraví jakýmkoliv jiným postupem, který zajistí, že navážky pro analýzu (zkoušená část) budou pro konečné vzorky homogenní a reprezentativní.

• V případě vizuální prohlídky (bez použití mikroskopu) se ke zkoušce použije celý souhrnný nebo konečný vzorek.

• V případě zkoumání mikroskopem může laboratoř souhrnný vzorek zredukovat nebo takto redukovaný vzorek dále zredukovat. Konečné vzorky pro účely obhajoby a případně srovnání se odeberou postupem rovnocenným postupu odběru konečného vzorku pro účely vymahatelnosti.

• Pokud je celý souhrnný vzorek homogenizovaný, konečné vzorky se odeberou z homogenizovaného souhrnného vzorku.

• Pro stanovení obsahu námelu žitného a škodlivých botanických nečistot se konečný vzorek rozdělí na dva podvzorky o stejné hmotnosti přibližně 500 gramů. Vyšetří se jeden podvzorek. V případě, že je výsledek podvzorků roven 50 % (analytický práh) maximálního limitu nebo je nižší, je vzorek v souladu s maximálním limitem. Je-li výsledek vyšší než 50 % maximálního limitu, je třeba vyšetřit další podvzorek a pro kontrolu souladu s maximálním limitem se použije průměr výsledku z těchto dvou podvzorků.

Vzorky musí být skladovány při takové teplotě, která nezmění jejich složení. Vzorky určené k analýze na obsah vitaminů nebo látek, které jsou obzvláště citlivé na světlo, se skladují tak, aby nedošlo k nepříznivému ovlivnění vzorku působením světla.

Některé metody vyžadují zvláštní extrakční postup. Obecně platí, že jiné extrakční postupy, než jsou postupy uvedené v dané metodě, mohou být použity jen pod podmínkou, že se prokáže, že použitý extrakční postup má na zkoušenou matrici rovnocennou extrakční účinnost jako postup uvedený v dané metodě.

Některé metody vyžadují zvláštní postup čištění. Obecně platí, že jiné postupy čištění, než jsou postupy uvedené v dané metodě, mohou být použity jen pod podmínkou, že se prokáže, že použitý postup čištění vykazuje pro zkoušenou matrici rovnocenné výsledky analýzy jako postup uvedený v dané metodě.

Pokud je v případě analýzy na nežádoucí látky výsledek prvního stanovení výrazně (> 50 %) nižší než kontrolovaná specifikace, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality. V ostatních případech je zapotřebí opakovaná analýza (druhé stanovení) pro vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného pomíchání vzorků. Pro další posouzení se použije střední hodnota těchto dvou stanovení.

Pokud jsou v případě kontroly minimálních nebo maximálních úrovní doplňkových látek výsledky prvního stanovení vyšší než minimální úroveň nebo nižší než maximální úroveň, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality. V ostatních případech je zapotřebí opakovaná analýza (druhé stanovení) pro vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného pomíchání vzorků. Pro další posouzení se použije střední hodnota těchto dvou stanovení.

Pokud v případě kontroly deklarovaného obsahu látky nebo složky výsledek prvního stanovení potvrdí deklarovaný obsah, tj. jestliže výsledek analýzy spadá do přijatelného rozsahu odchylky od deklarovaného obsahu, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality. V ostatních případech je zapotřebí opakovaná analýza (druhé stanovení) pro vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného pomíchání vzorků. Pro další posouzení se použije střední hodnota těchto dvou stanovení (průměrný výsledek analýzy spadá, nebo nespadá do přijatelného rozsahu odchylky od deklarovaného obsahu).

V některých případech je tento přijatelný rozsah odchylky vymezen v právních předpisech, např. v nařízení (ES) č. 767/2009 a nařízení Evropského parlamentu a Rady (EU) 2019/4(Nařízení Evropského parlamentu a Rady (EU) 2019/4 ze dne 11. prosince 2018 o výrobě, uvádění na trh a používání medikovaných krmiv, o změně nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 183/2005 a o zrušení směrnice Rady 90/167/EHS (Úř. věst. L 4, 7.1.2019, s. 1).).

Použitá metoda analýzy se uvede do protokolu o analýze.

Výsledek analýzy se vyjádří způsobem, který je stanoven v metodě analýzy, příslušným počtem platných číslic a v případě potřeby se koriguje na obsah vlhkosti v konečném vzorku před přípravou.

Většina regulačních limitů (např. maximální úroveň, minimální úroveň) v právních předpisech EU týkajících se krmiv je stanovena ve vztahu ke krmivu o obsahu vlhkosti 12 %. V těchto případech je proto za účelem posouzení výsledku analýzy naměřeného u vzorku vzhledem k regulačnímu limitu třeba výsledek analýzy nejprve vydělit obsahem sušiny ve vzorku (v %) vynásobeným 88, jak je uvedeno v tomto vzorci:

kde:

Dále musí být splněny tyto podmínky:

• výsledek analýzy je výrazně (> 50 %) nižší nebo vyšší než kontrolovaná informace/specifikace v označení (v závislosti na tom, zda informace/specifikace v označení představuje maximální nebo minimální úroveň),

• obsah vlhkosti ve vzorkovaném krmivu je znám a lze stanovit, že korekce na obsah vlhkosti dané posouzení nezmění,

  pokud byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality a analýza slouží pouze pro účely kontroly souladu s právními předpisy, lze korekci na obsah vlhkosti vynechat (např. v případech, kdy neexistuje žádná specifikace nebo regulační limit), není-li to nezbytné pro interpretaci.

Je-li výsledek analýzy korigován na obsah vlhkosti, musí být stejným postupem korigována také odpovídající nejistota měření.

V případě stanovení obsahu námelu žitného nebo škodlivých botanických nečistot vizuálním/mikroskopickým zkoumáním není korekce na obsah vlhkosti nutná.

Pokud jde o nežádoucí látky ve smyslu směrnice 2002/32/ES, považuje se produkt určený ke krmení za nevyhovující stanovenému maximálnímu obsahu, pokud se na základě výsledku analýzy jakožto střední hodnoty dvou nezávislých stanovení u krmiva o obsahu vlhkosti 12 % pokládá maximální obsah za překročený, přičemž se zohlední rozšířená nejistota měření při analýze a použije se koeficient rozšíření 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %, a korekce na výtěžnost. To znamená, že k posouzení souladu se použije analyzovaná koncentrace poté, co byla korigována na výtěžnost, a poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření při analýze. Tento postup se použije pouze v případech, kdy metoda analýzy umožňuje odhad rozšířené nejistoty měření při analýze a korekci na výtěžnost (nevyžaduje se např. v případě vizuálního/mikroskopického zkoumání).

Pokud výsledek analýzy vzorku odebraného pro účely obhajoby překročí maximální obsah (bez zohlednění rozšířené nejistoty měření při analýze), potvrzuje to nesoulad s kontrolním vzorkem, pokud v tomto ohledu neexistují zvláštní vnitrostátní předpisy.

Výsledek analýzy (pokud použitá metoda analýzy umožňuje odhad rozšířené nejistoty měření při analýze) se oznámí v této podobě:

• a) je-li to vhodné a relevantní, musí být korigován na výtěžnost a případná korekce musí být uvedena. Výtěžnost musí být uvedena, pokud není součástí postupu vnitřní korekce na vychýlení, přičemž vychýlením se rozumí rozdíl mezi naměřenou hodnotou a referenční koncentrací. Korekce na výtěžnost není nutná v případě, že výtěžnost je v rozmezí 90–110 %;
• b) ve tvaru „x +/– U“, kde „x“ je výsledek analýzy a „U“ je rozšířená nejistota měření při analýze s použitím koeficientu rozšíření 2(Intervalu spolehlivosti ve výši 95 % lze dosáhnout i použitím jiného koeficientu, jako je t-rozdělení.), který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %.

Pokud je však výsledek analýzy výrazně (> 50 %) nižší než kontrolovaná specifikace, a jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality a analýza slouží jen pro účely kontroly souladu s právními předpisy, lze zprávu o výtěžnosti a o rozšířené nejistotě měření při analýze vynechat (např. v případech, kdy neexistuje žádná specifikace nebo regulační limit), není-li nejistota měření nezbytná pro interpretaci.

Za účelem kontroly dodržování povoleného minimálního a maximálního obsahu doplňkových látek se přítomnost doplňkové látky považuje za nevyhovující stanovenému minimálnímu a maximálnímu obsahu, pokud se na základě výsledku analýzy jakožto střední hodnoty dvou nezávislých stanovení u krmiva o obsahu vlhkosti 12 % pokládá:

• maximální obsah za překročený, přičemž se zohlední rozšířená nejistota měření při analýze a korekce na výtěžnost. To znamená, že k posouzení souladu se použije analyzovaná koncentrace (tj. střední hodnota uvedených dvou stanovení) poté, co byla korigována na výtěžnost, a poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření při analýze,

• minimální obsah za nedosažený, přičemž se zohlední rozšířená nejistota měření při analýze a korekce na výtěžnost. To znamená, že k posouzení souladu se použije analyzovaná koncentrace (tj. střední hodnota uvedených dvou stanovení) poté, co byla korigována na výtěžnost, a poté, co byla přičtena rozšířená nejistota měření při analýze,

Pokud výsledek analýzy vzorku odebraného pro účely obhajoby překročí maximální obsah (bez zohlednění rozšířené nejistoty měření při analýze), potvrzuje to nesoulad s kontrolním vzorkem, pokud v tomto ohledu neexistují zvláštní vnitrostátní předpisy.

Výsledek analýzy (pokud použitá metoda analýzy umožňuje odhad rozšířené nejistoty měření při analýze) se oznámí v této podobě:

• a) je-li to vhodné a relevantní, musí být korigován na výtěžnost a případná korekce musí být uvedena. Výtěžnost musí být uvedena, pokud není součástí postupu vnitřní korekce na vychýlení, přičemž vychýlením se rozumí rozdíl mezi naměřenou hodnotou a referenční koncentrací. Korekce na výtěžnost není nutná v případě, že výtěžnost je v rozmezí 90–110 %;
• b) ve tvaru „x +/– U“, kde „x“ je výsledek analýzy (střední hodnota uvedených dvou stanovení) a „U“ je rozšířená nejistota měření při analýze s použitím koeficientu rozšíření 2(Intervalu spolehlivosti ve výši 95 % lze dosáhnout i použitím jiného koeficientu, jako je t-rozdělení.), který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %.

PŘÍLOHA III METODY ANALÝZY PRO KONTROLU SLOŽENÍ KRMNÝCH SUROVIN A KRMNÝCH SMĚSÍ

A. STANOVENÍ OBSAHU VLHKOSTI

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vlhkosti v krmivech. V případě, že krmivo obsahuje těkavé látky, např. organické kyseliny, je třeba zohlednit, že spolu s obsahem vlhkosti se stanoví i značné množství těkavých látek.

Tato metoda se nevztahuje na analýzu mléčných výrobků jako krmných surovin a krmných směsí, které jsou tvořeny převážně mléčnými výrobky, analýzu živočišných a rostlinných tuků a olejů ani na analýzu olejnatých semen a plodů.

Stanovení obsahu vlhkosti v olejnatých semenech se stanoví metodou uvedenou v normě EN ISO 665 (Stanovení vlhkosti a obsahu těkavých látek) s tím, že sójové boby musí být před stanovením obsahu vlhkosti rozemlety.

Vzorek se suší za předepsaných podmínek, které závisejí na druhu krmiva. Úbytek hmotnosti se stanoví vážením. U pevných krmiv s vysokým obsahem vlhkosti je nutné provést předsoušení.

Odebere se minimálně 50 g vzorku. Pokud je to nutné, vzorek se rozdrtí nebo rozmělní takovým způsobem, aby nedošlo ke změně obsahu vlhkosti (viz bod 6).

Odebere se minimálně 50 g vzorku. Toto množství se rozemele tak, aby alespoň 50 % částic prošlo sítem s oky o velikosti 0,5 mm a zbytek na sítě s kulatými oky o velikosti 1 mm činil maximálně 10 %.

Odebere se přibližně 25 g vzorku s přesností na 10 mg, smíchá se s odpovídajícím množstvím předem vysušeného písku zváženého s přesností na 10 mg, až vznikne homogenní hmota.

Vysoušečka (bod 3.3) s víčkem se suší v sušárně nastavené na 103 °C po dobu 30 minut ± 1 min. Ze sušárny se poté vytáhne a nechá se vychladnout na teplotu okolí v exsikátoru (bod 3.6).

Vysoušečka s víčkem se zváží s přesností na 1 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží přibližně 5 g vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do sušárny předehřáté na 103 °C. Aby se zabránilo nežádoucímu poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Sušení probíhá čtyři hodiny, přičemž doba sušení se počítá od okamžiku, kdy teplota v sušárně opět dosáhla 103 °C. Po otevření vakuové laboratorní sušárny se vysoušečka ihned opět uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (bod 3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg.

U krmiv, která se převážně (> 50 %) skládají z olejů a tuků živočišného a rostlinného původu, se suší v sušárně ještě dalších 30 minut při teplotě 103 °C. Rozdíl mezi těmito dvěma váženími nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.

Vysoušečka s víčkem se zváží s přesností na 0,5 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží přibližně 5 g rozdrceného vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do sušárny předehřáté na 130 °C. Aby se zabránilo nežádoucímu poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Sušení probíhá dvě hodiny, přičemž doba sušení se počítá od okamžiku, kdy teplota v sušárně opět dosáhla 130 °C. Po otevření vakuové laboratorní sušárny se vysoušečka ihned opět uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (bod 3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg.

Vysoušečka s víčkem se zváží s přesností na 0,5 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží přibližně 5 g vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do vakuové sušárny (bod 3.5) předehřáté na 80–85 °C. Aby se zabránilo nežádoucímu poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji.

Tlak se upraví na 100 torrů a vzorek se suší při tomto tlaku čtyři hodiny buď pomocí přívodu horkého a suchého vzduchu, nebo pomocí vysoušecího prostředku (přibližně 300 g na 20 vzorků). V tomto druhém případě se přeruší spojení s vakuovou pumpou, jakmile bylo dosaženo předepsaného tlaku. Doba sušení se počítá od okamžiku, kdy bylo v sušárně opět dosaženo teploty 80–85 °C. Potom se tlak v sušárně opatrně upraví zpět na atmosférický tlak. Po otevření vakuové laboratorní sušárny se vysoušečka ihned opět uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (bod 3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg. Vysoušečka se suší dalších 30 minut ve vakuové sušárně při teplotě 80–85 °C a znovu se zváží. Rozdíl mezi těmito dvěma váženími nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.

Před jemným mletím je nezbytné „vlhká“ krmiva s hmotnostním podílem nižším než 85 % sušiny (např. pícniny, směsné krmné dávky, (ne)tekutá krmiva) částečně vysušit, aby bylo možné analyzovat jejich stabilní látky; u nestabilních látek není částečné sušení možné.

Částečné sušení lze provést buď za použití sušárny s nucenou cirkulací vzduchu či mikrovlnné sušárny, nebo mrazovým sušením. S výjimkou částečného sušení mrazovým sušením je cílem vysušit krmivo při zachování teploty vzorku pod 60 °C, aby bylo chemické složení co nejméně ovlivněno. Sušení při teplotách vyšších než 60 °C způsobuje chemické změny v krmivu (např. rozklad bílkovin). Vysušené krmivo se před měřením částečného obsahu sušiny nechá ekvilibrovat při laboratorní teplotě po dobu přibližně 15 minut, aby se minimalizovala potenciální změna vlhkosti, k níž může dojít při mletí a skladování. Sušením při teplotách nižších než 60 °C se z krmiva neodstraní veškerá voda; (počáteční) částečné sušení proto nepředstavuje celkovou sušinu daného krmiva. Po sušení se podvzorek rozemele a analyzuje se na (konečnou) sušinu částečně sušeného vzorku (zbývající 3 % až 15 % vlhkosti), pokud se stanovují jiné chemické složky.

Proto se pro stanovení obsahu sušiny doporučuje dvoufázový postup. Nejprve se stanoví částečný obsah sušiny (pokud se jedná o méně než 85 % sušiny), poté se stanoví obsah zbývající sušiny na rozemletém zkušebním vzorku a částečný obsah sušiny se vynásobí obsahem zbývající sušiny, aby se stanovil celkový obsah sušiny.

Obsah vlhkosti (X) jako procento vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

kde:

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 0,2 % absolutní hodnoty vlhkosti, s výjimkou vlhkého krmiva pro zvířata v zájmovém chovu a žvýkacích pamlsků pro psy, kde rozdíl nesmí překročit 0,5 % absolutní hodnoty vlhkosti.

Pokud je nutné vzorek rozdrtit a pokud se na základě toho musí počítat se změnou obsahu vlhkosti produktu, je nutno korigovat výsledky analýzy jednotlivých složek krmiva podle obsahu vlhkosti vzorku v jeho původním stavu.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vody a těkavých látek v živočišných a rostlinných tucích a olejích.

Vzorek se vysuší do konstantní hmotnosti při 103 °C (úbytek hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími musí být maximálně 1 mg). Úbytek hmotnosti se stanoví vážením.

Do misky (bod 3.1), předem vysušené a zvážené, opatřené teploměrem (bod 3.2) se naváží přibližně 20 g homogenizovaného vzorku s přesností na 1 mg. Zahřívá se na pískové lázni nebo na topné desce (bod 3.3) za stálého promíchávání teploměrem tak, aby teplota během asi 7 minut dosáhla 90 °C.

Zahřívání se sníží a sleduje se intenzita tvorby bublin, které stoupají ode dna misky. Teplota nesmí přesáhnout 105 °C. V důkladném míchání ode dna misky se pokračuje, dokud se nepřestanou tvořit bubliny.

Během zahřívání se vzorek několikrát zahřeje na 103 ± 2 °C a ochladí na 93 °C, aby se zajistilo úplné odstranění vlhkosti. Poté se nechá vychladnout na laboratorní teplotu v exsikátoru (bod 3.4) a zváží se. Tento postup se opakuje, dokud není dosaženo úbytku hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími nepřesahujícího 2 mg.

Obsah vlhkosti (X) jako procento vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Výsledky nižší než 0,05 % musí být uváděny jako „nižší než 0,05 %“.

Rozdíl ve vlhkosti mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 0,1 % v absolutní hodnotě.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu hrubého proteinu v krmivech na základě stanovení obsahu dusíku podle Kjeldahlovy metody(Obsah dusíku lze stanovit ve všech krmivech, avšak přepočítací koeficient 6,25 pro výpočet obsahu hrubého proteinu nemusí být použitelný pro krmné suroviny z hmyzu (nižší přepočítací koeficient) a některé krmivo pro zvířata v zájmovém chovu a bílkoviny krevní plazmy (vyšší přepočítací koeficient).).

Vzorek se mineralizuje kyselinou sírovou za přítomnosti katalyzátoru. Kyselý roztok se alkalizuje roztokem hydroxidu sodného. Amoniak se vydestiluje a jímá se do odměřeného množství kyseliny sírové a přebytek se titruje standardním roztokem hydroxidu sodného.

Uvolněný amoniak se případně vydestiluje do přebytku roztoku kyseliny borité a následně se titruje roztokem kyseliny chlorovodíkové nebo kyseliny sírové.

Přístroje vhodné pro provedení mineralizace, destilace a titrace podle Kjeldahlovy metody.

Do mineralizační baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 15 g síranu draselného (bod 3.1) a vhodné množství katalyzátoru (bod 3.2) (0,3–0,4 g oxidu měďnatého nebo 0,9–1,2 g síranu měďnatého, pentahydrátu, 25 ml kyseliny sírové (bod 3.4) a, pokud je třeba, několik granulí pemzy (bod 3.12) a zamíchá se.

Baňka se zahřívá nejprve mírně a podle potřeby se občas zamíchá, dokud nedojde ke zuhelnatění hmoty a neustane pěnění; potom se intenzita zahřívání zvyšuje, dokud se kapalina ustáleně nevaří. Zahřívání je odpovídající, pokud vroucí kyselina kondenzuje na stěnách baňky. Nesmí docházet k přehřívání stěn baňky a k ulpívání organických částic na stěnách baňky.

Jakmile se roztok stane čirým a získá světle zelené zabarvení, pokračuje se v ohřevu ještě dvě hodiny a potom se ponechá vychladnout.

Opatrně se přidá tolik vody, aby došlo k úplnému rozpuštění sulfátů. Nechá se vychladnout a potom se přidá několik granulí zinku (bod 3.3), pokud je třeba. Dále se postupuje podle bodu 5.2.1 nebo 5.2.2.

Do předlohy destilačního zařízení se odměří přesně 25 ml kyseliny sírové (bod 3.5) nebo (bod 3.7) podle předpokládaného obsahu dusíku. Přidá se několik kapek indikátoru methylčerveň (bod 3.8).

Mineralizační baňka se připojí ke kondenzátoru destilačního přístroje a konec kondenzátoru se ponoří do kapaliny v předloze do hloubky nejméně 1 cm (viz poznámka v bodě 8.3). Do mineralizační baňky se zvolna přilije 100 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.9) tak, aby nedošlo ke ztrátám amoniaku (viz poznámka v bodě 8.1). Baňka se zahřívá, dokud se nepředestiluje veškerý amoniak.

V případě manuální titrace amoniakového obsahu destilátu se použije níže popsaný postup. Pokud je destilační jednotka plně automatická a zahrnuje titraci amoniakového obsahu destilátu, dodrží se pokyny výrobce pro provoz destilační jednotky.

Předloha s obsahem 25–30 ml roztoku kyseliny borité (bod 3.18) se umístí pod otvor kondenzátoru tak, že jeho vývod je ponořen pod hladinu přebytku roztoku kyseliny borité. Destilační jednotka se upraví na dávkování 50 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.9). S destilační jednotkou se pracuje podle pokynů výrobce a oddestiluje se amoniak uvolněný přidáním roztoku hydroxidu sodného. Destilát se jímá do roztoku kyseliny borité. Množství destilátu (doba destilace párou) závisí na množství dusíku ve vzorku. Je třeba dodržet pokyny výrobce.

Dále se postupuje podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2.

Přebytek kyseliny sírové v předloze se titruje roztokem hydroxidu sodného (bod 3.10 nebo 3.11) podle použité koncentrace kyseliny sírové do dosažení koncového bodu.

Obsah předlohy se titruje se standardním odměrným roztokem kyseliny chlorovodíkové (bod 3.19) nebo se standardním odměrným roztokem kyseliny sírové (bod 3.6) s použitím byrety a odečte se množství použitého titračního činidla.

Pokud se použije kolorimetrická detekce koncového bodu, je koncového bodu dosaženo při prvním zbarvení obsahu do růžova. Odečte se objem byretou s přesností na 0,05 ml. Koncový bod může být zřetelnější při použití osvětlené desky magnetické míchačky nebo fotometrického detektoru.

Lze provést automaticky s použitím parního destilátoru s automatickou titrací.

Je třeba dodržet pokyny výrobce pro provoz konkrétního destilačního přístroje nebo destilačního/titračního přístroje.

Při použití plně automatické destilační jednotky lze automatickou titraci amoniaku provést rovněž pomocí detekce koncového bodu s použitím potenciometrického systému pH.

V tomto případě se použije automatický titrační přístroj s pH metrem. pH metr je správně kalibrován v rozsahu pH 4–7 podle běžných laboratorních postupů pro kalibraci pH.

Takto bude pH koncového bodu titrace dosaženo při hodnotě pH 4,6, přičemž se jedná o nejstrmější skok na titrační křivce (inflexní bod).

Pro potvrzení, že všechna použitá činidla jsou prostá dusíku, se provede slepá zkouška (mineralizace, destilace a titrace) s 1 g sacharózy (bod 3.14) místo vzorku.

Výpočet se provede podle bodu 6.1 nebo 6.2.

Obsah hrubého proteinu vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Obsah hrubého proteinu vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Obsah hrubého proteinu vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

• 0,4 % v absolutní hodnotě u obsahu hrubého proteinu do 20 %,

• 2,0 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu hrubého proteinu od 20 % do 40 %,

• 0,8 % v absolutní hodnotě u obsahu hrubého proteinu nad 40 %.

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v různých laboratořích nesmí překročit:

• 1,8 % v absolutní hodnotě u obsahu hrubého proteinu do 20 %,

• 9,0 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu hrubého proteinu od 20 % do 40 %,

• 3,6 % v absolutní hodnotě u obsahu hrubého proteinu nad 40 %.

Provede se analýza (mineralizace, destilace a titrace) vhodného množství acetanilidu (bod 3.13) (např. 0,2 až 0,3 g) za přítomnosti 1 g sacharózy (bod 3.14); spotřeba kyseliny sírové (bod 3.5) na 1 g acetanilidu je 14,80 ml. Výtěžnost musí být nejméně 99 %.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu močoviny použité jako doplňková látka v krmivech pro přežvýkavce.

Vzorek s čeřicím činidlem se rozmíchá ve vodě. Suspenze se přefiltruje. Obsah močoviny ve filtrátu se stanoví po přidání 4-dimethylaminobenzaldehydu (4-DMAB) měřením optické hustoty při vlnové délce 420 nm.

Do 500 ml odměrné baňky se naváží 2 g vzorku s přesností na 1 mg a přidá se 1 g aktivního uhlí (bod 3.4). Přidá se 400 ml vody a 5 ml Carrezova činidla I (bod 3.2), míchá se po dobu přibližně 30 sekund a přidá se 5 ml Carrezova činidla II (bod 3.3). Míchá se po dobu 30 minut na míchacím zařízení. Doplní se vodou po značku, protřepe se a přefiltruje.

Do zkumavek se skleněnými zábrusovými zátkami se odpipetuje 5 ml čirého, bezbarvého filtrátu, přidá se 5 ml roztoku 4-DMAB (bod 3.1) a promíchá. Zkumavky se vloží do vodní lázně nastavené na teplotu 20 °C (± 4 °C). Po patnácti minutách se změří optická hustota roztoku vzorku na spektrofotometru při vlnové délce 420 nm. Porovná se slepou zkouškou roztoku činidel.

Do odměrných baněk na 100 ml se napipetuje 1, 2, 4, 5 a 10 ml roztoku močoviny (bod 3.5) a doplní se po značku vodou. Z těchto roztoků se odpipetuje 5 ml, ke každému se přidá 5 ml roztoku 4-DMAB (bod 3.1), homogenizuje se a změří se optická hustota, jak je uvedeno výše, a porovná s kontrolním roztokem obsahujícím 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez močoviny. Sestaví se kalibrační křivka.

Stanoví se množství močoviny ve vzorku s použitím kalibrační křivky.

Výsledek se vyjádří v mg močoviny na kg vzorku.

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v téže laboratoři a týmž laborantem nesmí překročit:

• při 420 nm

  • 50 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu močoviny od 3000 mg/kg do méně než 5000 mg/kg,

  • 25 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu močoviny od 5000 mg/kg do méně než 7000 mg/kg,

  • 20 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu močoviny 7000 mg/kg či více,

• při 435 nm

  • 40 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu močoviny od 3000 mg/kg do méně než 5000 mg/kg,

  • 25 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu močoviny od 5000 mg/kg do méně než 9000 mg/kg,

  • 5 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu močoviny 9000 mg/kg či více.

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v různých laboratořích a/nebo různými laboranty nesmí překročit:

• při 420 nm

  • 3000 mg/kg v absolutní hodnotě u obsahu močoviny od 3000 mg/kg do méně než 12000 mg/kg,

  • 4500 mg/kg v absolutní hodnotě u obsahu močoviny 12000 mg/kg či více,

• při 435 nm

  • 50 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu močoviny od 3000 mg/kg do méně než 8000 mg/kg,

  • 25 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu močoviny 8000 mg/kg či více.

V EU bylo provedeno mezilaboratorní srovnání, jehož se zúčastnilo 18 laboratoří. Pět pozitivních vzorků krmných směsí pro přežvýkavce (v tabulkách 1 a 2 označených jako MAT) bylo analyzováno (jedna analýza) v slepých duplikátech a jeden slepý vzorek krmné směsi pro přežvýkavce byl analyzován jednou.

Výpočty mezních hodnot opakovatelnosti (r) a reprodukovatelnosti (R), jak jsou vymezeny v mezinárodních pokynech, byly provedeny po vyloučení odlehlých hodnot pomocí analýzy rozptylu platných hodnot.

Vypočtené hodnoty účinnosti metody (opakovatelnost, reprodukovatelnost) jsou uvedeny v tabulkách níže. U všech zkušebních vzorků včetně slepého vzorku nebyly zjištěny žádné falešně pozitivní ani falešně negativní výsledky.

Tabulka 1 Charakteristiky účinnosti metody pro močovinu měřené při λ = 420 nm ve všech materiálech

Tabulka 2 Charakteristiky účinnosti metody pro močovinu měřené při λ = 435 nm ve všech materiálech

Metody analýzy, které se mají použít pro stanovení obsahu aminokyselin (kromě tryptofanu), jsou:

• EN ISO 13903 Krmiva – Stanovení obsahu aminokyselin,

• EN ISO 17180 Krmiva – Stanovení lyzinu, methioninu a threoninu v komerčně dostupných výrobcích a premixech obsahujících aminokyseliny(Metoda analýzy stanovená v normě EN 17180 se označuje jako alternativní metoda, která se má použít pro účely úřední kontroly ke stanovení obsahu aminokyselin v krmivech obsahujících více než 10 % aminokyselin.),

• metoda analýzy popsaná v bodech 1 až 10 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu volných (syntetických a přírodních) a celkových (na peptidy vázaných a volných) aminokyselin v krmných surovinách, krmných směsích a premixech obsahujících méně než 10 %(Tato metoda nebyla validována na základě kolaborativní zkoušky pro premixy obsahující více než 10 % doplňkových látek. Je však použitelná i na tyto matrice s vhodnými drobnými úpravami za předpokladu, že je poté validována interně. Další informace jsou k dispozici na adrese: https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation) každé aminokyseliny za použití analyzátoru aminokyselin. Metoda je použitelná pro tyto aminokyseliny: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin a valin.

Tato metoda nerozlišuje mezi jednotlivými solemi aminokyselin a neumožňuje také u aminokyselin rozlišovat mezi formami D a L. Není použitelná pro stanovení tryptofanu nebo hydroxyanalogů aminokyselin.

Volné aminokyseliny se extrahují zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Současně extrahované dusíkaté makromolekuly se vysráží kyselinou sulfosalicylovou a odstraní se filtrací. Přefiltrovaný roztok se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují ionexovou chromatografií a stanoví se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm.

Zvolený postup závisí na zkoumaných aminokyselinách. Cyst(e)in a methionin musí být před hydrolýzou oxidovány na kyselinu cysteovou a na methioninsulfon. Tyrosin se musí stanovovat v hydrolyzátech neoxidovaných vzorků. Všechny ostatní aminokyseliny uvedené v bodě 1 (Účel a oblast použití) mohou být stanovovány buď v oxidovaném, nebo v neoxidovaném vzorku.

Oxidace se provádí při 0 °C směsí kyseliny permravenčí a fenolu. Nadbytečné oxidační činidlo se rozloží disiřičitanem sodným. Oxidovaný nebo neoxidovaný vzorek se hydrolyzuje kyselinou chlorovodíkovou (bod 3.20) po 23 hodin. Hydrolyzát se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují ionexovou chromatografií a stanovují se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm (440 nm pro prolin).

Musí být použita dvakrát destilovaná voda nebo voda obdobné jakosti (vodivost < 10 μS).

300 g NaOH (bod 3.5) se rozpustí ve vodě a doplní na 1 litr.

40 g NaOH (bod 3.5) se rozpustí ve vodě a doplní na 1 litr.

smíchá se 889 g kyseliny mravenčí (bod 3.2) se 111 g vody a přidá se 4,73 g fenolu (bod 3.3).

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s oky o velikosti 0,5 mm. Vzorky s vysokou vlhkostí se musí před mletím vysušit buď na vzduchu při teplotě nepřesahující 50 °C, nebo mrazovým sušením. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (bod 3.12).

Do kónické baňky se naváží příslušné množství (1–5 g) připraveného vzorku (bod 5.1) s přesností na 0,2 mg a přidá se 100,0 ml extrakční směsi (bod 3.21). Směs se třepe 60 minut na mechanické třepačce nebo magnetické míchačce (bod 4.8). Po usazení sedimentu se odpipetuje 10,0 ml supernatantu do 100 ml kádinky.

Za stálého míchání se přidá 5,0 ml roztoku kyseliny sulfosalicylové (bod 3.22) a pokračuje se v míchání na magnetické míchačce dalších 5 minut. Supernatant se přefiltruje nebo odstředí tak, aby se odstranila veškerá sraženina. 10,0 ml výsledného roztoku se přenese do 100 ml kádinky, pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (bod 3.18), potom se roztok převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (bod 3.24) do odměrné baňky přiměřené velikosti a doplní po značku tlumivým roztokem (bod 3.24).

Použije-li se vnitřní standard, přidá se 1,00 ml vnitřního standardu (bod 3.27.3) na každých 100 ml konečného roztoku a potom se doplní po značku tlumivým roztokem (bod 3.24).

Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Nejsou-li extrakty zkoušeny týž den, uchovávají se při teplotě pod 5 °C.

0,1–1 g připraveného vzorku (bod 5.1) se odváží s přesností na 0,2 mg:

• do 100 ml baňky s kulatým dnem (bod 4.1) pro otevřenou hydrolýzu (bod 5.3.2.3) nebo

• do 250 ml baňky s kulatým dnem (bod 4.1), požaduje-li se nízká koncentrace sodíku (bod 5.3.3.1), nebo

• do 100 ml nádoby se šroubovacím uzávěrem (bod 4.2) pro uzavřenou hydrolýzu (bod 5.3.2.4).

Navážka vzorku musí mít obsah dusíku přibližně 10 mg a obsah vlhkosti nepřesahující 100 mg.

Baňka/nádoba se umístí do lázně s ledovou vodou a ochladí se na teplotu 0 °C, potom se přidá 5 ml oxidační směsi (bod 3.23) a promíchá se skleněnou lžící se zahnutou špičkou. Baňka/nádoba se uzavře i se lžící vzduchotěsnou fólií a vloží se v s lázni s ledovou vodou do chladničky a ponechá se v ní 16 hodin při teplotě 0 °C. Po 16 hodinách se vyjme z chladničky a přebytečné oxidační činidlo se rozloží přidáním 0,84 g disiřičitanu sodného (bod 3.4).

Dále se postupuje podle bodu 5.3.2.1.

Podle toho, jakou toleranci k sodíku má analyzátor aminokyselin (bod 4.9), postupuje se při úpravě pH podle bodu 5.3.3.1, nebo 5.3.3.2.

Hydrolyzát (bod 5.3.3.1 nebo 5.3.3.2) s upraveným pH se kvantitativně převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (bod 3.24) do 200 ml odměrné baňky a doplní se po značku tlumivým roztokem (bod 3.24).

Nebyl-li dosud použit vnitřní standard, přidají se 2,00 ml vnitřního standardu (bod 3.27.3) a potom se doplní po značku citrátovým tlumivým roztokem (bod 3.24). Důkladně se promíchá.

Dále se pokračuje v chromatografii (bod 5.4).

Nejsou-li roztoky vzorků zkoušeny týž den, uchovávají se při teplotě pod 5 °C.

Před chromatografií musí mít extrakt (bod 5.2) nebo hydrolyzát (bod 5.3.4) laboratorní teplotu. Směs se protřepe a potřebné množství se přefiltruje 0,22μm membránovým filtrem (bod 4.5). Výsledný čirý roztok se podrobí ionexové chromatografii s použitím analyzátoru aminokyselin (bod 4.9).

Nástřik lze provést ručně nebo automaticky. Přitom je důležité, aby se do kolony přidávalo stejné množství roztoku ± 0,5 % pro analýzu standardů a vzorků s výjimkou případu, kdy je použit vnitřní standard. Rovněž poměr sodíku a aminokyselin by měl být v standardních roztocích a v roztocích vzorků co možná nejpodobnější.

Frekvence kalibrace závisí hlavně na stabilitě ninhydrinového činidla a analytickém systému. Standard nebo vzorek se ředí citrátovým tlumivým roztokem (bod 3.24) tak, aby plocha píku standardu tvořila 30–200 % plochy píku aminokyseliny ve vzorku.

Chromatografie aminokyselin se mírně liší v závislosti na typu použitého analyzátoru a použité pryskyřice. Zvolený systém musí být schopen separovat jednotlivé aminokyseliny od sebe navzájem i od ostatních ninhydrin-pozitivních materiálů. Chromatografický systém musí v rozsahu měření poskytovat lineární odezvu na změny obsahu aminokyselin přidaných do kolony.

Při zkoušení equimolárního roztoku (stanovovaných aminokyselin) by mělo být při chromatografii dosaženo níže uvedených poměrů výšky sedla k vrcholu píku. Tento equimolární roztok musí obsahovat nejméně 30 % maximálního obsahu jednotlivých aminokyselin, což může být přesně měřeno na použitém analyzátoru aminokyselin (bod 4.9).

Při separaci threoninu a serinu nesmí poměr výšky sedla k vrcholu nižšího z píků těchto dvou překrývajících se aminokyselin na chromatogramu přesahovat 2:10 (pokud se stanovuje pouze cyst(e)in, methionin, threonin a lysin, je stanovení nepříznivě ovlivněno nedostatečnou separací od přilehlých píků). Pro všechny ostatní aminokyseliny musí být separace lepší než 1:10.

Systém musí zaručit, že lysin bude separován od „lysinových náhražek“ a ornithinu.

Plocha píků vzorku a standardu se měří pro každou jednotlivou aminokyselinu a vypočte se množství (X) aminokyseliny v g na kg vzorku.

Je-li použit vnitřní standard, násobí se výsledek:

Cystin a cystein se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanoví jako kyselina cysteová, ale vypočtou se jako cystin (C₆H₁₂N₂O₄S₂, M 240,30 g/mol) s použitím MV 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Methionin se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanoví jako methioninsulfon, ale vypočte se jako methionin s použitím M methioninu: 149,21 g/mol.

Přidaný volný methionin se stanoví po extrakci jako methionin, pro výpočet se použije stejná M.

Vobjem výsledného extraktu.

Tato metoda byla vyzkoušena v mezinárodní srovnávací studii v roce 1990 při použití čtyř různých krmiv (krmná směs pro prasata, krmná směs pro brojlery, proteinový koncentrát, premix).

Po vyloučení odlehlých hodnot jsou výsledky mezinárodní srovnávací studie z roku 1990 u středních a standardních odchylek uvedeny v tabulkách v tomto bodě:

Střední hodnoty v g/kg

n = počet zúčastněných laboratoří

Opakovatelnost vyjádřená jako „vnitrolaboratorní standardní odchylka“ u srovnání podle předcházející tabulky je uvedena v následujících tabulkách:

Variační koeficient (%) opakovatelnosti (CV_r)

n = počet zúčastněných laboratoří

Výsledky pro mezilaboratorní standardní odchylku vyplývající z výše uvedeného srovnání jsou uvedeny v následující tabulce:

Variační koeficient (%) reprodukovatelnosti (CV_R)

n = počet zúčastněných laboratoří

Správné použití uvedené metody se ověří opakovaným měřením certifikovaných referenčních materiálů, jsou-li k dispozici. Doporučuje se kalibrace certifikovanými kalibračními roztoky aminokyselin.

U všech aminokyselin je nutno zkontrolovat rozsah lineární odezvy přístroje.

Standardní roztok se ředí citrátovým tlumivým roztokem tak, aby se dosáhlo ploch píků uprostřed tohoto rozsahu.

Kompilace výsledků (s výjimkou tyrosinu) pocházejících ze dvou kolaborativních studií (z roku 1990 uvedené v bodě 7 výše a z roku 2005 uvedené v normě EN ISO 13903) udává následující kritéria pro opakovatelnost a reprodukovatelnost. Hodnoty odvozené z těchto dvou mezilaboratorních zkoušek nemusí být použitelné pro jiné než uvedené rozsahy koncentrací a matrice.

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v téže laboratoři a týmž laborantem nesmí překročit:

• 6 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkových aminokyselin v případě glycinu, alaninu, lysinu, prolinu, kyseliny glutamové, isoleucinu a histidinu,

• 8 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkových aminokyselin v případě threoninu, fenylalaninu, methioninu, kyseliny asparagové a leucinu,

• 10 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkových aminokyselin v případě argininu a valinu,

• 12 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkové aminokyseliny serinu,

• 15 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkové aminokyseliny cyst(e)inu.

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v různých laboratořích a/nebo různými laboranty nesmí překročit:

• 15 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkových aminokyselin v případě glycinu, alaninu a threoninu,

• 20 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkových aminokyselin v případě lysinu, prolinu, fenylalaninu, methioninu a kyseliny asparagové,

• 22 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkových aminokyselin v případě kyseliny glutamové a leucinu,

• 27 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkové aminokyseliny argininu,

• 32 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkové aminokyseliny isoleucinu,

• 35 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkových aminokyselin v případě valinu a serinu,

• 40 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkové aminokyseliny histidinu,

• 50 % vzhledem k vyšší hodnotě u celkové aminokyseliny cyst(e)inu.

Metody analýzy, které se mají použít pro stanovení obsahu tryptofanu, jsou:

• EN ISO 13904 Krmiva – Stanovení obsahu tryptofanu,

• metoda analýzy popsaná v bodech 1 až 9 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech. Nerozlišuje mezi D- a L- formou.

Pro stanovení celkového tryptofanu se vzorek hydrolyzuje za alkalických podmínek nasyceným roztokem hydroxidu barnatého při 110 °C po dobu 20 hodin. Po hydrolýze se přidává vnitřní standard.

Pro stanovení volného tryptofanu se vzorek extrahuje za mírně kyselých podmínek v přítomnosti vnitřního standardu.

Tryptofan a vnitřní standard se stanoví v hydrolyzátu nebo extraktu metodou HPLC s fluorescenční detekcí.

40,0 g NaOH (bod 3.5) se rozpustí ve vodě a vodou (bod 3.1) se doplní na 1 litr.

492 ml HCl (bod 3.7) se doplní vodou na 1 litr.

82 ml HCl (bod 3.7) se doplní vodou na 1 litr.

8,2 ml HCl (bod 3.7) se doplní vodou na 1 litr.

34 ml kyseliny fosforečné (bod 3.6) se doplní vodou (bod 3.1) na 1 litr.

v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2553 g tryptofanu (bod 3.2) v kyselině chlorovodíkové (bod 3.13) a doplní se jí po značku. Skladuje se při –18 °C nejdéle 4 týdny.

v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2728 g α-methyl-tryptofanu (bod 3.3) v kyselině chlorovodíkové (bod 3.13) a doplní se jí po značku. Skladuje se při –18 °C nejdéle 4 týdny.

2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofanu (bod 3.15) a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (α-methyl-tryptofanu) (bod 3.16) se zředí vodou (bod 3.1) a methanolem (bod 3.8) přibližně na stejný objem a přibližně na stejnou koncentraci methanolu (10–30 %) jako v konečném hydrolyzátu.

Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Během přípravy musí být roztok chráněn před slunečním světlem.

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s oky o velikosti 0,5 mm. Vzorky s vysokou vlhkostí se musí před mletím vysušit buď na vzduchu při teplotě nepřesahující 50 °C, nebo mrazovým sušením. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (bod 3.9).

Vhodné množství (1–5 g) připraveného vzorku (bod 5.1) se naváží s přesností na 1 mg do kónické baňky. Přidá se 100,0 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (bod 3.16). Směs se třepe nebo míchá 60 minut na mechanické třepačce nebo magnetické míchačce (bod 4.7). Sediment se nechá usadit a odpipetuje se 10,0 ml supernatantu do kádinky. Přidá se 5 ml kyseliny fosforečné (bod 3.14). pH se upraví na 3 roztokem hydroxidu sodného (bod 3.10). Přidá se tolik methanolu (bod 3.8), aby jeho koncentrace v konečném objemu byla 10–30 %. Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na objem potřebný pro chromatografické stanovení (přibližně stejný objem, jako má kalibrační standardní roztok (bod 3.17)).

Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45μm membránový filtr (bod 4.5). Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Standardní roztok a extrakty je nutno chránit před přímým slunečním světlem. Pokud není možné provést analýzu extraktů tentýž den, extrakty lze skladovat při 5 °C nejdéle tři dny.

Do polypropylenové baňky (4.4) se naváží 0,1–1 g připraveného vzorku (bod 5.1) s přesností na 0,2 mg. Navážka vzorku musí mít obsah dusíku přibližně 10 mg. Přidá se 8,4 g oktahydrátu hydroxidu barnatého (bod 3.4) a 10 ml vody. Promíchá se ponorným mixérem (bod 4.8) nebo na magnetické míchačce (bod 4.7). Magnet s teflonovým povrchem se ponechá ve směsi. Stěny nádoby se opláchnou 4 ml vody. Nádoba se uzavře a víčko se volně dotáhne. Uzavřená nádoba se umístí do autoklávu (bod 4.6) s vroucí vodou a nechá se působit pára po dobu 30–60 minut. Potom se autokláv uzavře a směs se autoklávuje 20 hodin při teplotě 110 (± 2) °C.

Před otevřením autoklávu se sníží teplota těsně pod 100 °C. Aby se zabránilo krystalizaci Ba(OH)₂·8H₂O, přidá se k horké směsi 30 ml vody o laboratorní teplotě. Mírně se zamíchá nebo protřepe. Přidají se 2,00 ml roztoku koncentrovaného vnitřního standardu (α-methyl-tryptofanu) (bod 3.16). Nádoba se vychladí 15 minut ve vodní lázni s ledem.

Dále se přidá 5 ml kyseliny fosforečné (bod 3.14). Nádoba se ponechá v ledové lázni a za stálého míchání se neutralizuje roztokem kyseliny chlorovodíkové (bod 3.11) a potom se pH upraví na 3,0 roztokem kyseliny chlorovodíkové (bod 3.12). Přidá se tolik methanolu, aby jeho koncentrace v konečném objemu byla 10–30 %. Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na stanovený objem, který je nutný pro chromatografické stanovení (např. 100 ml). Přídavek methanolu nesmí způsobit tvorbu sraženiny.

Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45μm membránový filtr (bod 4.5). Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Standardní roztok a hydrolyzáty je nutno chránit před přímým slunečním světlem. Pokud není možné provést analýzu hydrolyzátů tentýž den, hydrolyzáty lze skladovat při 5 °C nejdéle tři dny.

Následující podmínky izokratické eluce jsou doporučené; lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky (viz také poznámky v bodě 9.1 a 9.2):

Vypočte se obsah tryptofanu (X) v g na 100 g vzorku.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 10 % relat. z hodnoty nejvyššího výsledku.

Za účelem certifikace metody pro hydrolýzu byla provedena v EU kolaborativní studie (4. srovnání), během níž byly analyzovány tři vzorky v až 12 laboratořích. U každého vzorku bylo provedeno pět opakovaných analýz. Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

Za účelem certifikace metody pro extrakci volného tryptofanu byla provedena v EU další kolaborativní studie (3. srovnání), během níž byly analyzovány dva vzorky v až 13 laboratořích. U každého vzorku bylo provedeno pět opakovaných analýz. Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

Za účelem certifikace metody pro hydrolýzu tryptofanu byla provedena v EU další srovnávací studie, během níž byly analyzovány čtyři vzorky v až 7 laboratořích. Výsledky jsou uvedeny níže. U každého vzorku bylo provedeno pět opakovaných analýz.

Po izokratické eluci následuje gradientové čištění kolony:

Chromatografický systém musí v rozsahu měření poskytovat lineární odezvu. Lineární odezva se měří s konstantní (běžnou) koncentrací vnitřního standardu a různými koncentracemi tryptofanu. Je důležité, aby velikost píků tryptofanu i vnitřního standardu byla v lineárním rozsahu HPLC/fluorescenčního systému. Pokud je (jsou) pík(y) tryptofanu a/nebo vnitřního standardu příliš velký (velké) nebo příliš malý (malé), analýza se zopakuje s jinou velikostí vzorku a/nebo s jiným konečným objemem.

Stárnutím hydroxidu barnatého se zhoršuje jeho rozpustnost, což způsobuje, že roztok pro stanovení HPLC není čirý a výsledky obsahu tryptofanu mohou být nízké.

Touto metodou se stanoví obsah hrubých olejů a tuků v krmivech.

Podle druhu a složení krmiva a podle účelu, pro který se analýza provádí, se použije jeden ze dvou níže uvedených postupů.

Pro stanovení obsahu hrubých olejů a tuků v olejnatých semenech a plodech, jakož i v krmivech, v nichž je obsah hrubých olejů/tuků vyšší než 15 %, se extrakce provádí postupem A a opětovná extrakce postupem B (bod 5.3).

Tato metoda je použitelná pro krmiva rostlinného původu s výjimkou těch, která jsou uvedena v postupu B.

Tato metoda je použitelná pro krmiva živočišného původu a pro všechny krmné směsi. Má se používat pro všechny materiály, z nichž není možné oleje a tuky zcela extrahovat bez předchozí hydrolýzy (např. lepek, kvasnice, bramborové proteiny a produkty, které byly podrobeny zpracování, jako je extruze, vločkování a ohřev).

Ve všech případech, kdy se dosáhlo postupem B vyššího výsledku než postupem A, je třeba považovat za platnou hodnotu výsledek dosažený postupem B.

Vzorek se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek se vysuší a zváží.

Vzorek se hydrolyzuje za horka s kyselinou chlorovodíkovou. Směs se ochladí a přefiltruje. Zbytek na filtru se promyje a vysuší a dále se pokračuje ve stanovení podle postupu A.

Do extrakční patrony (bod 4.2) se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg a patrona se uzavře tukuprostou vatou.

Patrona se umístí do extrakčního přístroje (bod 4.1) a extrahuje se šest hodin petroletherem (bod 3.1). Petroletherový extrakt se jímá do suché, předem zvážené baňky s úlomky pemzy(Pokud má být vyextrahovaný olej nebo tuk použit pro další zkoušky kvality, nahradí se úlomky pemzy skleněnými kuličkami.).

Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek v baňce se vysuší 1,5 hodiny v sušárně (bod 4.3). Nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se. Suší se dalších 30 minut, aby se zajistila konstantní hmotnost olejů a tuků (úbytek hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími nesmí být větší než 1 mg).

Do 400 ml kádinky nebo do 300 ml kónické baňky se naváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg (viz bod 8.2) a přidá se 100 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.3) a úlomky pemzy. Kádinka se přikryje hodinovým sklem nebo se ke kónické baňce připojí zpětný chladič. Směs se přivede do mírného varu nad malým plamenem nebo na topné desce a udržuje se tak jednu hodinu. Produkt se nesmí usazovat na stěnách nádoby.

Směs se vychladí a přidá se dostatečné množství filtračního prostředku (bod 3.4), aby se zabránilo ztrátám oleje a tuku během filtrace. Filtruje se přes zvlhčený, tukuprostý dvojitý filtrační papír. Zbytek na filtru se promývá studenou vodou, dokud není filtrát neutrální. Provede se kontrola, zda filtrát neobsahuje žádný olej nebo tuk, jinak je nutné před hydrolýzou provést extrakci vzorku petroletherem podle postupu A.

Dvojitý filtrační papír se zbytkem po hydrolýze se umístí na hodinové sklo a suší se 1,5 hodiny ve vzduchové sušárně (bod 4.3) při 100 ± 3 °C.

Dvojitý filtrační papír s vysušeným zbytkem se vloží do extrakční patrony (bod 4.2) a utěsní se tukuprostou vatou. Patrona se umístí do extrakčního přístroje (bod 4.1) a dále se postupuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5.1.

Pro stanovení obsahu hrubých olejů a tuků v olejnatých semenech a plodech, jakož i v krmivech, v nichž je obsah hrubých olejů/tuků vyšší než 15 %, se extrakce provádí postupem A a opětovná extrakce postupem B.

To znamená, že po extrakci petroletherem (postup A) se zbytek nebo část zbytku znovu extrahuje kyselinou chlorovodíkovou (postup B). Obsah hrubých olejů a tuků je součtem výsledků postupů A a B.

Hmotnost zbytku se vyjádří jako procento vzorku.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku týmž laborantem nesmí překročit:

• 0,2 % v absolutní hodnotě u obsahu hrubých olejů a tuků nižšího než 5 %,

• 4,0 % relat. z hodnoty nejvyššího výsledku u obsahu 5–10 %,

• 0,4 % v absolutní hodnotě u obsahu nad 10 %.

Naváží se 20 g vzorku s přesností na 1 mg, promíchá se s 10 nebo více gramy bezvodého síranu sodného (bod 3.2). Extrahuje se petroletherem (bod 3.1) podle bodu 5.1. Získaný extrakt se doplní petroletherem (bod 3.1) na objem 500 ml a promíchá. Do malé, suché, předem zvážené baňky s úlomky pemzy se odměří 50 ml tohoto roztoku. Rozpouštědlo se oddestiluje a po vysušení se postupuje podle posledního odstavce bodu 5.1.

Ze zbytku po extrakci v patroně se odstraní veškeré rozpouštědlo a zbytek se umele tak, aby prošel sítem s oky 1 mm. Potom se vrátí do extrakční patrony (síran sodný se již nepřidává) a postupuje se podle druhého a třetího odstavce bodu 5.1.

Obsah olejů a tuků se vypočte jako procento vzorku podle tohoto vzorce:

kde:

m₁hmotnost zbytku po první extrakci v gramech (alikvotní části extraktu),m₂hmotnost zbytku po druhé extrakci v gramech.

Tato metoda umožňuje stanovit v krmivu obsah tukuprostých organických látek, které jsou nerozpustné v roztoku kyseliny a zásady a jsou běžně nazývány hrubá vláknina.

Tato metoda není použitelná v případě lignocelulózy a rostlinného uhlí (příliš jemné částice).

Vzorek se v případě potřeby odtuční a působí se na něj postupně vroucím roztokem kyseliny sírové a hydroxidu draselného o přesně stanovené koncentraci. Zbytek se oddělí filtrací přes skleněný filtrační kelímek, promyje, vysuší, zváží a spálí při teplotě 475–500 °C. Úbytek váhy po spálení odpovídá obsahu hrubé vlákniny ve zkušebním vzorku.

Do filtračního kelímku (bod 4.2) se naváží 1 g připraveného vzorku s přesností na 1 mg (viz poznámky v bodech 9.1, 9.2 a 9.3) a přidá se 1 g filtrační pomůcky (bod 3.3).

Filtrační kelímek (bod 4.2) se připojí k zahřívací jednotce (bod 4.1) a poté k hydrolyzační nádobce (bod 4.3). Do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku se nalije 150 ml vroucího roztoku kyseliny sírové (bod 3.1) a v případě potřeby se přidá několik kapek odpěňovacího činidla (bod 3.2).

Kapalina se přivede během 5 ± 2 minut do varu a intenzivně se vaří přesně 30 minut.

Otevře se vypouštěcí ventil (bod 4.1) a kyselina sírová se odsaje za použití vakua přes filtrační kelímek a zbytek se promyje třikrát 30 ml vroucí vody, vždy do úplného odsátí po každém promytí.

Vypouštěcí ventil se uzavře, přidá se 150 ml vroucího roztoku hydroxidu draselného (bod 3.7) do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku a přidá se několik kapek odpěňovacího činidla (bod 3.2). Kapalina se přivede během 5 ± 2 minut do varu a intenzivně se vaří přesně 30 minut. Přefiltruje se a zopakuje se promývání jako u kyseliny sírové.

Po skončení promývání a odsávání se filtrační kelímek se svým obsahem odpojí a připojí se ke studené extrakční jednotce (bod 4.6). Za použití vakua se zbytek promyje ve filtračním kelímku třikrát 25 ml acetonu (bod 3.4), vždy do úplného odsátí po každém promytí.

Filtrační kelímek se vysuší do konstantní hmotnosti v sušárně při teplotě 130 °C. Po každém vysušení a ochlazení v exsikátoru se vždy rychle zváží. Filtrační kelímek se vloží do muflové pece a spaluje při 475–500 °C nejméně 30 minut do konstantní hmotnosti (úbytek hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími nesmí být větší než 2 mg).

Po každém spalování a ochlazení nejprve v peci a potom v exsikátoru se zváží.

Provede se slepá zkouška bez zkoušeného vzorku. Úbytek hmotnosti po spalování nesmí být větší než 4 mg.

Obsah hrubé vlákniny jako procento vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

• 0,6 % v absolutní hodnotě u obsahu hrubé vlákniny nižšího než 10 %,

• 6 % relat. z hodnoty vyššího výsledku u obsahu hrubé vlákniny 10 % a více.

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v různých laboratořích nesmí překročit:

• 1,0 % v absolutní hodnotě u obsahu hrubé vlákniny nižšího než 10 %,

• 10 % relat. z hodnoty vyššího výsledku u obsahu hrubé vlákniny 10 % a více.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu redukujících cukrů a celkového obsahu cukrů po inverzi vyjádřených jako glukóza nebo v příslušném případě sacharóza s použitím faktoru 0,95. Je použitelná pro krmné směsi. Pro ostatní krmiva jsou používány zvláštní metody. Je-li to nutné, může být obsah laktózy měřen zvlášť a potom zahrnut do celkového výsledku.

Tato metoda se použije pro stanovení obsahu cukrů pro výpočet energetické hodnoty krmiva.

Má-li být obsah cukrů stanoven pro jiné účely, lze použít jiné metody analýzy.

Cukry se vyextrahují zředěným ethanolem. Roztok se vyčeří Carrezovými činidly I a II. Ethanol se odstraní a množství cukrů před inverzí a po inverzi se stanoví Luff-Schoorlovou metodou.

Za opatrného míchání se nalije roztok kyseliny citronové (bod 3.8.2) do roztoku uhličitanu sodného (bod 3.8.3). Přidá se roztok síranu měďnatého (bod 3.8.1) a doplní se vodou na 1 litr. Nechá se přes noc usadit a pak se přefiltruje.

Zkontroluje se koncentrace takto získaného činidla (Cu – 0,05 mol/l; Na₂CO₃ – 1 mol/l), viz poslední odstavec bodu 5.4. pH tohoto roztoku musí být přibližně 9,4.

Míchací zařízení: přibližně 35 až 40 ot/min.

Do 250 ml odměrné baňky se naváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 200 ml ethanolu (bod 3.1) a míchá se po dobu jedné hodiny na míchacím zařízení. Přidá se 5 ml Carrezova činidla I (bod 3.2) a míchá se přibližně 30 sekund. Přidá se 5 ml Carrezova činidla II (bod 3.3) a znovu se míchá jednu minutu. Doplní se po značku ethanolem (bod 3.1), homogenizuje a přefiltruje. Odpipetuje se 200 ml filtrátu a odpaří se na přibližně polovinu objemu, aby se odstranila většina ethanolu. Zbytek po odpařování se kvantitativně převede do 200 ml odměrné baňky pomocí teplé vody, zchladí se, doplní se vodou po značku, homogenizuje a v případě potřeby přefiltruje. Tento roztok se použije pro stanovení obsahu redukujících cukrů a po inverzi pro stanovení celkového obsahu cukrů.

Odpipetuje se maximálně 25 ml roztoku, který obsahuje méně než 60 mg redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza. V případě potřeby se odpipetovaný objem doplní destilovanou vodou na 25 ml. Obsah redukujících cukrů se stanoví Luff-Schoorlovou metodou. Výsledek se vyjádří jako procentní obsah glukózy ve vzorku.

Do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 50 ml roztoku. Přidá se několik kapek roztoku methyloranže (bod 3.4) a potom se za stálého, opatrného míchání přidá kyselina chlorovodíková (bod 3.5), až se kapalina trvale zbarví do červena. Poté se přidá 15 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.6) a baňka se ponoří do silně vroucí vodní lázně, kde se ponechá 30 minut. Rychle se vychladí na přibližně 20 °C a přidá se 15 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.7). Doplní se vodou do 100 ml a homogenizuje. Odpipetuje se maximálně 25 ml roztoku, který obsahuje méně než 60 mg redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza. V případě potřeby se odpipetovaný objem doplní destilovanou vodou na 25 ml a obsah redukujících cukrů se stanoví Luff-Schoorlovou metodou. Výsledek se vyjádří jako procento glukózy nebo, v příslušném případě, sacharózy po vynásobení faktorem 0,95.

Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje 25 ml Luff-Schoorlova činidla (bod 3.8); přidá se přesně 25 ml vyčeřeného cukerného roztoku. Přidají se dvě granule pemzy (bod 3.13) a při ručním míchání se zahřívá nad otevřeným plamenem střední délky tak, aby se kapalina přivedla přibližně během dvou minut do varu. Pak se Erlenmeyerova baňka neprodleně umístí na azbestem potaženou drátěnou síťku s otvorem o průměru přibližně 6 cm, pod kterou byl zapálen plamen. Tento plamen musí být regulován tak, aby se zahřívalo pouze dno Erlenmeyerovy baňky. K Erlenmeyerově baňce se připojí zpětný chladič vaří se přesně deset minut. Potom se baňka ihned ochladí ve studené vodě a přibližně po pěti minutách se titruje takto:

Do baňky se přidá 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.12) a ihned poté (opatrně, vzhledem k riziku nadměrného pěnění) se přidá 25 ml kyseliny sírové (bod 3.11). Titruje se roztokem thiosíranu sodného (bod 3.9), až se objeví kalně žlutá barva. Pak se přidá škrobový indikátor (bod 3.10) a titrace se dokončí.

Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla (bod 3.8) a 25 ml vody, po přidání 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.12) a 25 ml kyseliny sírové (bod 3.11) bez vaření.

S použitím tabulky se stanoví obsah glukózy v mg, který odpovídá rozdílu mezi hodnotami obou titrací vyjádřených v ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l. Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Homogenizuje se a přefiltruje. Ethanol se odstraní postupem uvedeným v bodě 5.1. Pokud ve směsi není žádný dextrinovaný škrob, doplní se po značku destilovanou vodou.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu laktózy v krmivech obsahujících více než 0,5 % laktózy.

Cukry se rozpustí ve vodě. Roztok se vystaví fermentačnímu účinku kvasinek Saccharomyces cerevisiae, které ponechají laktózu v nezměněném stavu. Po vyčeření a filtraci se obsah laktózy ve filtrátu stanoví Luff-Schoorlovou metodou.

Za opatrného míchání se nalije roztok kyseliny citronové (bod 3.4.2) do roztoku uhličitanu sodného (bod 3.4.3). Přidá se roztok síranu měďnatého (bod 3.4.1) a doplní se vodou na 1 litr. Nechá se přes noc usadit a pak se přefiltruje. Zkontroluje se koncentrace takto získaného činidla (Cu – 0,05 mol/l; Na₂CO₃ 1 mol/l). pH tohoto roztoku musí být přibližně 9,4.

Vodní lázeň s termostatem nastaveným na 38–40 °C.

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 25–30 ml vody. Baňka se umístí do vroucí vodní lázně na 30 minut a potom se ochladí na teplotu přibližně 35 °C. Přidá se 5 ml suspenze kvasinek (bod 3.1) a homogenizuje. Obsah baňky se nechá stát po dobu dvou hodin ve vodní lázni o teplotě 38–40 °C a potom se ochladí na teplotu přibližně 20 °C.

Přidá se 2,5 ml Carrezova činidla I (bod 3.2) a 30 sekund se míchá. Potom se přidá 2,5 ml Carrezova činidla II (bod 3.3) a znovu se míchá 30 sekund. Doplní se vodou na 100 ml, zamíchá se a přefiltruje. Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje část filtrátu, nejvýše 25 ml, která obsahuje pokud možno 40–80 mg laktózy. Pokud je třeba, doplní se vodou na 25 ml.

Stejným způsobem se provede slepá zkouška s 5 ml suspenze kvasinek (bod 3.1). Stanoví se obsah laktózy Luff-Schoorlovou metodou tímto způsobem: přidá se přesně 25 ml Luff-Schoorlova činidla (bod 3.4) a dvě granule pemzy (bod 3.5). Při ručním míchání se zahřívá nad otevřeným plamenem střední délky tak, aby se kapalina přivedla přibližně během dvou minut do varu. Pak se Erlenmeyerova baňka neprodleně umístí na azbestem potaženou drátěnou síťku s otvorem o průměru přibližně 6 cm, pod kterou byl zapálen plamen. Tento plamen musí být regulován tak, aby se zahřívalo pouze dno Erlenmeyerovy baňky. K Erlenmeyerově baňce se připojí zpětný chladič. Vaří se přesně deset minut. Potom se baňka ihned ochladí ve studené vodě a přibližně po pěti minutách se titruje takto:

Přidá se 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.6) a ihned poté (opatrně, vzhledem k riziku nadměrného pěnění) se přidá 25 ml kyseliny sírové (bod 3.7). Titruje se roztokem thiosíranu sodného (bod 3.8), až se objeví kalně žlutá barva. Pak se přidá škrobový indikátor (bod 3.9) a titrace se dokončí.

Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla (bod 3.4) a 25 ml vody, po přidání 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.6) a 25 ml kyseliny sírové (bod 3.7) bez vaření.

S použitím tabulky uvedené níže se stanoví obsah laktózy v mg, který odpovídá rozdílu mezi výsledky dvou titrací, vyjádřených v ml roztoku thiosíranu sodného 0,1 mol/l.

Výsledek se vyjádří jako bezvodá laktóza vyjádřená jako procento vzorku.

Tabulka hodnot pro 25 ml Luff-Schoorlova činidla ml roztoku thiosíranu sodného (Na₂S₂O₃) 0,1 mol/l, dvě minuty zahřívání k varu a deset minut varu

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu škrobu a degradačních produktů škrobu s vysokou molekulární hmotností v krmivech za účelem kontroly shody s deklarovanou energetickou hodnotou (ustanovení v příloze VII) a s nařízením (ES) č. 767/2009.

Tato metoda se použije pro stanovení obsahu škrobu pro výpočet energetické hodnoty krmiva.

Má-li být obsah škrobu stanoven pro jiné účely, lze použít jiné metody analýzy.

Metoda zahrnuje dvě stanovení. V prvním stanovení je vzorek podroben působení zředěné kyseliny chlorovodíkové. Po vyčeření a filtraci je polarimetricky měřena optická otáčivost roztoku.

V druhém stanovení je vzorek extrahován 40 % ethanolem. Po okyselení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčeření a filtraci je optická otáčivost roztoku měřena stejně jako u prvního stanovení.

Rozdíl mezi těmito dvěma měřeními násobený známým faktorem udává obsah škrobu ve vzorku.

Koncentrace se musí zkontrolovat titrací za použití roztoku hydroxidu sodného 0,1 mol/l a přítomnosti 0,1 % (w/v) methylčerveně v 94 % (v/v) ethanolu. Pro neutralizaci 10 ml je zapotřebí 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s kulatými oky o velikosti 0,5 mm.

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 2,5 g umletého vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 25 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.2), protřepe se, aby se zkušební vzorek rovnoměrně rozprostřel, a potom se přidá dalších 25 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.2). Baňka se ponoří do vroucí vodní lázně a první tři minuty se s ní intenzivně třepe, aby nedošlo k tvorbě shluků. Množství vody ve vodní lázni musí být takové, aby při ponoření baňky do lázně nedošlo k přerušení varu. Během protřepávání nesmí být baňka vyjmuta z lázně. Přesně po 15 minutách se baňka vyjme z lázně, přidá se 30 ml studené vody a ihned se ochladí na 20 °C.

Přidá se 5 ml Carrezova činidla I (bod 3.3) a přibližně 30 sekund se protřepává. Přidá se 5 ml Carrezova činidla II (bod 3.4) a opět se protřepává přibližně 30 sekund. Baňka se doplní po značku vodou, promíchá a přefiltruje. Pokud není filtrát zcela čirý (k tomu dochází pouze výjimečně), stanovení se zopakuje s použitím většího množství Carrezových činidel I a II, například 10 ml.

Optická otáčivost roztoku se měří na polarimetru nebo sacharimetru v 200 mm trubici.

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg a přidá se asi 80 ml ethanolu (bod 3.5) (viz poznámka v bodě 7.2). Baňka se nechá stát 1 hodinu při laboratorní teplotě; během této doby se šestkrát důkladně protřepe, aby se zkušební vzorek zcela promísil s ethanolem. Doplní se ethanolem (bod 3.5) po značku, promíchá a přefiltruje.

Odpipetuje se 50 ml filtrátu (= 2,5 g vzorku) do 250 ml Erlenmeyerovy baňky, přidá se 2,1 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) a důkladně se protřepe. K Erlenmeyerově baňce se připojí zpětný chladič a baňka se ponoří do vroucí vodní lázně. Přesně po 15 minutách se Erlenmeyerova baňka vyjme z lázně, její obsah se převede do 100 ml odměrné baňky, varná baňka se vypláchne malým množstvím studené vody a ochladí se na 20 °C.

Potom se vyčeří Carrezovými činidly I a II (bod 3.3 a 3.4), doplní se vodou po značku, promíchá a přefiltruje. Při měření optické otáčivosti se postupuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5.2.

Obsah škrobu (v %) se vypočte podle těchto vzorců:

hmotnost sacharózy v g ve 100 ml vody, která poskytne ve 200 mm trubici optickou otáčivost rovnou 100^o sacharizace

• 16,29 g pro francouzské sacharimetry

• 26,00 g pro německé sacharimetry

• 20,00 g pro směsné sacharimetry

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 0,4 v absolutní hodnotě u obsahu škrobu nižšího než 40 % a 1 % relat. u obsahu škrobu 40 % a více.

• produkty z (cukrové) řepy jako (cukrová) řepná pulpa, (cukrová) řepná melasa, směs (cukrové) řepné pulpy a melasy, (cukrová) řepná vináza, (řepný) cukr,

• citrusová pulpa,

• lněné semeno, lněné expelery, extrahované lněné semeno,

• řepkové semeno, řepkové expelery, extrahované řepkové semeno, řepkové slupky,

• slunečnicové semeno, extrahované slunečnicové semeno, slunečnicové semeno částečně loupané, extrahované,

• expelery z kopry, extrahovaná kopra,

• bramborová pulpa,

• sušené kvasnice,

• produkty bohaté na inulin (např. chipsy a moučka z topinamburů),

• škvarky,

• produkty ze sójových bobů.

  V těchto případech lze použít metodu analýzy stanovenou v nařízení Komise (ES) č. 121/2008(Nařízení Komise (ES) č. 121/2008 ze dne 11. února 2008, kterým se stanoví metoda analýzy pro stanovení obsahu škrobu v přípravcích používaných k výživě zvířat (kód KN 2309) (Úř. věst. L 37, 12.2.2008, s. 3).). Tuto metodu lze použít i pro krmiva obsahující méně než 1 % škrobu.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu hrubého popela v krmivech.

Vzorek se zpopelní při 550 °C; zbytek se zváží.

Dusičnan amonný, roztok 20 % (w/v).

Do spalovacího kelímku, který byl předem zahřát na teplotu 550 °C, ochlazen a zvážen, se s přesností na 1 mg naváží přibližně 5 g vzorku (2,5 g v případě produktů, které mají během spalování tendenci zvětšovat svůj objem). Potom se kelímek položí na topnou desku a postupně se zahřívá, až látka zuhelnatí. Spaluje se podle bodu 5.1 nebo 5.2.

Vypočte se hmotnost zbytku po odečtení hmotnosti kelímku (táry).

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu minerálních látek nerozpustných v kyselině chlorovodíkové v krmivech. Podle druhu vzorku mohou být použity dvě různé metody.

Vzorek se zpopelní podle postupu uvedeného v metodě pro stanovení obsahu hrubého popela. Může se použít rovněž popel získaný při uvedeném stanovení.

Popel se pomocí 75 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) převede do 250–400 ml kádinky. Uvede se pomalu do varu a mírně se vaří patnáct minut. Teplý roztok se přefiltruje přes bezpopelný papírový filtr a zbytek na filtru se promyje teplou vodou do vymizení kyselé reakce. Filtr s promytým zbytkem se vysuší a potom zpopelní v předem zváženém kelímku při teplotě minimálně 550 °C a maximálně 700 °C. Nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se.

Do 250–400 ml kádinky se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se postupně 25 ml vody a 25 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1), promíchá se a nechá se stát, dokud neustane pěnění. Přidá se dalších 50 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1). Po ukončení vývoje plynu se kádinka umístí na vroucí vodní lázeň, kde se ponechá 30 minut nebo v případě potřeby déle, aby mohlo dojít k hydrolýze veškerého přítomného škrobu. Přefiltruje se za horka přes bezpopelný papírový filtr a filtr se promyje 50 ml teplé vody (viz poznámka 7). Filtr se zbytkem se vloží do spalovacího kelímku, vysuší se a potom zpopelní při teplotě minimálně 550 °C a maximálně 700 °C. Po spálení se popel převede pomocí 75 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) do 250–400 ml kádinky; pokračuje se podle druhého odstavce bodu 5.1.

Vypočte se hmotnost zbytku po odečtení hmotnosti kelímku (táry). Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Jestliže je filtrace obtížná, je možné nahradit 50 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) 50 ml 20 % (w/v) roztoku kyseliny trichloroctové (bod 3.2) a zbytek na filtru promývat teplým 1 % roztokem kyseliny trichloroctové (bod 3.3).

Celkový fosfor se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 15510 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení vápníku, sodíku, fosforu, hořčíku, draslíku, železa, zinku, mědi, manganu, kobaltu, molybdenu a olova metodou ICP-AES nebo

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 15621 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení vápníku, sodíku, fosforu, hořčíku, draslíku, síry, železa, zinku, mědi, manganu a kobaltu po tlakovém rozkladu metodou ICP-AES nebo

• fotometrickou metodou, jak je popsána níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového fosforu v krmivech. Je vhodná především pro analýzu produktů s nízkým obsahem fosforu. V určitých případech (u produktů s vysokým obsahem fosforu) je možné použít gravimetrickou metodu.

Vzorek se mineralizuje buď suchou cestou (v případě organických krmiv), nebo mokrou cestou (v případě minerálních směsí a tekutých krmiv) a převede se do kyselého roztoku. K tomuto roztoku se přidá molybdátovanadátové činidlo. Optická hustota žlutě zbarveného roztoku se měří při 430 nm pomocí spektrofotometru.

Podle druhu vzorku se připraví roztok způsobem, který je uveden v bodě 5.1.1 nebo 5.1.2.

Do Kjeldahlovy baňky se naváží 1 g nebo větší množství vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 20 ml kyseliny sírové (bod 3.5), baňka se důkladně protřepe, aby se vzorek a kyselina dobře spojily a aby se zabránilo usazování vzorku na stěnách baňky; pak se roztok zahřeje a 10 minut se vaří na bodu varu. Po mírném ochlazení se přidají 2 ml kyseliny dusičné (bod 3.4); slabě se zahřeje a opět mírně ochladí. Pak se opět přidá trochu kyseliny dusičné (bod 3.4) a uvede se opět do varu. Postup se opakuje tolikrát, až se získá čirý roztok. Potom se ochladí, přidá se trochu vody, kapalina se převede do 500 ml odměrné baňky a Kjeldahlova baňka se vypláchne horkou vodou. Po ochlazení se doplní vodou po značku, homogenizuje a přefiltruje.

Do spalovacího kelímku se naváží přibližně 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg a dokonale se promíchá s 1 g uhličitanu vápenatého (bod 3.1). V muflové peci se spaluje při teplotě 550 °C tak dlouho, dokud se nezíská popel bílé nebo šedé barvy (malé množství uhlíkatých částic není na závadu). Popel se převede do 250 ml kádinky, přidá se 20 ml vody a potom se přidává kyselina chlorovodíková (bod 3.2), dokud neustane pěnění. Přidá se dalších 10 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.2). Kádinka se postaví na pískovou lázeň a odpaří se do sucha, aby se vyloučily křemičitany. Zbytek se rozpustí v 10 ml kyseliny dusičné (bod 3.3) a 5 minut vaří na pískové lázni nebo na topné desce tak, aby nedošlo k úplnému vysušení. Kapalina se převede do 500 ml odměrné baňky a kádinka se několikrát vymyje horkou vodou. Po ochlazení se doplní vodou po značku, homogenizuje a přefiltruje.

Alikvotní množství filtrátu připraveného podle bodu 5.1.1 nebo 5.1.2 se zředí tak, aby koncentrace fosforu byla maximálně 40 μg/ml. 10 ml tohoto roztoku se odpipetuje do zkumavky (bod 4.6) a přidá se 10 ml molybdátovanadátového činidla (bod 3.6). Homogenizuje se a nechá se stát minimálně po dobu 10 minut při teplotě 20 °C. Pak se měří optická hustota ve spektrofotometru při 430 nm proti roztoku připravenému z 10 ml vody a 10 ml molybdátovanadátového činidla (bod 3.6).

Ze standardního roztoku (bod 3.7) se připraví roztoky, které obsahují 5, 10, 20, 30 a 40 μg fosforu na jeden ml. Ke každým 10 ml těchto roztoků se přidá 10 ml molybdátovanadátového činidla (bod 3.6). Homogenizuje se a nechá se stát minimálně po dobu 10 minut při teplotě 20 °C. Pak se měří optická hustota, jak je uvedeno v bodě 5.2. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením hodnot optické hustoty proti odpovídajícím množstvím fosforu. Křivka je lineární při koncentraci fosforu 0–40 μg/ml.

Obsah fosforu ve zkušebním vzorku se stanoví pomocí kalibrační křivky.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

• 3 % relat. z hodnoty vyššího výsledku u obsahu fosforu méně než 5 %,

• 0,15 % v absolutní hodnotě u obsahu fosforu 5 % či více.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu ve vodě rozpustných chloridů obvykle vyjadřovaných jako chlorid sodný. Je vhodná pro všechna krmiva.

Chloridy se rozpustí ve vodě. Jestliže produkt obsahuje organickou hmotu, roztok se vyčeří. Roztok se mírně okyselí kyselinou dusičnou a chloridy se vysrážejí pomocí roztoku dusičnanu stříbrného jako chlorid stříbrný. Přebytek dusičnanu stříbrného se titruje roztokem thiokyanatanu amonného podle Volhardovy metody.

Míchací zařízení: přibližně 35 až 40 ot/min.

Příprava vzorku závisí na druhu vzorku a roztok se připraví podle bodu 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3.

Současně se provede slepá zkouška bez zkoušeného vzorku.

Do 500 ml odměrné baňky se naváží maximálně 10 g vzorku s přesností na 1 mg tak, aby navážka obsahovala nejvýše 3 g ve vodě rozpustných chloridů, přidá se 400 ml vody o teplotě přibližně 20 °C a míchá se 30 minut na míchacím zařízení. Potom se doplní po značku, homogenizuje a přefiltruje.

Do 500 ml odměrné baňky se naváží přibližně 5 g vzorku s přesností na 1 mg a 1 g aktivního uhlí. Přidá se 400 ml vody o teplotě přibližně 20 °C a 5 ml Carrezova činidla I (bod 3.7), asi 30 sekund se míchá, pak se přidá 5 ml Carrezova činidla II (bod 3.8). Míchá se 30 minut na míchacím zařízení, potom se doplní po značku, homogenizuje a přefiltruje.

Roztok se připraví podle bodu 5.1.2, ale nefiltruje se. Dekantuje se (v případě potřeby odstředí). Do 200 ml odměrné baňky se odpipetuje 100 ml supernatantu, smíchá se s acetonem (bod 3.6) a doplní se tímto rozpouštědlem po značku, homogenizuje se a přefiltruje.

Do Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje 25–100 ml filtrátu (podle předpokládaného obsahu chloru) získaného podle bodu 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3. Alikvotní část nesmí obsahovat více než 150 mg chloru (Cl). V případě potřeby se doplní vodou na minimálně 50 ml, přidá se 5 ml kyseliny dusičné (bod 3.4), 2 ml nasyceného roztoku síranu železitoamonného (bod 3.3) a dvě kapky roztoku thiokyanatanu amonného (bod 3.1) z byrety naplněné ke značce nula. Jinou byretou se přidá roztok dusičnanu stříbrného (bod 3.2) tak, aby se získal přebytek 5 ml. Dále se přidá 5 ml diethyletheru (bod 3.5) a silně se protřepe, aby sraženina dobře koagulovala. Přebytek dusičnanu stříbrného se titruje s roztokem thiokyanatanu amonného (bod 3.1), dokud není dosaženo červenohnědého zabarvení, které vydrží jednu minutu.

Obsah ve vodě rozpustných chloridů (X) vyjádřených jako procento chloridu sodného se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Jestliže byl při slepé zkoušce roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l spotřebován, odečte se tato hodnota z objemu (V₁ – V₂).

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu uhličitanů vyjádřených obvykle jako uhličitan vápenatý v krmivech s výjimkou krmiv, v nichž je přítomen uhličitan železnatý.

Uhličitany se rozloží v kyselině chlorovodíkové; vzniklý oxid uhličitý se změří v kalibrované trubici a jeho objem se porovná s objemem plynu uvolněného za stejných podmínek ze známého množství uhličitanu vápenatého.

Scheibler-Dietrichův přístroj (viz obrázek v dodatku) nebo obdobný přístroj (kalcimetr).

Podle obsahu uhličitanů ve vzorku se naváží:

• a) 0,5 g u produktů obsahujících 50–100 % uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý;
• b) 1 g u produktů obsahujících 40–50 % uhličitanů vyjádřených jako uhličitan vápenatý;
• c) 2 až 3 g u ostatních produktů.

Aby se rozložily veškeré přítomné uhličitany, přidá se k navážce vzorku kyselina chlorovodíková (bod 3.1 výše). K měření objemu oxidu uhličitého se použije Scheibler-Dietrichův přístroj nebo obdobný přístroj (kalcimetr) a zjištěná hodnota se porovná s objemem oxidu uhličitého uvolněného z 0,5 g čistého uhličitanu vápenatého (bod 3.2 výše).

Stanovení obsahu se vždy provádí za stejných podmínek, aby nebyly zapotřebí úpravy kvůli rozdílům v teplotě a tlaku. Stanovení obsahu by se měly pokud možno provádět v prostorách s řízenou teplotou.

Postup s použitím Scheibler-Dietrichova přístroje je podrobně popsán v dodatku.

Obsah uhličitanů vyjádřených jako čistý uhličitan vápenatý se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

Navážka vzorku se umístí do zvláštní nádobky (číslo 4 na obrázku) přístroje, vybavené malou trubicí z nerozbitného materiálu, která obsahuje 10 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1 výše), a nádobka se připojí k přístroji. Trojcestný kohout (číslo 5 na obrázku) se otočí tak, aby kalibrovaná trubice (číslo 1 na obrázku) byla spojena s vnějším prostorem. Pomocí mobilní trubice (číslo 2 na obrázku), která je naplněna obarvenou kyselinou sírovou (bod 3.3 výše) a spojena s kalibrovanou trubicí (číslo 1 na obrázku), se vyrovnají hladiny na nulu. Trojcestný kohout (číslo 5 na obrázku) se otočí tak, aby byly spojeny trubice (číslo 1 a 3 na obrázku), a zkontroluje se, zda je hladina na nule.

Pomalým nakláněním zvláštní nádobky (číslo 4 na obrázku) se kyselina chlorovodíková (bod 3.1 výše) nalije na navážku vzorku. Tlak se vyrovná snížením mobilní trubice (číslo 2 na obrázku). Zvláštní nádobk (číslo 4 na obrázku) se protřepává tak dlouho, dokud zcela neustane uvolňování oxidu uhličitého.

Tlak se obnoví vyrovnáním kapalin v trubicích (číslo 1 a 2 na obrázku) na stejnou hladinu. Po několika minutách, až se ustálí tlak plynu, se odečte jeho hodnota.

Provede se kontrolní zkouška za stejných podmínek s navážkou 0,5 g uhličitanu vápenatého (bod 3.2 výše).

(měřeno v mm)

PŘÍLOHA IV METODY ANALÝZY PRO KONTROLU OBSAHU POVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK V KRMIVECH

A) STANOVENÍ OBSAHU VITAMINU A

Obsah vitaminu A se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17547 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení obsahu vitaminu A, E a D(Metoda analýzy stanovená v normě EN 17547 se označuje jako alternativní metoda, která se má použít pro účely úřední kontroly pro stanovení obsahu vitaminu A a E namísto metody popsané pro stanovení obsahu vitaminu A v části A této přílohy a pro stanovení obsahu vitaminu E v části B této přílohy.) – Metoda využívající extrakci a přečištění na pevné fázi (SPE) a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) nebo

• vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí, jak je popsáno v bodech 1 až 9 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vitaminu A (retinolu) v krmivech. Vitamin A zahrnuje all-trans-retinyl-alkohol a jeho cis-izomery, které se stanoví touto metodou. Obsah vitaminu A se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) na kilogram. Jedna IU odpovídá aktivitě 0,300 μg all-trans-vitamin-A-alkoholu nebo 0,344 μg all-trans-vitamin-A-acetátu nebo 0,550 μg all-trans-vitamin-A-palmitátu.

Mez stanovitelnosti je 2000 IU vitaminu A/kg.

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin A se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a, pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu A se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí. Chromatografické parametry jsou vybrány tak, aby nedocházelo k separaci all-trans-vitamin-A-alkoholu a jeho cis-izomerů.

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s oky o velikosti 1 mm a aby během přípravy nedošlo k jeho zahřátí. Mletí musí být provedeno bezprostředně před vážením a saponifikací, jinak může dojít ke ztrátám vitaminu A. Pokud je rozdělení velikosti částic přiměřené (např. premixy a doplňkové látky), vzorek (vzorky) se nemele (nemelou).

Podle obsahu vitaminu A ve vzorku se s přesností na 1 mg naváží 2–25 g vzorku do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (bod 4.2.1). V případě nízkých koncentrací lze hmotnost vzorku zvýšit, aby byl v navážce vzorku dostatek částic. Za intenzivního míchání se přidá 130 ml ethanolu (bod 3.1), přibližně 100 mg BHT (bod 3.13), 2 ml roztoku askorbátu sodného (bod 3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného bod (bod 3.6). Baňka se připojí k chladiči (bod 4.3) a ponoří se do vodní lázně s magnetickou míchačkou (bod 4.7). Zahřeje se k varu a vaří se pod refluxem 5 minut. Potom se přes chladič (bod 4.3) přidá 25 ml roztoku hydroxidu draselného (bod 3.4) a vaří se pod refluxem za míchání pod pomalým proudem dusíku dalších 25 minut. Potom se chladič opláchne přibližně 20 ml vody a obsah baňky se nechá vychladnout na laboratorní teplotu.

Saponifikovaný roztok se dekantací a propláchnutím celkem 250 ml vody převede kvantitativně do 1000 ml dělicí nálevky (bod 4.2.3) nebo do extrakčního zařízení (bod 4.8). Saponifikační baňka se postupně opláchne 25 ml ethanolu (bod 3.1) a 100 ml petroletheru (bod 3.2) a oba oplachy se převedou do dělicí nálevky nebo do extrakčního zařízení. Konečný poměr vody a ethanolu v kombinovaných roztocích musí být asi 2:1. Roztok se dvě minuty intenzivně třepe a potom se nechá dvě minuty stát.

Po separaci vrstev (viz poznámka v bodě 7.3) se petroletherová vrstva převede do další dělicí nálevky (bod 4.2.3). Extrakce se opakuje dvakrát se 100 ml petroletheru (bod 3.2) a dvakrát s 50 ml petroletheru (bod 3.2).

Spojené extrakty v dělicí nálevce se dvakrát promyjí mírným kroužením (aby nevznikala emulze) 100 ml vody a potom se opakovaně protřepávají se 100 ml vody, dokud voda nezůstane po přidání roztoku fenolftaleinu (bod 3.7) bezbarvá (obvykle stačí čtyři promytí). Promytý extrakt se přefiltruje do 500 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) přes suchý skládaný filtr pro separaci fází (bod 4.4), aby se odstranila suspendovaná voda. Dělicí nálevka a filtr se opláchne 50 ml petroletheru (bod 3.2). Baňka se petroletherem (bod 3.2) doplní po značku a důkladně promíchá.

Po separaci vrstev (viz poznámka 7.3) se ze skleněného válce (bod 4.8.1) odstraní zátka a místo ní se vloží vkladatelné zařízení se skleněným zábrusem (bod 4.8.2). Spodní strana nastavitelné U-trubičky se umístí tak, aby byla právě nad rozhraním. Za použití tlaku dusíku (přiváděného postranním raménkem) se převede horní petroletherová vrstva do 1000 ml dělicí nálevky (bod 4.2.3). Přidá se 100 ml petroletheru (bod 3.2), skleněný válec se zazátkuje a důkladně protřepe. Po separaci vrstev se horní vrstva opět převede stejným způsobem do dělicí nálevky. Extrakce se opakuje s dalšími 100 ml petroletheru (bod 3.2) a pak ještě dvakrát s 50 ml petroletheru (bod 3.2). Horní petroletherová vrstva se vždy přidá k předchozí do dělicí nálevky.

Spojené extrakty petroletheru v dělicí nálevce se promyjí, jak je popsáno v bodě 5.3.1, a postupuje se dále podle popisu v uvedeném bodě.

Alikvotní část roztoku petroletheru (podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2) se odpipetuje do 250 ml hruškovité baňky (bod 4.2.4). Rozpouštědlo se na rotační odparce (bod 4.1) odpaří za sníženého tlaku při teplotě vodní lázně nepřekračující 40 °C téměř do sucha. Atmosférický tlak se obnoví zavedením dusíku (bod 3.10) do baňky a ta se odpojí od rotační odparky. Zbytek rozpouštědla se odpaří pod proudem dusíku (bod 3.10) a odparek se ihned rozpustí ve známém objemu (10–100 ml) methanolu (bod 3.3) (výsledná koncentrace vitaminu A musí být v rozsahu 5–30 IU/ml).

Vitamin A se separuje na koloně C₁₈ s reverzní fází (bod 4.5.1) a jeho koncentrace se měří UV detektorem (325 nm) nebo fluorescenčním detektorem (excitace: 325 nm, emise: 475 nm) (bod 4.5.2).

Do přístroje se nastřikuje alikvotní část (např. 20 μl) methanolického roztoku získaného podle bodu 5.4 a eluuje se mobilní fází (bod 3.9). Průměrná hodnota výšek (ploch) píků se vypočte z několika opakovaných nástřiků téhož roztoku vzorku nebo kalibračních roztoků (bod 5.6.2).

Podmínky HPLC

Následující podmínky jsou doporučené; lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky.

Do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (bod 4.2.1) se odpipetuje 20 ml zásobního roztoku vitamin-A-acetátu (bod 3.11.1) nebo 20 ml zásobního roztoku vitamin-A-palmitátu (bod 3.12.1) a hydrolyzuje se podle bodu 5.2, ale bez přidání BHT. Potom se provede extrakce petroletherem (bod 3.2) podle bodu 5.3 a doplní se na 500 ml petroletherem (bod 3.2). 100 ml tohoto extraktu se odpaří na rotační odparce téměř do sucha (viz 5.4), zbylé rozpouštědlo se odpaří pod proudem dusíku (bod 3.10) a odparek se rozpustí v 10,0 ml methanolu (bod 3.3). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 560 IU/ml. Přesný obsah se stanoví podle bodu 5.6.3.3. Pracovní standardní roztok se připravuje před použitím čerstvý.

Do 20 ml odměrné baňky se odpipetují 2,0 ml tohoto pracovního standardního roztoku, baňka se doplní po značku methanolem (bod 3.3) a promíchá. Nominální koncentrace vitaminu A v tomto zředěném pracovním standardním roztoku je 56 IU/ml.

Do sady 20 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/5,0 a 10,0 ml zředěného pracovního standardního roztoku, doplní se methanolem (bod 3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace vitaminu A v těchto roztocích jsou 2,8/5,6/14,0 a 28,0 IU/ml.

Provede se opakovaný nástřik 20 μl každého kalibračního roztoku a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka, přičemž se použijí výsledky UV kontroly (bod 5.6.3.3).

Do 50 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vitamin-A-acetátu (bod 3.11.1) a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 56 IU/ml. Do 25 ml odměrné baňky se odpipetují 3,0 ml tohoto zředěného roztoku vitamin-A-acetátu a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 6,72 IU/ml. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (bod 3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

Do 50 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vitamin-A-palmitátu (bod 3.12.1) a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 56 IU/ml. Do 25 ml odměrné baňky se odpipetují 3,0 ml tohoto zředěného roztoku vitamin-A-palmitátu a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 6,72 IU/ml. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (bod 3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

Do 50 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) se odpipetují 3,0 ml nezředěného pracovního standardního roztoku vitaminu A připraveného podle bodu 5.6.1 a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Do 25 ml odměrné baňky se odpipetuje 5,0 ml tohoto roztoku a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 6,72 IU/ml. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (bod 3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

Koncentrace vitaminu A v roztoku vzorku v IU/ml se stanoví porovnáním s kalibrační křivkou (bod 5.6.2) podle průměrných hodnot výšek (ploch) píků.

Obsah vitaminu A (w) v IU/kg vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

Obsah vitaminu E se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17547 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení obsahu vitaminu A, E a D(Metoda analýzy stanovená v normě EN 17547 se označuje jako alternativní metoda, která se má použít pro účely úřední kontroly pro stanovení obsahu vitaminu A a E namísto metody popsané pro stanovení obsahu vitaminu A v části A této přílohy a pro stanovení obsahu vitaminu E v části B této přílohy.) – Metoda využívající extrakci a přečištění na pevné fázi (SPE) a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) nebo

• vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí, jak je popsáno v bodech 1 až 9 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vitaminu E v krmivech. Obsah vitaminu E se vyjadřuje jako mg DL-α-tokoferol-acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol-acetátu odpovídá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamin E).

Mez stanovitelnosti je 2 mg vitaminu E/kg. Tato mez stanovitelnosti je dosažitelná pouze s fluorescenčním detektorem. Při použití UV detektoru je mez stanovitelnosti 10 mg/kg.

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin E se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a, pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu E se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) s fluorescenční nebo UV detekcí.

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s oky o velikosti 1 mm a aby během přípravy nedošlo k jeho zahřátí. Mletí musí být provedeno bezprostředně před vážením a saponifikací, jinak může dojít ke ztrátám vitaminu E.

Podle obsahu vitaminu E ve vzorku se s přesností na 0,01 g naváží 2–25 g vzorku do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (bod 4.2.1). Za intenzivního míchání se přidá 130 ml ethanolu (bod 3.1), přibližně 100 mg BHT (bod 3.12), 2 ml roztoku askorbátu sodného bod (bod 3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (bod 3.6). Baňka se připojí k chladiči (bod 4.3) a ponoří se do vodní lázně s magnetickou míchačkou (bod 4.7). Zahřeje se k varu a vaří se pod refluxem 5 minut. Potom se přes chladič (bod 4.3) přidá 25 ml roztoku hydroxidu draselného (bod 3.4) a vaří se pod refluxem za míchání pod pomalým proudem dusíku dalších 25 minut. Potom se chladič opláchne přibližně 20 ml vody a obsah baňky se nechá vychladnout na laboratorní teplotu.

Saponifikovaný roztok se dekantací a propláchnutím celkem 250 ml vody převede kvantitativně do 1000 ml dělicí nálevky (bod 4.2.3) nebo do extrakčního zařízení (bod 4.8). Saponifikační baňka se postupně opláchne 25 ml ethanolu (bod 3.1) a 100 ml petroletheru (bod 3.2) a oba oplachy se převedou do dělicí nálevky nebo do extrakčního zařízení. Konečný poměr vody a ethanolu v kombinovaných roztocích musí být asi 2:1. Roztok se dvě minuty intenzivně třepe a potom se nechá dvě minuty stát.

Po separaci vrstev (viz poznámka v bodě 7.3) se petroletherová vrstva převede do další dělicí nálevky (bod 4.2.3). Extrakce se opakuje dvakrát se 100 ml petroletheru (bod 3.2) a dvakrát s 50 ml petroletheru (bod 3.2).

Spojené extrakty v dělicí nálevce se dvakrát promyjí mírným kroužením (aby nevznikala emulze) 100 ml vody a potom se opakovaně protřepávají se 100 ml vody, dokud voda nezůstane po přidání roztoku fenolftaleinu (bod 3.7) bezbarvá (obvykle stačí čtyři promytí). Promytý extrakt se přefiltruje do 500 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) přes suchý skládaný filtr pro separaci fází (bod 4.4), aby se odstranila suspendovaná voda. Dělicí nálevka a filtr se opláchne 50 ml petroletheru (bod 3.2). Baňka se petroletherem (bod 3.2) doplní po značku a důkladně promíchá.

Po separaci vrstev (viz poznámka v bodě 7.3) se ze skleněného válce (bod 4.8.1) odstraní zátka a místo ní se vloží vkladatelné zařízení se skleněným zábrusem (bod 4.8.2). Spodní strana nastavitelné U-trubičky se umístí tak, aby byla právě nad rozhraním. Za použití tlaku dusíku (přiváděného postranním raménkem) se převede horní petroletherová vrstva do 1000 ml dělicí nálevky (bod 4.2.3). Přidá se 100 ml petroletheru (bod 3.2), skleněný válec se zazátkuje a důkladně protřepe. Po separaci vrstev se horní vrstva opět převede stejným způsobem do dělicí nálevky. Extrakce se opakuje s dalšími 100 ml petroletheru (bod 3.2) a pak ještě dvakrát s 50 ml petroletheru (bod 3.2). Horní petroletherová vrstva se vždy přidá k předchozí do dělicí nálevky.

Spojené extrakty petroletheru v dělicí nálevce se promyjí, jak je popsáno v bodě 5.3.1, a postupuje se dále podle popisu v uvedeném bodě.

Alikvotní část roztoku petroletheru (podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2) se odpipetuje do 250 ml hruškovité baňky (bod 4.2.4). Rozpouštědlo se na rotační odparce (bod 4.1) odpaří za sníženého tlaku při teplotě vodní lázně nepřekračující 40 °C téměř do sucha. Atmosférický tlak se obnoví zavedením dusíku (bod 3.9) do baňky a ta se odpojí od rotační odparky. Zbytek rozpouštědla se odpaří pod proudem dusíku (bod 3.9) a odparek se ihned rozpustí ve známém objemu (10–100 ml) methanolu (bod 3.3) (koncentrace DL-α-tokoferolu musí být v rozmezí 5 μg/ml až 30 μg/ml).

Vitamin E se separuje na koloně C₁₈ s reverzní fází (bod 4.5.1) a jeho koncentrace se měří fluorescenčním detektorem (excitace: 295 nm, emise: 330 nm) nebo UV detektorem (292 nm) (bod 4.5.2).

Do přístroje se nastřikuje alikvotní část (např. 20 μl) methanolického roztoku získaného podle bodu 5.4 a eluuje se mobilní fází (bod 3.8). Průměrná hodnota výšek (ploch) píků se vypočte z několika opakovaných nástřiků téhož roztoku vzorku nebo kalibračních roztoků (bod 5.6.2).

Následující podmínky jsou doporučené; lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky.

Do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (bod 4.2.1) se odpipetuje 25 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferol-acetátu (bod 3.10.1) a hydrolyzuje se podle bodu 5.2. Potom se provede extrakce petroletherem (bod 3.2) podle bodu 5.3 a doplní se na 500 ml petroletherem. 25 ml tohoto extraktu se odpaří na rotační odparce téměř do sucha (viz bod 5.4), zbylé rozpouštědlo se odpaří pod proudem dusíku (bod 3.9) a odparek se rozpustí v 25,0 ml methanolu (bod 3.3). Nominální koncentrace tohoto roztoku je 45,5 μg DL-α-tokoferolu/ml, což odpovídá 50 μg DL-α-tokoferol-acetátu/ml. Pracovní standardní roztok se připravuje před použitím čerstvý.

Do sady 20 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/4,0 a 10,0 ml pracovního standardního roztoku, doplní se methanolem (bod 3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,5/5,0/10,0 a 25,0 μg/ml DL-α-tokoferol-acetátu, tj. 2,28/4,55/9,10 a 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.

Provede se opakovaný nástřik 20 μl každého kalibračního roztoku a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka.

Do 25,0 ml odměrné baňky se odpipetuje 5,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferol-acetátu (bod 3.10.1) a doplní se po značku ethanolem. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti ethanolu (bod 3.1) v rozmezí 250–320 nm.

Absorpční maximum je při 284 nm:

Při tomto ředění musí být získaná hodnota extinkce 0,84–0,88.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetují 2 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (bod 3.11.1), zředí se methanolem (bod 3.3) a doplní se jím po značku. Nominální koncentrace tohoto roztoku je 40 μg DL-α-tokoferolu/ml, což odpovídá 44,0 μg DL-α-tokoferol-acetátu/ml. Pracovní standardní roztok se připravuje před použitím čerstvý.

Do sady 20 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/4,0 a 10,0 ml pracovního standardního roztoku, doplní se methanolem (bod 3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,0/4,0/8,0 a 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, tj. 2,20/4,40/8,79 a 22,0 μg/ml DL-α-tokoferol-acetátu.

Provede se opakovaný nástřik 20 μl každého kalibračního roztoku a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka.

Do 25,0 ml odměrné baňky se odpipetuje 2,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (bod 3.11.1) a doplní se po značku ethanolem. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti ethanolu (bod 3.1) v rozmezí 250–320 nm. Absorpční maximum je při 292 nm:

Při tomto ředění musí být získaná hodnota extinkce 0,6.

Z průměrné výšky (plochy) píků vitaminu E v roztoku vzorku se stanoví koncentrace roztoku vzorku v μg/ml (počítáno jako DL-α-tokoferol-acetát) porovnáním s kalibrační křivkou (bod 5.6.1.2 nebo 5.6.2.2).

Obsah vitaminu E (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

Obsah železa, mědi, manganu a zinku se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 15510 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení vápníku, sodíku, fosforu, hořčíku, draslíku, železa, zinku, mědi, manganu, kobaltu, molybdenu a olova metodou ICP-AES nebo

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 15621 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení vápníku, sodíku, fosforu, hořčíku, draslíku, síry, železa, zinku, mědi, manganu a kobaltu po tlakovém rozkladu metodou ICP-AES nebo

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17053 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení stopových prvků, těžkých kovů a dalších prvků v krmivech metodou ICP-MS (multimetoda) nebo

• metodou analýzy stanovenou v normě EN ISO 6869 Krmiva – Stanovení obsahů vápníku, mědi, železa, hořčíku, manganu, draslíku, sodíku a zinku – Metoda atomové absorpční spektrometrie nebo

• metodou plamenové atomové absorpční spektrometrie (FAAS), jak je popsána v bodech 1 až 8 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení stopových prvků železa, mědi, manganu a zinku v krmivech(Tato metoda byla validována na základě kolaborativní zkoušky pro různé matrice krmiv. Další informace jsou k dispozici na adrese: https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/feed-additives/authorisation). Meze stanovitelnosti jsou:

• železo (Fe): 20 mg/kg

• měď (Cu): 10 mg/kg

• mangan (Mn): 20 mg/kg

• zinek (Zn): 20 mg/kg

Vzorek se převede po destrukci organické hmoty (pokud je obsažena) do roztoku kyselinou chlorovodíkovou. Prvky železo, měď, mangan a zinek se stanoví po příslušném zředění atomovou absorpční spektrofotometrií.

Pro přípravu činidel a analytických roztoků se použije voda, dvakrát destilovaná ve skleněném destilačním přístroji (borosilikátové nebo křemičité sklo) nebo po dvojím průchodu přes ionex, která prokazatelně neobsahuje kationty.

Činidla musí být nejméně analytické čistoty. Nepřítomnost prvků, které mají být stanoveny, musí být kontrolována slepou zkouškou. Pokud je to nutné, musí být činidla přečištěna.

Místo standardních roztoků popsaných níže mohou být použity komerční standardní roztoky za předpokladu, že mají deklarovaný obsah a před použitím byly překontrolovány.

• v odměrné baňce na 1000 ml se ve 25 ml kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l (bod 3.2) rozpustí 1 g práškové mědi, přidá se 5 ml peroxidu vodíku (bod 3.6) a doplní se po značku vodou.

• v odměrné baňce na 1000 ml se ve 25 ml kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l (bod 3.2) rozpustí 1 g práškového manganu a doplní se po značku vodou.

• v odměrné baňce na 1000 ml se ve 25 ml kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l (bod 3.2) rozpustí 1 g páskového nebo plátkového zinku a doplní se po značku vodou.

Pro každý stanovovaný prvek se připraví z pracovních standardních roztoků (bod 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 a 3.10.1) řada kalibračních roztoků. Kalibrační roztoky mají koncentraci HCl asi 0,5 mol/l a (v případě železa, manganu a zinku) koncentraci chloridu lanthanitého odpovídající 0,1 % La (w/v).

Koncentrace vybraných stopových prvků musí ležet v rozsahu citlivosti použitého spektrofotometru. Níže uvedené tabulky ukazují příklad složení typických řad kalibračních roztoků; v závislosti na typu a citlivosti použitého spektrofotometru však může být nutno zvolit jiné koncentrace.

Železo

Měď

Mangan

Zinek

Při stanovení mědi lze použít přímo roztok připravený podle bodu 5.1.1. Pokud je nutné jeho koncentraci naředit na úroveň kalibračních roztoků, odpipetuje se alikvotní část roztoku do 100 ml odměrné baňky a doplní se po značku kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l (bod 3.3).

Při stanovení železa, manganu a zinku se odpipetuje alikvotní část roztoku připraveného podle bodu 5.1.1 do 100 ml odměrné baňky, přidá se 10 ml roztoku chloridu lanthanitého (bod 3.11) a doplní se po značku kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l (bod 3.3) (viz rovněž bod 8 „Poznámka“).

Slepá zkouška musí zahrnovat všechny předepsané kroky postupu, ale vlastní vzorek se nepoužije. Kalibrační roztok „0“ nemůže být použit jako slepá zkouška.

Atomová absorpce kalibračních roztoků a analyzovaného roztoku se změří s použitím oxidačního plamene vzduch-acetylen při těchto vlnových délkách:

• Fe: 248,3 nm

• Cu: 324,8 nm

• Mn: 279,5 nm

• Zn: 213,8 nm

• Každé měření se provede čtyřikrát.

Pokud vzorek neobsahuje organickou hmotu, nemusí se spalovat. Příprava se provádí podle bodu 5.1.1.1 od druhého odstavce. Nemusí se provádět ani odpařování s kyselinou fluorovodíkovou.

Koncentrace daného stopového prvku v roztoku se vypočte z kalibrační křivky a výsledek se vyjádří v miligramech stopového prvku na kilogram vzorku (ppm).

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku týmž laborantem nesmí překročit:

• 5 mg/kg v absolutní hodnotě u obsahu daného stopového prvku do 50 mg/kg,

• 10 % z vyššího výsledku u obsahu daného stopového prvku od 50 do 100 mg/kg,

• 10 mg/kg v absolutní hodnotě u obsahu daného stopového prvku od 100 do 200 mg/kg,

• 5 % z vyššího výsledku u obsahu daného stopového prvku nad 200 mg/kg.

Přítomnost velkého množství fosfátů může ovlivňovat stanovení železa, manganu a zinku. Aby se tomuto ovlivnění zabránilo, musí být přidáván roztok chloridu lanthanitého (bod 3.11). Pokud je váhový poměr (Ca + Mg)/P ve vzorku > 2, roztok chloridu lanthanitého (bod 3.11) se do roztoku pro analýzu ani do kalibračních roztoků přidávat nemusí.

Obsah halofuginonu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (HPLC) s UV detekcí, jak je popsáno v bodech 1 až 8 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu halofuginonu v krmivech. Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

Obsah halofuginonu se stanoví jako volná báze po extrakci horkou vodou do ethylacetátu a následně se rozdělí jako hydrochlorid do vodného kyselého roztoku. Extrakt se přečistí na ionexové chromatografické koloně. Obsah halofuginonu se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

Do 500 ml odměrné baňky se naváží 50 mg halofuginonu (bod 3.6) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v tlumivém roztoku octanu amonného (bod 3.18), doplní po značku tlumivým roztokem a promíchá. Tento roztok je stálý tři týdny při teplotě 5 °C, je-li skladován ve tmě.

Poznámka: Pro účely této metody musí mít slepý vzorek krmiva podobné složení jako vzorek a při analýze nesmí být zjištěn halofuginon.

Do odstředivkové zkumavky o objemu 200 ml se naváží 10 g připraveného vzorku s přesností na 0,1 g, přidá se 0,5 g askorbátu sodného (bod 3.10), 0,5 g EDTA (bod 3.13) a 20 ml vody a promíchá se. Zkumavka se umístí na pět minut do vodní lázně (80 °C). Po vychladnutí na laboratorní teplotu se přidá 20 ml roztoku uhličitanu sodného (bod 3.15) a promíchá se. Ihned se přidá 100 ml ethylacetátu (bod 3.4) a ručně se 15 sekund intenzivně třepe. Pak se zkumavka s uvolněnou zátkou umístí na tři minuty do ultrazvukové lázně (bod 4.1). Odstředí se dvě minuty a ethylacetátová fáze se odlije přes filtr ze skleněných vláken (bod 4.6) do 500 ml dělicí nálevky. Extrakce vzorku se opakuje s dalšími 100 ml ethylacetátu. Kombinované extrakty se promývají jednu minutu 50 ml roztoku uhličitanu sodného saturovaného chloridem sodným (bod 3.16) a poté se vodná vrstva odstraní.

Organická vrstva se extrahuje po dobu jedné minuty 50 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.17). Spodní kyselinová vrstva se vypustí do 250 ml dělicí nálevky. Organická vrstva se znovu extrahuje po dobu 1,5 minuty dalšími 50 ml kyseliny chlorovodíkové a kyselinová vrstva se spojí s prvním extraktem. Spojené kyselinové extrakty se třepou přibližně 10 sekund s 10 ml ethylacetátu (bod 3.4).

Vodná vrstva se kvantitativně převede do 250 ml baňky s kulatým dnem a organická fáze se odstraní. Pomocí rotační filmové odparky (bod 4.2) se z kyselého roztoku odpaří všechen zbývající ethylacetát. Teplota vodní lázně nesmí přesáhnout 40 °C. Ve vakuu přibližně 25 mbar se všechen zbývající ethylacetát odstraní během pěti minut při teplotě 38 °C.

Pro každý extrakt vzorku se připraví kolona s XAD-2. Do skleněné kolony (bod 4.5) se přenese 10 g připraveného amberlitu (bod 3.19) spolu s methanolem (bod 3.8). Na horní konec pryskyřicové kolony se vloží malá zátka ze skelné vaty. Methanol z kolony se odstraní a kolona se promyje 100 ml vody. Přívod vody se zastaví, jakmile kapalina dosáhne horního konce pryskyřicové kolony. Před použitím se kolona nechá 10 minut ekvilibrovat. Kolona nesmí nikdy vyschnout.

Extrakt (bod 5.2) se kvantitativně převede na horní část připravené amberlitové kolony (bod 5.3.1) a eluuje se, přičemž se eluát odstraňuje. Rychlost eluce nesmí přesáhnout 20 ml/min. Baňka s kulatým dnem se vypláchne 20 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.17) a tato kapalina se použije k promytí pryskyřicové kolony. Zbytek kyselého roztoku se z kolony odstraní proudem vzduchu. Promývací roztok se také odstraní. Na kolonu se přidá 100 ml methanolu (bod 3.8) a vypustí se asi 5–10 ml eluátu do 250 ml baňky s kulatým dnem. Zbývající methanol se nechá 10 minut ustát na koloně a potom se pokračuje v eluci rychlostí, která nepřesáhne 20 ml/min. Eluát se vypustí do téže baňky s kulatým dnem. Methanol se odpaří na rotační filmové odparce (bod 4.2), teplota vodní lázně nesmí přesáhnout 40 °C. Odparek se pomocí mobilní fáze (bod 3.21) kvantitativně převede do 10 ml odměrné baňky. Doplní se mobilní fází po značku a promíchá. Alikvotní část se filtruje membránovým filtrem (bod 4.7). Tento roztok se uschová pro stanovení HPLC (bod 5.4).

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky.

• Kolona pro kapalinovou chromatografii (bod 4.4.1)

• HPLC mobilní fáze (bod 3.21)

• Průtok: 1,5 až 2 ml/min.

• Detekční vlnová délka: 243 nm

• Objem nástřiku: 40 až 100 μl.

Stálost chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.6.2), který obsahuje 3,0 μg/ml halofuginonu, dokud se nedosáhne konstantních výšek (nebo ploch) píků a konstantních retenčních časů.

Provede se opakovaný nástřik každého kalibračního roztoku (bod 3.6.2) a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

Provede se opakovaný nástřik roztoku vzorku (bod 5.3.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píků halofuginonu.

Koncentrace halofuginonu v roztoku vzorku v μg/ml se stanoví podle průměrné hodnoty výšky (plochy) halofuginonových píků v roztoku vzorku porovnáním s kalibrační křivkou (bod 5.4.2).

Obsah halofuginonu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií nebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (bod 3.6.2) obsahujícího 6,0 μg/ml.

Extrakt vzorku se obohatí přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.6.2). Množství přidaného halofuginonu musí odpovídat odhadovanému obsahu halofuginonu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku halofuginonu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se smí odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ± 10 %.

Výsledky jsou posuzovány podle těchto kritérií:

• a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s přesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor s diodovým polem se udává ± 2 nm;
• b) při vlnové délce mezi 225 a 300 nm se nesmí záznam spektra ve vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 až 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže v žádném sledovaném bodě odchylka mezi dvěma spektry nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu;
• c) při vlnové délce mezi 225 a 300 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 až 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku.

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 0,5 mg/kg při obsahu halofuginonu do 3 mg/kg.

Výtěžnost u obohaceného slepého vzorku musí činit nejméně 80 %.

Byla provedena kolaborativní studie(The Analyst 108, 1983, s. 1252 až 1256.), během níž byly zkoušeny tři vzorky osmi laboratořemi.

Výsledky

Obsah robenidinu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (HPLC) s UV detekcí, jak je popsáno v bodech 1 až 8 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu robenidinu v krmivech. Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

Vzorek se extrahuje okyseleným methanolem. Extrakt se vysuší a jeho alikvotní část se přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Robenidin se eluuje z kolony methanolem, koncentruje se a na vhodný objem se upraví pomocí mobilní fáze. Obsah robenidinu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

Do 500 ml odměrné baňky se odměří 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové (ρ20 = 1,18 g/ml), doplní se po značku methanolem (bod 3.1) a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Typ 3 A, 8–12 mesh (1,6–2,5 mm perličky krystalického hlinitokřemičitanu, průměr pórů 0,3 mm).

100 g oxidu hlinitého se naváží do vhodné nádoby a přidají se 2,0 ml vody. Zazátkuje se a protřepává přibližně 20 minut. Skladuje se v dobře zazátkované nádobě.

3,40 g dihydrogenfosforečnanu draselného se rozpustí ve vodě (pro HPLC) v 1000 ml odměrné baňce, doplní se po značku a promíchá.

3,55 g bezvodého (nebo 4,45 g dihydrátu, nebo 8,95 g dodekahydrátu) hydrogenfosforečnanu sodného se rozpustí ve vodě (pro HPLC) v 1000 ml odměrné baňce, doplní se po značku a promíchá.

Smíchá se:

• 650 ml acetonitrilu (bod 3.3),

• 250 ml vody (pro HPLC),

• 50 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného (bod 3.6),

• 50 ml roztoku hydrogenfosforečnanu sodného (bod 3.7).

Přefiltruje se 0,22μm filtrem (bod 4.6) a roztok se odplyní (např. ultrazvukem po dobu 10 minut).

Čistý robenidin: 1,3-bis[(4-chlorbenzyliden)amino]guanidin-hydrochlorid.

Naváží se 30 mg standardní látky robenidinu (bod 3.9) s přesností na 0,1 mg. Rozpustí se v okyseleném methanolu (bod 3.2) ve 100 ml odměrné baňce, doplní se po značku týmž rozpouštědlem a promíchá se. Baňka se obalí aluminiovou fólií a uloží ve tmě.

Vyrobená z tmavého skla, opatřená uzavíracím ventilem a nádržkou o obsahu přibližně 150 ml. Vnitřní průměr 10–15 mm, délka 250 mm.

Poznámka: Pro účely této metody musí mít slepý vzorek krmiva podobné složení jako vzorek a při analýze nesmí být zjištěn robenidin.

Do 250 ml kónické baňky se naváží přibližně 15 g připraveného vzorku s přesností na 0,01 g, přidá se 100,0 ml okyseleného methanolu (bod 3.2), zazátkuje a hodinu třepe na třepačce (bod 4.2). Roztok se přefiltruje přes filtrační papír ze skleněných vláken (bod 4.5) a celý objem filtrátu se jímá do 150 ml kónické baňky. Přidá se 7,5 g molekulárního síta (bod 3.4), zazátkuje a pět minut se třepe. Potom se ihned přefiltruje přes filtrační papír ze skleněných vláken. Tento roztok se použije k čištění (bod 5.3).

Do spodního konce skleněné kolony (bod 4.1) se vloží malá zátka ze skelné vaty a utěsní se skleněnou tyčinkou. Naváží se 11,0 g připraveného oxidu hlinitého (bod 3.5) a nasype se do kolony, pokud možno s minimální časovou prodlevou v okolním prostředí. Oxid hlinitý se v naplněné koloně setřese lehkým poklepem na spodní konec kolony.

Na kolonu se napipetuje 5,0 ml připraveného extraktu vzorku (bod 5.2). Špička pipety se opře o stěnu kolony a roztok se nechá absorbovat oxidem hlinitým. Robenidin se z kolony eluuje pomocí 100 ml methanolu (bod 3.1) při rychlosti průtoku 2–3 ml za minutu a eluát se jímá do 250 ml baňky s kulatým dnem. Roztok methanolu se za redukovaného tlaku a při teplotě 40 °C odpaří do sucha v rotační filmové odparce (bod 4.3). Odparek se znovu rozpustí ve 3–4 ml mobilní fáze (bod 3.8) a kvantitativně se převede do 10 ml odměrné baňky. Baňka se několikrát vypláchne 1–2 ml mobilní fáze a tyto roztoky se přidají do odměrné baňky. Baňka se doplní po značku týmž rozpouštědlem a promíchá. Alikvotní část se přefiltruje přes 0,45μm membránový filtr (bod 4.7). Tento roztok se použije pro stanovení HPLC (bod 5.4).

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky:

• Kolona pro kapalinovou chromatografii (bod 4.4.1)

• Mobilní fáze HPLC (bod 3.8)

• Průtok: 1,5 až 2 ml/min

• Vlnová délka detektoru: 317 nm

• Objem nástřiku: 20 až 50 μl.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.9.3), který obsahuje 3,6 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

Provede se opakovaný nástřik každého kalibračního roztoku (bod 3.9.3) a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

Provede se opakovaný nástřik extraktu vzorku (bod 5.3.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píků robenidinu.

Z průměrných hodnot výšky (plochy) robenidinových píků v roztoku vzorku se určí koncentrace robenidinu v roztoku vzorku v μg/ml porovnáním s kalibrační křivkou (bod 5.4.2).

Obsah robenidinu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií nebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (bod 3.9.3) obsahujícího 6 μg/ml.

Extrakt vzorku je obohacen přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.9.3). Množství přidaného robenidinu musí odpovídat odhadovanému obsahu robenidinu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku robenidinu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se smí odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ± 10 %.

Výsledky jsou posuzovány podle těchto kritérií:

• a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s přesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor s diodovým polem se udává obvykle ± 2 nm;
• b) při vlnové délce mezi 250 a 400 nm se nesmí záznam spektra ve vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 až 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže v žádném sledovaném bodě odchylka mezi dvěma spektry nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu;
• c) při vlnové délce mezi 250 a 400 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 až 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku.

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí přesáhnout 10 % z vyššího výsledku u obsahu robenidinu nad 15 mg/kg.

Výtěžnost u obohaceného slepého vzorku musí činit nejméně 85 %.

V EU byla provedena kolaborativní studie, během níž dvanáct laboratoří analyzovalo čtyři vzorky krmiv pro drůbež a králíky ve formě moučky nebo v peletované formě. U každého vzorku byla provedena opakovaná analýza. Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

Obsah diklazurilu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (HPLC) s ternárním gradientem a UV detekcí, jak je popsáno v bodech 1 až 9 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu diklazurilu v krmných směsích a premixech(Tuto metoda lze použít i pro stanovení diklazurilu v krmných surovinách.). Mez detekce je 0,1 mg/kg, mez stanovitelnosti 0,5 mg/kg. Nižší meze stanovitelnosti jsou dosažitelné, ale uživatel je musí validovat.

Po přidání vnitřního standardu se vzorek extrahuje okyseleným methanolem. U krmiv se alikvotní část extraktu přečistí na SPE patroně C18. Diklazuril se z patrony eluuje směsí okyseleného methanolu a vody. Po odpaření se zbytek rozpustí v roztoku DMF/voda. U premixů se extrakt odpaří a zbytek se rozpustí v roztoku DMF/voda. Obsah diklazurilu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s ternárním gradientem a UV detekcí.

Do 50 ml odměrné baňky se naváží 25 mg diklazurilu (bod 3.8) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (bod 3.6), doplní se DMF (bod 3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc(Delší stabilita (až 1 rok) je možná, ale musí ji potvrdit konkrétní laboratoř.).

Do 50 ml odměrné baňky se naváží 25 mg vnitřního standardu (bod 3.9) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (bod 3.6), doplní se DMF (bod 3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se převede 5,00 ml zásobního roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.1), doplní se DMF (bod 3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do 100 ml odměrné baňky se naváží p/10 mg vnitřního standardu s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (bod 3.6) v ultrazvukové lázni (bod 4.7), doplní DMF po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetuje 1,00 ml standardního roztoku diklazurilu (bod 3.8.2) a 2,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.2). Přidá se 17 ml DMF (bod 3.6), doplní se vodou (bod 3.1) po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do 1000 ml methanolu (bod 3.5) se napipetuje 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.7) a promíchá.

Provede se analýza pro kontrolu toho, že slepý vzorek krmiva neobsahuje ani diklazuril, ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva musí mít podobné složení jako vzorek a při analýze nesmí být zjištěn diklazuril ani jiné rušivé látky.

Provede se zkouška na výtěžnost u slepého vzorku krmiva, který byl obohacen přidáním takového množství diklazurilu, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Pro obohacení na obsah 1 mg/kg se k 50 g slepého vzorku krmiva přidá 0,1 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.8.1). Důkladně se promíchá a vyčká 10 minut, znovu se několikrát promíchá a potom se se může začít s extrakcí (bod 5.2).

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako vzorek (viz bod 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se vzorek, jenž má být analyzován, obohatí přidáním takového množství diklazurilu, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Obohacený vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

Do 500 ml kónické baňky se naváží přibližně 50 g vzorku s přesností na 0,01 g. Přidá se 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.2) a 200 ml extrakčního rozpouštědla (bod 3.12) a baňka se zazátkuje. Směs se přes noc třepe na třepačce (bod 4.1). Poté se nechá 10 minut usadit. 20 ml supernatantu se převede do vhodné skleněné nádoby a zředí se 20 ml vody (bod 3.1). Tento roztok se nanese na extrakční patronu (bod 3.11) a prosaje se pomocí vakua (bod 4.6). Patrona se promyje 25 ml směsi složené z extrakčního rozpouštědla (bod 3.12) a vody (bod 3.1), 65 + 35 (V + V). Spojené frakce se odstraní a složky se eluují 25 ml směsi složené z extrakčního rozpouštědla (bod 3.12) a vody, 80 + 20 (V + V). Tato frakce se v rotační odparce (bod 4.3) odpaří při 60 °C do sucha. Odparek se rozpustí v 1,0 ml DMF (bod 3.6), přidá se 1,5 ml vody (bod 3.1) a promíchá. Přefiltruje se přes membránový filtr (bod 4.4), který je připevněn k jednorázové injekční stříkačce (bod 4.5). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

Do 500 ml kónické baňky se naváží přibližně 1 g vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.3) a 200 ml extrakčního rozpouštědla (bod 3.12) a baňka se zazátkuje. Směs se přes noc třepe na třepačce (bod 4.1). Poté se nechá 10 minut usadit. 10000/p ml (p = nominální obsah diklazurilu v premixu v mg/kg) supernatantu se převede do baňky s kulatým dnem vhodné velikosti. V rotační odparce (bod 4.3) se odpaří za sníženého tlaku při 60 °C do sucha. Odparek se rozpustí v 10,0 ml DMF (bod 3.6), přidá se 15,0 ml vody (bod 3.1) a promíchá. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné nebo lepší výsledky.

• Kolona pro kapalinovou chromatografii (bod 4.2.1): 100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, náplň 3 μm, nebo obdobná.

• Mobilní fáze

  • Eluent A (bod 3.13.1): vodný roztok octanu amonného a tetrabutylamonium-hydrogensíranu.

  • Eluent B (bod 3.13.2): acetonitril.

  • Eluent C (bod 3.13.3): methanol.

• Druh eluce – lineární gradientová eluce

  • výchozí podmínky: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V),

  • po 10 minutách gradientová eluce po dobu 30 minut do: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V),

  • 10 minut proplachovat eluentem B.

• Průtok: 1,5–2 ml/min.

• Objem nástřiku: 20 μl.

• Vlnová délka detektoru: 280 nm.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.10.2), který obsahuje 2 μg/ml diklazurilu, a vnitřního standardu, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

Dvakrát se nastříkne 20 μl kalibračních roztoků (bod 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 a 3.10.5), stanoví se a integrují píky diklazurilu a vnitřního standardu a sestrojí se kalibrační křivka na základě poměru průměrné hodnoty výšky (plochy) píku diklazurilu k průměrné hodnotě výšky (plochy) píku vnitřního standardu vůči koncentraci diklazurilu v kalibračních roztocích (μg/ml).

Dvakrát se nastříkne 20 μl roztoku vzorku (bod 5.2.1 nebo 5.2.2) a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píku diklazurilu a vnitřního standardu.

Obsah diklazurilu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

nebo

kde:

• Výška(d,s) je výška píku diklazurilu v roztoku vzorku (bod 5.2.1)

• Plocha(d,s) je plocha píku diklazurilu v roztoku vzorku (bod 5.2.1)

• Výška(i,s) je výška píku vnitřního standardu v roztoku vzorku (bod 5.2.1)

• Plocha(i,s) je plocha píku vnitřního standardu v roztoku vzorku (bod 5.2.1)

• b je průsečík kalibrační křivky vynesené z kalibračních roztoků (bod 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 a 3.10.5) podle bodu 5.3.2

• a je sklon kalibrační křivky vynesené z kalibračních roztoků (bod 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 a 3.10.5) podle bodu 5.3.2

• m je hmotnost navážky vzorku v g

• V je konečný objem extraktu vzorku po opětovném rozpuštění podle bodu 5.2.1 v ml (tj. 2,5 ml)

Obsah diklazurilu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

p nebo p

kde:

• Výška(d,s) je výška píku diklazurilu v roztoku vzorku (bod 5.2.2)

• Plocha(d,s) je plocha píku diklazurilu v roztoku vzorku (bod 5.2.2)

• Výška(i,s) je výška píku vnitřního standardu v roztoku vzorku (bod 5.2.2)

• Plocha(i,s) je plocha píku vnitřního standardu v roztoku vzorku (bod 5.2.2)

• b je průsečík kalibrační křivky vynesené z kalibračních roztoků (bod 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 a 3.10.5) podle bodu 5.3.2

• a je sklon kalibrační křivky vynesené z kalibračních roztoků (bod 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 a 3.10.5) podle bodu 5.3.2

• m je hmotnost navážky vzorku v g

• V je konečný objem extraktu vzorku po opětovném rozpuštění podle bodu 5.2.2 v ml (tj. 25 ml)

• p je nominální obsah diklazurilu v premixu v mg/kg

Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií nebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku (bod 5.2.1 nebo 5.2.2) a kalibračního roztoku (bod 3.10.2).

Extrakt vzorku (bod 5.2.1 nebo 5.2.2) je obohacen přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.10.2). Přidané množství diklazurilu musí odpovídat obsahu diklazurilu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku diklazurilu a píku vnitřního standardu, a to úměrně přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině výšky se smí odchylovat od šířky původního píku diklazurilu nebo píku interního standardu v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ± 10 %.

Výsledky jsou posuzovány podle těchto kritérií:

• a) Při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s přesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor s diodovým polem se udává obvykle ± 2 nm.
• b) Při vlnové délce mezi 230 a 320 nm se nesmí záznam spektra ve vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže v žádném sledovaném bodě odchylka mezi dvěma spektry nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu.
• c) Při vlnové délce mezi 230 a 320 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje nikde 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku.

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

Rozdíl mezi výsledky dvou nezávislých měření provedených u dvou podvzorků nesmí překročit:

• 30 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu diklazurilu mezi 0,5 mg/kg a 2,5 mg/kg,

• 0,75 mg/kg u obsahu diklazurilu mezi 2,5 mg/kg a 5 mg/kg,

• 15 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu diklazurilu nad 5 mg/kg.

Výtěžnost u obohaceného (slepého) vzorku musí činit nejméně 80 %.

Byly provedeny dvě kolaborativní studie. V první studii provedené jinou skupinou laboratoří v roce 1994 byly analyzovanými vzorky dva premixy (O 100, A 100) a tři vzorky doplňkového krmiva pro drůbež (L1, Z1, K1). Jeden vzorek premixu byl smísen s organickou matricí (O 100) a druhý s anorganickou matricí (A 100). Teoretický obsah diklazurilu je 100 mg/kg. Laboratoře byly pověřeny, aby každý ze vzorků podrobily jedné nebo dvěma analýzám. (Podrobnější údaje o první kolaborativní studii viz Journal of AOAC International, svazek 77, č. 6, 1994, s. 1359–1361).

Ve druhé kolaborativní studii byly analyzovány tři krmné směsi pro drůbež obsahující diklazuril v koncentracích 0,9 mg/kg (MAT 1) a 1,5 mg/kg (MAT 2) a slepý vzorek krmiva (MAT 3). Podrobné údaje o druhé studii viz Technická zpráva Společného výzkumného střediska (2016) a Journal of AOAC International, svazek 102, č. 2, 2019, s. 646–652. Výsledky obou kolaborativních studií jsou uvedeny v následující tabulce.

Musí být předem prokázáno, že odezva diklazurilu je měřena v lineární oblasti koncentrace.

Alespoň pro analýzu diklazurilu v krmných směsích s vysokým obsahem tuku (pro tento účel vyšším než 12 % tuku) lze tuto metodu analýzy nahradit jinými metodami založenými na HPLC, např. vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS), pokud má tato alternativní metoda rovnocenné charakteristiky účinnosti (výtěžnost, preciznost za podmínek opakovatelnosti a reprodukovatelnosti).

Obsah lasalocidu sodného se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (HPLC) s použitím spektrofluorimetrického (fluorescenčního) detektoru, jak je popsáno v bodech 1 až 8 níže.

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu lasalocidu sodného v krmivech. Mez detekce je 5 mg/kg, mez stanovitelnosti 10 mg/kg.

Lasalocid sodný se extrahuje ze vzorku okyseleným methanolem a stanoví se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s použitím spektrofluorimetrického (fluorescenčního) detektoru.

23,5 ml kyseliny fosforečné (bod 3.2) se doplní vodou na 100 ml.

V 500 ml vody (bod 3.11) se rozpustí 1,36 g KH₂PO₄ (bod 3.1), přidá se 3,5 ml kyseliny fosforečné (bod 3.2) a 10,0 ml 6-methyl-2-heptylaminu (bod 3.4). pH se upraví na 4,0 roztokem kyseliny fosforečné (bod 3.3) a doplní se vodou (bod 3.11) na 1000 ml.

Do 1000 ml odměrné baňky se odměří 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.6), doplní se methanolem (bod 3.5) po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Smíchá se 5 ml fosfátového tlumivého roztoku (bod 3.7) a 95 ml methanolu (bod 3.5).

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 50 mg lasalocidu sodného (bod 3.10) s přesností na 0,1 mg a rozpustí se v okyseleném methanolu (bod 3.8), doplní se jím po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 10,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.10.1), doplní se po značku okyseleným methanolem (bod 3.8) a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do sady 50 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/4,0/5,0 a 10,0 ml pracovního standardního roztoku (bod 3.10.2). Doplní se po značku okyseleným methanolem (bod 3.8) a promíchá. Tyto roztoky odpovídají 1,0/2,0/4,0/5,0 a 10,0 μg lasalocidu sodného na ml. Tyto roztoky se musí připravovat před použitím čerstvé.

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (bod 5.1.2) se provede analýza pro kontrolu toho, že slepý vzorek krmiva neobsahuje ani lasalocid sodný, ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva musí mít podobné složení jako vzorek a nesmí být zjištěn lasalocid sodný ani jiné rušivé látky.

Provede se zkouška na výtěžnost u slepého vzorku krmiva, který byl obohacen přidáním takového množství lasalocidu sodného, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Pro obohacení na obsah 100 mg/kg se převede 10,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.10.1) do 250 ml kónické baňky a roztok se odpaří na objem přibližně 0,5 ml. Přidá se 50 g slepého vzorku krmiva. Důkladně se promíchá a vyčká 10 minut, znovu se několikrát promíchá a potom se se může začít s extrakcí (bod 5.2).

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se vzorek, jenž má být analyzován, obohatí přidáním takového množství lasalocidu sodného, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Tento vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

Do 250 ml kónické baňky se zátkou se naváží 5–10 g vzorku s přesností na 0,01 g. Pipetou se přidá 100,0 ml okyseleného methanolu (bod 3.8). Baňka se volně uzavře zátkou a promíchá kroužením. Potom se vloží na 20 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.1) při teplotě přibližně 40 °C. Pak se baňka vyjme a ochladí na laboratorní teplotu. Nechá se stát asi jednu hodinu, aby se usadily suspendované částice, a potom se alikvotní část přefiltruje přes 0,45μm membránový filtr (4.2) do vhodné nádoby. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

Do 250 ml odměrné baňky se naváží asi 2 g nemletého vzorku premixu s přesností na 0,001 g. Přidá se 100,0 ml okyseleného methanolu (bod 3.8) a promíchá kroužením. Potom se vloží na 20 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.1) při teplotě přibližně 40 °C. Pak se baňka vyjme a ochladí na laboratorní teplotu. Doplní se po značku okyseleným methanolem (bod 3.8) a důkladně promíchá. Nechá se stát asi jednu hodinu, aby se usadily suspendované částice, a potom se alikvotní část přefiltruje přes 0,45μm membránový filtr (bod 4.2). Vhodný objem čirého filtrátu se naředí okyseleným methanolem (bod 3.8) na konečnou koncentraci asi 4 μg/ml lasalocidu sodného. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

Následující podmínky jsou doporučené; lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.10.3), který obsahuje 4,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek (nebo ploch) píků a konstantních retenčních časů.

Provede se opakovaný nástřik každého kalibračního roztoku (bod 3.10.3) a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek (ploch) píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

Provede se opakovaný nástřik extraktů vzorků získaných podle bodů 5.2.1 nebo 5.2.2 při použití stejného objemu jako u kalibračního roztoku a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků lasalocidu sodného.

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píku získané nástřikem roztoku vzorku (bod 5.3.3) se porovnáním s kalibrační křivkou stanoví koncentrace lasalocidu sodného v μg/ml.

Obsah lasalocidu sodného (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Obsah lasalocidu sodného (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Metody založené na spektrofluorimetrické detekci jsou méně náchylné na interference než metody s UV detekcí. Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií.

Extrakt vzorku (bod 5.2.1 nebo 5.2.2) je obohacen přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.10.3). Přidané množství lasalocidu sodného musí odpovídat obsahu lasalocidu sodného v extraktu vzorku. Přídavek se projeví pouze zvýšením píku lasalocidu sodného, a to úměrně k přidanému množství lasalocidu sodného a ředění extraktu. Šířka píku v polovině výšky se smí odchylovat od šířky původního píku v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ± 10 %.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

• 15 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu lasalocidu sodného od 30 mg/kg do 100 mg/kg,

• 15 mg/kg u obsahu lasalocidu sodného od 100 mg/kg do 200 mg/kg,

• 7,5 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu lasalocidu sodného nad 200 mg/kg.

Pro obohacený (slepý) vzorek krmiva činí výtěžnost nejméně 80 %. Pro obohacené vzorky premixů činí výtěžnost nejméně 90 %.

Byla provedena kolaborativní studie, během níž dvanáct laboratoří analyzovalo dva premixy (vzorky 1 a 2) a pět krmiv (vzorky 3–7). U každého vzorku byla provedena opakovaná analýza. Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu amprolia v krmivech. Mez detekce je 1 mg/kg, mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

Vzorek se extrahuje směsí methanolu a vody. Po zředění mobilní fází a membránové filtraci se obsah amprolia stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s výměnou kationtů a UV detekcí.

13,80 g dihydrogenfosforečnanu sodného se rozpustí ve vodě (bod 3.3) v 1000 ml odměrné baňce, doplní se vodou (bod 3.3) po značku a promíchá.

224,74 g chloristanu sodného se rozpustí ve vodě (bod 3.3) v 1000 ml odměrné baňce, doplní se vodou (bod 3.3) po značku a promíchá.

Směs acetonitrilu (bod 3.2), roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného (bod 3.4) a roztoku chloristanu sodného (bod 3.5), 450 + 450 + 100 (v+v+v). Roztok se před použitím přefiltruje přes 0,22μm membránový filtr (bod 4.3) a odplyní (např. v ultrazvukové lázni (bod 4.4) po dobu nejméně 15 minut).

Do 100 ml odměrné baňky se s přesností na 0,1 mg naváží 50 mg amprolia (bod 3.7), rozpustí se v 80 ml methanolu (bod 3.1) a vloží se na 10 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.4). Po vyjmutí z ultrazvukové lázně se roztok ochladí na laboratorní teplotu, doplní vodou po značku a promíchá. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Směs methanolu (bod 3.1) a vody, 2 + 1 (v+v)

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (bod 5.1.2) se provede analýza pro kontrolu toho, že slepý vzorek krmiva neobsahuje ani amprolium, ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva musí mít podobné složení jako vzorek a nesmí být zjištěno amprolium ani jiné rušivé látky.

Provede se zkouška na výtěžnost u slepého vzorku krmiva, který byl obohacen přidáním takového množství amprolia, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Pro obohacení na obsah 100 mg/kg se převede 10,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.7.1) do 250 ml kónické baňky a roztok se odpaří na objem přibližně 0,5 ml. Přidá se 50 g slepého vzorku krmiva. Důkladně se promíchá a vyčká 10 minut, znovu se několikrát promíchá a potom se se může začít s extrakcí (bod 5.2).

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se vzorek, jenž má být analyzován, obohatí přidáním takového množství amprolia, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Tento vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

Podle obsahu amprolia se do 500 ml kónické baňky naváží 5–40 g vzorku s přesností na 0,01 g a přidá se 200 ml extrakčního rozpouštědla (bod 3.8). Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.4). Poté se baňka z ultrazvukové lázně vyjme a jednu hodinu třepe na třepačce nebo míchá na magnetické míchačce (bod 4.5). Alikvotní část extraktu se zředí mobilní fází (bod 3.6) na obsah amprolia 0,5–2 μg/ml a promíchá se (viz poznámka 9.3). 5–10 ml tohoto zředěného roztoku se přefiltruje přes membránový filtr (bod 4.2). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

Podle obsahu amprolia se do 500 ml kónické baňky naváží 1–4 g premixu s přesností na 0,001 g a přidá se 200 ml extrakčního rozpouštědla (bod 3.8). Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.4). Poté se baňka z ultrazvukové lázně vyjme a jednu hodinu třepe na třepačce nebo míchá na magnetické míchačce (bod 4.5). Alikvotní část extraktu se zředí mobilní fází (bod 3.6) na obsah amprolia 0,5–2 μg/ml a promíchá se. 5–10 ml tohoto zředěného roztoku se přefiltruje přes membránový filtr (bod 4.2). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.7.3), který obsahuje 1,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

Provede se opakovaný nástřik každého kalibračního roztoku (bod 3.7.3) a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek (ploch) píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

Provede se opakovaný nástřik extraktu vzorku (bod 5.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků amprolia.

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píků amprolia u roztoku vzorku se podle kalibrační křivky (bod 5.3.2) stanoví koncentrace roztoku vzorku v μg/ml.

Obsah amprolia (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií nebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku (bod 5.2) a kalibračního roztoku (bod 3.7.3) obsahujícího 2,0 μg/ml.

Roztok vzorku (bod 5.2) je obohacen přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.7.3). Přidané množství amprolia musí odpovídat obsahu amprolia v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku amprolia, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině výšky se smí odchylovat od šířky původního píku amprolia v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ± 10 %.

Výsledky jsou posuzovány podle těchto kritérií:

• a) Při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s přesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor s diodovým polem se udává obvykle ± 2 nm.
• b) Při vlnové délce mezi 210 a 320 nm se nesmí záznam spektra ve vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže v žádném sledovaném bodě odchylka mezi dvěma spektry nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu.
• c) Při vlnové délce mezi 210 a 320 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje nikde 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku.

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

• 15 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu amprolia od 25 mg/kg do 500 mg/kg,

• 75 mg/kg u obsahu amprolia mezi 500 mg/kg a 1000 mg/kg,

• 7,5 % vzhledem k vyšší hodnotě u obsahu amprolia nad 1000 mg/kg.

Výtěžnost u obohaceného (slepého) vzorku musí činit nejméně 90 %.

Byla provedena kolaborativní studie, během níž byla analyzována tři krmiva pro drůbež (vzorky 1–3), jedno minerální krmivo (vzorek 4) a jeden premix (vzorek 5). Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

Obsah narasinu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• metodou stanovenou v normě EN ISO 14183 Krmiva – Stanovení obsahu monensinu, narasinu a salinomycinu – Metoda kapalinové chromatografie s postkolonovou derivatizací.

Obsah nikarbazinu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• metodou stanovenou v normě EN 15782 Krmiva – Stanovení nikarbazinu – Metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie.

Obsah dekochinátu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• metodou stanovenou v normě EN 16162 Krmiva – Krmiva – Stanovení decoquinátu metodou HPLC s fluorescenční detekcí.

Obsah monensinu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• metodou stanovenou v normě EN ISO 14183 Krmiva – Stanovení obsahu monensinu, narasinu a salinomycinu – Metoda kapalinové chromatografie s postkolonovou derivatizací.

Obsah salinomycinu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• metodou stanovenou v normě EN ISO 14183 Krmiva – Stanovení obsahu monensinu, narasinu a salinomycinu – Metoda kapalinové chromatografie s postkolonovou derivatizací.

Obsah semduramycinu se stanoví takto:

• metodou analýzy stanovenou v normě EN 17299 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Screening a stanovení povolených kokcidiostatik v doplňkových látkách a 1 % a 3 % úrovně křížové kontaminace a neregistrovaných kokcidiostatik a jednoho antibiotika v nízkých koncentracích v krmných směsích metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) nebo

• metodou stanovenou v normě EN ISO 16158 Krmiva – Stanovení obsahu semduramicinu – Metoda kapalinové chromatografie s použitím „stromového“ analytického postupu.

Pro použití čl. 34 odst. 2 písm. a) nařízení (EU) 2017/625 jsou relevantní tyto normy EN:

• EN ISO 30024 Krmiva – Stanovení aktivity fytázy

• EN 17050 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení jodu v krmivech metodou ICP-MS

• EN 17550 Krmiva: Stanovení karotenoidů v krmných směsích a premixech pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí (HPLC-UV)

• EN 15784 Krmiva: Metody vzorkování a analýzy – Detekce a stanovení počtu bakterií rodu Bacillus používaných jako doplňkové látky v krmivech

• EN 15785 Krmiva: Izolace a stanovení počtu bakterií rodu Bifidobacterium

• EN 15786 Krmiva: Metody vzorkování a analýzy – Detekce a stanovení počtu bakterií rodu Pediococcus používaných jako doplňkové látky v krmivech

• EN 15787 Krmiva: Metody vzorkování a analýzy – Detekce a stanovení počtu bakterií rodu Lactobacillus používaných jako doplňkové látky v krmivech

• EN 15788 Krmiva: Metody vzorkování a analýzy – Detekce a stanovení počtu bakterií rodu Enterococcus (E. faecium) používaných jako doplňkové látky v krmivech

• EN 15789 Krmiva: Metody vzorkování a analýzy – Detekce a stanovení počtu bakterií Saccharomyces cerevisiae používaných jako doplňkové látky v krmivech

• EN 15510 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení vápníku, sodíku, fosforu, hořčíku, draslíku, železa, zinku, mědi, manganu, kobaltu, molybdenu a olova metodou ICP-AES (pro účely analýzy doplňkových látek kobaltu a molybdenu)

• EN 15621 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení vápníku, sodíku, fosforu, hořčíku, draslíku, síry, železa, zinku, mědi, manganu, kobaltu a molybdenu po tlakovém rozkladu metodou ICP-AES (pro účely analýzy doplňkové látky kobaltu)

• EN 16159 Krmiva – Stanovení selenu metodou atomové absorpční spektrometrie s generováním hydridů (HGAAS) po mikrovlnném rozkladu (rozklad pomocí 65 % kyseliny dusičné a 30 % peroxidu vodíku) (pro účely analýzy doplňkové látky selenu)

• EN 17053: Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení stopových prvků, těžkých kovů a dalších prvků v krmivech metodou ICP-MS (multimetoda) (pro účely analýzy doplňkových látek kobaltu, molybdenu a selenu)

PŘÍLOHA V METODY ANALÝZY PRO KONTROLU NEŽÁDOUCÍCH LÁTEK V KRMIVECH

A) STANOVENÍ OBSAHU DIOXINŮ (PCDD/PCDF) A PCB

Vzorky určené pro úřední kontrolu obsahu polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů (PCDD), polychlorovaných dibenzofuranů (PCDF), polychlorovaných bifenylů (PCB) s dioxinovým efektem(Tabulka faktorů toxické ekvivalence (TEF) pro PCDD, PCDF a PCB s dioxinovým efektem: WHO-TEF pro hodnocení nebezpečnosti pro člověka vycházející ze závěrů zasedání odborníků Světové zdravotnické organizace (WHO) – Mezinárodní program chemické bezpečnosti (IPCS), které se konalo v Ženevě v červnu 2005 (Martin Van den Berg et al. The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Pro účely této části se použijí definice stanovené v příloze I prováděcího nařízení Komise (EU) 2021/808(Prováděcí nařízení Komise (EU) 2021/808 ze dne 22. března 2021 o provádění analytických metod pro rezidua farmakologicky účinných látek používaných u zvířat určených k produkci potravin a o interpretaci výsledků, jakož i o metodách, které se mají používat pro odběr vzorků, a o zrušení rozhodnutí 2002/657/ES a 98/179/ES (Úř. věst. L 180, 21.5.2021, s. 84).).

Kromě zmíněných definic se pro účely této části použijí tyto definice:

• „Screeningovými metodami“ se rozumí metody používané k identifikaci vzorků s obsahem PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem převyšujícím maximální limity nebo akční prahy. Tyto metody musí umožňovat nákladově efektivní analýzu velkého množství vzorků, čímž se zvyšuje možnost zjistit nové případy vysoké expozice a ohrožení zdraví spotřebitelů. Screeningové metody musí být založeny na bioanalytických metodách nebo metodách GC-MS. Výsledky u vzorků, které překročily mezní hodnotu pro kontrolu dodržení maximálních limitů, musí být ověřeny úplnou opětovnou analýzou z původního vzorku pomocí konfirmační metody.

• „Konfirmačními metodami“ se rozumí metody, které poskytují úplné nebo doplňující informace pro jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem u maximálního limitu nebo, v případě potřeby, u akčního prahu. Tyto metody využívají plynovou chromatografii/hmotnostní spektrometrii s vysokým rozlišením (GC-HRMS) nebo plynovou chromatografii/tandemovou hmotnostní spektrometrii (GC-MS/MS).

Šarže nebo část šarže vyhovuje maximálnímu limitu, pokud výsledek analýzy pro sumu PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 a PCB 180 (dále jen „PCB bez dioxinového efektu“) nepřekračuje maximální limit stanovený ve směrnici 2002/32/ES, při zohlednění rozšířené nejistoty měření(V příslušném případě je třeba se řídit zásadami popsanými v dokumentu „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry“ (https://food.ec.europa.eu/system/files/2017-05/animal-feed-guidance_document_pcdd-f_pcb_en.pdf).). Šarže nebo část šarže nevyhovuje maximálnímu limitu stanovenému ve směrnici 2002/32/ES, pokud střední hodnota dvou horních odhadů(Koncept „horního odhadu“ vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru použití hodnoty meze stanovitelnosti. Koncept „dolního odhadu“ vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru použití nulové hodnoty. Koncept „středního odhadu“ vyžaduje pro výpočet příspěvku každého nekvantifikovaného kongeneru použití poloviny hodnoty meze stanovitelnosti.) výsledků analýzy získaná opakovanou analýzou(Opakovanou analýzou se rozumí samostatná analýza sledovaných analytů na základě druhého alikvotu téhož homogenizovaného vzorku. Obecně se použijí požadavky na opakovanou analýzu stanovené v příloze II kapitole C bodě 3. Avšak u metod s použitím vnitřního standardu značeného izotopem ¹³C pro příslušné analyty je opakovaná analýza nezbytná pouze tehdy, pokud výsledek prvního stanovení není vyhovující. Opakovaná analýza je nezbytná k vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného pomíchání vzorků. Je-li analýza prováděna v rámci kontaminační aféry, lze od potvrzení opakovanou analýzou upustit, pokud lze zpětně vysledovat spojitost vzorků vybraných pro analýzu s danou kontaminační aférou a zjištěný obsah je výrazně vyšší než maximální limit.) při zohlednění rozšířené nejistoty měření takřka nepochybně překračuje maximální limit, tj. k posouzení souladu se použije analyzovaná koncentrace poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření.

Rozšířená nejistota měření se vypočte s použitím koeficientu rozšíření 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %. Šarže nebo část šarže nevyhovuje, pokud je střední hodnota naměřených hodnot minus rozšířená nejistota měření střední hodnoty vyšší než maximální limit.

Pravidla zmíněná ve výše uvedených odstavcích tohoto bodu se použijí na výsledky analýz získané u vzorku pro úřední kontrolu. V případě analýzy pro účely druhého odborného stanoviska nebo srovnání se použijí vnitrostátní předpisy.

Šarže nebo část šarže je v souladu s maximálním limitem, pokud výsledek jedné analýzy

• provedené screeningovou metodou s mírou falešně vyhovujících výsledků nižší než 5 % naznačuje, že obsah nepřekračuje příslušný maximální limit pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem stanovený ve směrnici 2002/32/ES,

• provedené konfirmační metodou nepřekračuje příslušný maximální limit pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem stanovený ve směrnici 2002/32/ES, při zohlednění rozšířené nejistoty měření.

U screeningových zkoušek se pro rozhodnutí o souladu vzorku s příslušnými maximálními limity stanovenými buď pro PCDD/PCDF, nebo pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem stanoví mezní hodnota.

Šarže nebo část šarže nevyhovuje maximálnímu limitu stanovenému ve směrnici 2002/32/ES, pokud střední hodnota dvou horních odhadů(Koncept „horního odhadu“ vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru k hodnotě toxického ekvivalentu (TEQ) použití hodnoty meze stanovitelnosti. Koncept „dolního odhadu“ vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru k hodnotě TEQ použití nulové hodnoty. Koncept „středního odhadu“ vyžaduje pro výpočet příspěvku každého nekvantifikovaného kongeneru k hodnotě TEQ použití poloviny hodnoty meze stanovitelnosti.) výsledků analýzy získaná opakovanou analýzou(Obecně se použijí požadavky na opakovanou analýzu stanovené v příloze II kapitole C bodě 3. Avšak u konfirmačních metod s použitím vnitřního standardu značeného izotopem ¹³C pro příslušné analyty je opakovaná analýza nezbytná pouze tehdy, pokud výsledek prvního stanovení není vyhovující. Opakovaná analýza je nezbytná k vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného pomíchání vzorků. Je-li analýza prováděna v rámci kontaminační aféry, lze od potvrzení opakovanou analýzou upustit, pokud lze zpětně vysledovat spojitost vzorků vybraných pro analýzu s danou kontaminační aférou a zjištěný obsah je výrazně vyšší než maximální limit.) s použitím konfirmační metody při zohlednění rozšířené nejistoty měření takřka nepochybně překračuje maximální limit, tj. k posouzení souladu se použije analyzovaná koncentrace poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření.

Rozšířená nejistota měření se vypočte s použitím koeficientu rozšíření 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %. Šarže nebo část šarže nevyhovuje, pokud je střední hodnota naměřených hodnot minus rozšířená nejistota měření střední hodnoty vyšší než maximální limit.

Pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se použije součet odhadované rozšířené nejistoty měření samostatných výsledků analýz u PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

Pravidla zmíněná ve výše uvedených odstavcích tohoto bodu se použijí na výsledky analýz získané u vzorku pro úřední kontrolu. V případě analýzy pro účely obhajoby nebo srovnání se použijí vnitrostátní předpisy.

Akční prahy slouží jako nástroj k identifikaci vzorků v případech, kdy je nezbytné zjistit zdroj kontaminace a přijmout opatření pro jeho omezení nebo odstranění. Screeningové metody stanoví vhodné mezní hodnoty k identifikaci uvedených vzorků. V případě, kdy je zjištění zdroje kontaminace a jeho omezení nebo odstranění velmi náročné, je účelné potvrdit překročení akčního prahu opakovanou analýzou s použitím konfirmační metody při zohlednění rozšířené nejistoty měření(Totožné vysvětlení a požadavky na provedení opakované analýzy pro kontrolu akčních prahů jako v poznámce pod čarou 5 pro maximální limity.).

Požadavky stanovené v této kapitole se použijí při analýze krmiv pro úřední kontrolu obsahu PCDD/PCDF substituovaných v polohách 2,3,7,8 a PCB s dioxinovým efektem a pro přípravu vzorků a analytické požadavky k jiným regulačním účelům, včetně kontrol prováděných provozovatelem krmivářského podniku k zajištění dodržování ustanovení nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 183/2005(Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 183/2005 ze dne 12. ledna 2005, kterým se stanoví požadavky na hygienu krmiv (Úř. věst. L 35, 8.2.2005, s. 1).).

Sledování přítomnosti PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v krmivech může být prováděno dvěma různými druhy analytických metod:

Cílem screeningových metod je identifikovat vzorky s obsahem PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem převyšujícím maximální limity nebo akční prahy. Screeningové metody zajistí nákladově efektivní analýzu velkého množství vzorků, čímž se zvyšuje možnost zjistit nové případy vysoké expozice a ohrožení zdraví spotřebitelů. Cílem jejich použití je zabránit falešně vyhovujícím výsledkům. Tyto metody mohou zahrnovat bioanalytické metody a metody GC-MS.

Screeningové metody porovnávají výsledek analýzy s mezní hodnotou, a umožňují tak jednoznačné rozhodnutí (ano/ne) o případném překročení maximálního limitu nebo akčního prahu. Koncentraci PCDD/PCDF a sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem ve vzorcích, u nichž panuje podezření, že jsou nevyhovující, pokud jde o maximální limit, je třeba stanovit nebo potvrdit konfirmační metodou.

Kromě toho mohou screeningové metody udávat orientační obsah PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem přítomných ve vzorku. V případě použití bioanalytických screeningových metod se výsledek vyjádří v bioanalytických ekvivalentech (BEQ), zatímco v případě použití fyzikálně-chemických metod GC-MS se vyjádří v toxických ekvivalentech (TEQ). Numericky vyjádřené výsledky screeningových metod jsou vhodné k prokázání souladu nebo podezření na nedodržení nebo překročení akčních prahů a udávají orientační rozmezí úrovní pro případ následné zkoušky pomocí konfirmačních metod. Nejsou vhodné pro účely, jako je hodnocení úrovní pozadí, odhad příjmu, sledování vývoje úrovní v čase nebo přehodnocení akčních prahů a maximálních limitů.

Konfirmační metody umožňují jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem přítomných ve vzorku a poskytují úplné informace o úrovni jednotlivých kongenerů. Uvedené metody proto umožňují kontrolu maximálních limitů a akčních prahů, včetně konfirmace výsledků získaných pomocí screeningových metod. Kromě toho mohou být výsledky použity i pro jiné účely, jako je stanovení nízkých úrovní pozadí při sledování krmiv, sledování vývoje v čase, posouzení expozice a vytvoření databáze za účelem případného přehodnocení akčních prahů a maximálních limitů. Rovněž jsou významné pro stanovení zastoupení kongenerů za účelem zjištění zdroje možné kontaminace. Tyto metody využívají GC-HRMS. Pro konfirmaci souladu nebo nesouladu s maximálními limity lze rovněž použít GC-MS/MS.

Pro výpočet koncentrací TEQ se koncentrace jednotlivých látek v daném vzorku vynásobí jejich příslušnými faktory toxické ekvivalence (TEF) (viz poznámka 27 v kapitole I), sečtou se a výsledná suma je celkovou koncentrací sloučenin s dioxinovým efektem vyjádřenou v TEQ.

Pro účely této části A se schválenou specifickou mezí stanovitelnosti jednotlivého kongeneru rozumí nejnižší obsah analytu, který lze měřit s rozumnou mírou statistické jistoty, splňující kritéria pro identifikaci, jež jsou popsána v mezinárodně uznávaných normách, například v normě EN 16215:2012 (Krmiva – Stanovení dioxinů a PCB podobných dioxinům metodou GC/HRMS a indikátorů PCB metodou GC/HRMS) a/nebo v metodách EPA 1613 a 1668 ve znění pozdějších revizí.

Mez stanovitelnosti jednotlivého kongeneru může být identifikována jako:

• a) koncentrace analytu v extraktu vzorku, jež dává instrumentální odezvu na dvou různých iontech, které mají být monitorovány při poměru signál-šum 3:1 pro méně intenzivní signál z hrubých dat, nebo
• b) pokud výpočet signál-šum z technických důvodů neposkytuje spolehlivé výsledky, jako nejnižší bod koncentrace na kalibrační křivce, který vykazuje přijatelnou (≤ 30 %) a stálou (měřeno alespoň na začátku a na konci analytické série vzorků) odchylku od průměrného relativního odezvového faktoru vypočteného pro všechny body na kalibrační křivce v každé sérii vzorků. Mez kvantifikace (LOQ) se vypočte z nejnižšího bodu koncentrace, přičemž se zohlední výtěžnost vnitřních standardů a množství vzorku.

Bioanalytické screeningové metody neposkytnou výsledky na úrovni kongeneru, ale pouze orientační hodnotu(Bioanalytické metody nejsou specifické pro kongenery zahrnuté v systému TEF. V extraktu vzorku mohou být přítomny jiné strukturně příbuzné AhR-aktivní sloučeniny, které přispívají k celkové odezvě. Proto výsledky bioanalýzy nelze považovat za odhad, ale spíše za orientační hodnotu úrovně TEQ ve vzorku.) úrovně TEQ, vyjádřené v BEQ, aby byla zohledněna skutečnost, že ne všechny sloučeniny přítomné v extraktu vzorku, který při zkoušce dává odezvu, nutně splňují všechny požadavky principu TEQ.

Screeningové a konfirmační metody mohou být použity pouze pro kontrolu určité matrice, pokud jsou tyto metody dostatečně citlivé, aby spolehlivě zjistily hladiny na úrovni akčního prahu nebo maximálního limitu.

V případě PCDD/PCDF musí být zjistitelná množství z důvodu extrémní toxicity některých těchto sloučenin na horní úrovni femtogramů (10^-15 g). V případě většiny kongenerů PCB je dostatečná již mez stanovitelnosti na úrovni nanogramů (10^-9 g). Pro měření toxičtějších kongenerů PCB s dioxinovým efektem (zejména non-ortho substituovaných kongenerů) musí nejspodnější část pracovního rozsahu dosahovat nízkých úrovní pikogramů (10^-12 g). U všech ostatních kongenerů PCB je dostatečná již mez stanovitelnosti na úrovni nanogramů (10^-9 g).

Pro spolehlivé výsledky konfirmačních nebo screeningových metod musí být v rozsahu maximálního limitu splněna následující kritéria pro hodnotu TEQ nebo BEQ, ať už je určena jako celkový TEQ nebo celkový BEQ (jako suma PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem), nebo samostatně pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

Rozdíl mezi horním a dolním odhadem nesmí překročit 20 % pro konfirmaci překročení maximálního limitu nebo, v případě potřeby, akčních prahů.

• Separace PCDD/PCDF od rušivých chlorovaných sloučenin, jako jsou PCB bez dioxinového efektu a chlorované difenylethery, se provede vhodnými chromatografickými technikami (nejlépe na florisilové, aluminové a/nebo uhlíkové koloně).

• Separace izomerů pomocí plynové chromatografie musí být < 25 % překryvu mezi píky 1,2,3,4,7,8-HxCDF a 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

Rozsah kalibrační křivky musí pokrývat odpovídající rozsah maximálního limitu nebo akčních prahů.

• Pro GC-HRMS:

  • V případě HRMS musí být rozlišení zpravidla vyšší nebo rovno 10000 v celém rozsahu hmotností při 10 % sedle.

  • Splnění dalších identifikačních a konfirmačních kritérií podle mezinárodně uznávaných norem, například normy EN 16215:2012 (Krmiva – Stanovení dioxinů a PCB podobných dioxinům metodou GC/HRMS a indikátorů PCB metodou GC/HRMS) a/nebo v metodách EPA 1613 a 1668 ve znění pozdějších revizí.

• Pro GC-MS/MS:

  • Sledování alespoň dvou specifických prekurzorových iontů, každý s jedním odpovídajícím specifickým přechodovým produktovým iontem pro všechny značené a neznačené analyty v rozsahu analýzy.

  • Nejvyšší přípustná tolerance relativní intenzity iontů v rozmezí ± 15 % na vybrané přechodové produktové ionty ve srovnání s vypočtenými nebo naměřenými hodnotami (průměr z kalibračních standardů), za použití identických MS/MS podmínek, zejména kolizní energie a tlaku kolizního plynu, pro každý přechod analytu.

  • Rozlišení pro každý quadrupol má být nastaveno tak, aby se rovnalo nebo bylo lepší než jednotkové hmotnostní rozlišení (jednotkové hmotnostní rozlišení: dostatečné rozlišení pro separaci dvou píků jedné jednotky hmotnosti), za účelem minimalizování možné interference sledovaných analytů.

  • Splnění dalších kritérií podle mezinárodně uznávaných norem, například normy EN 16215:2012 (Krmiva – Stanovení dioxinů a PCB podobných dioxinům metodou GC/HRMS a indikátorů PCB metodou GC/HRMS) a/nebo v metodách EPA 1613 a 1668 ve znění pozdějších revizí, s výjimkou povinnosti použití GC/HRMS.

Bioanalytické metody jsou metody založené na využití biologických principů, jako jsou buněčné testy, receptorové testy nebo imunologické testy. V tomto bodě se stanoví obecné požadavky na bioanalytické metody.

Screeningové metody v zásadě klasifikují vzorky jako vyhovující nebo vzorky podezřelé jako nevyhovující. Za tímto účelem se vypočtená úroveň BEQ porovnává s mezní hodnotou (viz bod 7.3). Vzorky s výsledkem nižším než mezní hodnota se považují za vyhovující, vzorky s výsledkem rovnajícím se mezní hodnotě nebo vyšším se považují za podezřelé jako nevyhovující a je nutné provést jejich analýzu pomocí konfirmační metody. Prakticky může jako mezní hodnota sloužit úroveň BEQ odpovídající dvěma třetinám maximálního limitu, pokud je zajištěna míra falešně vyhovujících vzorků nižší než 5 % a přijatelná míra falešně nevyhovujících vzorků. Při odlišném maximálním limitu pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem vyžaduje kontrola souladu vzorků bez frakcionace vhodné mezní hodnoty pro biologickou zkoušku pro PCDD/PCDF. Pro kontrolu vzorků překračujících akční prahy je vhodnou mezní hodnotou přiměřené procento příslušného akčního prahu.

Je-li orientační úroveň vyjádřena v BEQ, musí být výsledky vzorku v pracovním rozsahu a překračovat oznamovací mez (viz body 7.1.1 a 7.1.6).

• Při výpočtu koncentrace z kalibrační křivky TCDD vykáží hodnoty na horním konci křivky velký křivkový rozptyl (vysoký variační koeficient (CV)). Pracovní rozsah je oblast, kde je tento CV menší než 15 %. Nejspodnější část pracovního rozsahu (oznamovací mez) musí být stanovena tak, aby nejméně trojnásobně přesahovala hodnoty slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup. Horní část pracovního rozsahu obvykle představuje hodnota EC₇₀ (70 % maximální účinné koncentrace), je však nižší, pokud je CV v tomto rozsahu vyšší než 15 %. Pracovní rozsah se stanoví během validace. Mezní hodnoty (viz bod 7.3) musí být uvnitř pracovního rozsahu.

• Standardní roztoky a extrakty vzorku se zkouší třikrát nebo alespoň duplicitně. Při duplicitních zkouškách musí standardní roztok nebo kontrolní extrakt zkoušený ve čtyřech až šesti jamkách rozložených na destičce poskytnout odezvu nebo koncentraci (možné pouze v pracovním rozsahu) vycházející z CV < 15 %.

• Za účelem výpočtu úrovně BEQ v extraktu a následně ve vzorku lze úroveň ve vzorcích odhadnout porovnáním jejich odezvy s odezvou kalibrační křivky TCDD (nebo PCB 126 nebo standardní směsi PCDD/PCDF/PCB s dioxinovým efektem).

• Kalibrační křivky musí obsahovat osm až dvanáct koncentrací (alespoň duplicitních), s dostatečným počtem koncentrací ve spodní části křivky (pracovním rozsahu). Zvláštní pozornost musí být věnována kvalitě proložení kalibračních bodů křivkou v pracovním rozsahu. Hodnota R² sama o sobě má pouze zanedbatelný nebo žádný význam při hodnocení kvality proložení kalibračních bodů křivkou při nelineární regresi. Lepšího proložení se dosáhne minimalizací rozdílu mezi vypočtenými a zjištěnými úrovněmi v pracovním rozsahu křivky (např. minimalizací sumy druhých mocnin reziduí).

• Od odhadované úrovně v extraktu vzorku se následně odečte úroveň BEQ vypočtená pro slepý vzorek matrice nebo rozpouštědla (aby se zohlednily nečistoty z použitých rozpouštědel a chemikálií) a provede se korekce na zjevnou výtěžnost (vypočtenou na základě úrovně BEQ vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem maximálního limitu nebo akčního prahu). Pro provedení korekce na výtěžnost musí být zjevná výtěžnost v požadovaném rozsahu (viz bod 7.1.4). Referenční vzorky použité pro korekci na výtěžnost musí splňovat požadavky stanovené v bodě 7.2.

Případně lze použít kalibrační křivku zhotovenou alespoň ze čtyř referenčních vzorků (viz bod 7.2.4): jednoho slepého matričního vzorku plus tří referenčních vzorků na polovině, jednonásobku a dvojnásobku maximálního limitu nebo akčního prahu, čímž odpadne nutnost odečtu hodnoty slepého stanovení a korekce na výtěžnost, pokud se vlastnosti matrice referenčních vzorků kryjí s vlastnostmi neznámých vzorků. V tomto případě lze odezvu odpovídající dvěma třetinám maximálního limitu (viz bod 7.3) vypočíst přímo z těchto vzorků a použít ji jako mezní hodnotu. Pro kontrolu vzorků překračujících akční prahy je vhodnou mezní hodnotou přiměřené procento těchto akčních prahů.

Extrakty lze rozdělit do frakcí obsahujících PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, což umožňuje získání samostatné orientační hodnoty úrovně TEQ pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem (v BEQ). Pro hodnocení výsledků pro frakci obsahující PCB s dioxinovým efektem se přednostně použije kalibrační křivka standardu PCB 126.

Zjevná výtěžnost biologické zkoušky se vypočte z vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem maximálního limitu nebo akčního prahu a vyjádří se jako procento úrovně BEQ v porovnání s úrovní TEQ. V závislosti na použitém typu zkoušky a použitých TEF(Současné požadavky vycházejí z TEF vydaných v: M. Van den Berg et al. Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).) mohou rozdíly mezi faktory TEF a REP pro PCB s dioxinovým efektem způsobit nízkou zjevnou výtěžnost u PCB s dioxinovým efektem v porovnání s PCDD/PCDF. Proto při samostatném stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem musí být zjevná výtěžnost biologických zkoušek následující: u PCB s dioxinovým efektem 20 % až 60 %, u PCDD/PCDF 50 % až 130 % (rozmezí platná pro kalibrační křivku TCDD). Jelikož podíl PCB s dioxinovým efektem na sumě PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se může u různých matric a vzorků lišit, odráží se tyto rozdíly i ve zjevné výtěžnosti biologických zkoušek pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, která se má pohybovat v rozmezí 30 % až 130 %. Důsledky případné podstatné revize hodnot TEF pro právní předpisy Unie týkající se PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem budou vyžadovat revizi těchto rozmezí.

Při validaci je nutné zkontrolovat ztrátu sloučenin během čištění. Slepý vzorek obohacený směsí různých kongenerů se podrobí čištění (alespoň n = 3) a výtěžnost a variabilita se ověří konfirmační metodou. Výtěžnost musí být v rozmezí 60 % až 120 %, zejména u kongenerů s podílem na množství TEQ v různých směsích, který je vyšší než 10 %.

Při oznamování úrovní BEQ musí být stanovena oznamovací mez z příslušných matričních vzorků zahrnujících typická zastoupení kongenerů, avšak vzhledem k nízké preciznosti v dolním rozsahu křivky nikoli z kalibrační křivky standardů. Je třeba vzít v úvahu účinky extrakce a čištění. Oznamovací mez musí být stanovena tak, aby nejméně trojnásobně přesahovala hodnoty slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup.

Je nutné určit vztah mezi výsledky bioanalýzy v BEQ a výsledky konfirmační metody v TEQ (např. pomocí kalibračních pokusů, které zohledňují vliv matrice, s referenčními vzorky obohacenými na nule, polovině, jednonásobku a dvojnásobku maximálního limitu s šesti opakováními na každé úrovni (n = 24)). Na základě tohoto vztahu lze odhadnout korekční faktory (odečtení hodnoty slepého stanovení a korekce na výtěžnost), je však nutno je ověřit v souladu s bodem 7.2.2.

Je nutné stanovit mezní hodnoty pro účely rozhodnutí ohledně souladu vzorku s maximálními limity nebo pro kontrolu akčních prahů, jsou-li sledovanou hodnotou, a rovněž s příslušnými maximálními limity nebo akčními prahy, stanovenými buď zvlášť pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, nebo pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem. Tyto hodnoty jsou zastoupeny nižšímkoncovým bodem distribuce výsledků bioanalýzy (upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) odpovídajícím rozhodovací mezi u příslušné konfirmační metody na základě 95 % míry spolehlivosti, z čehož vyplývá míra falešně vyhovujících výsledků < 5 %, a na základě RSD_R < 25 %. Rozhodovací mezí u příslušné konfirmační metody je maximální limit při zohlednění rozšířené nejistoty měření.

Mezní hodnotu (v BEQ) lze vypočíst v souladu s jedním z postupů uvedených v bodech 7.3.1, 7.3.2 a 7.3.3 (viz graf 1).

Požadavky stanovené v této kapitole se použijí při analýze krmiv pro úřední kontrolu obsahu PCB bez dioxinového efektu a pro přípravu vzorků a analytické požadavky k jiným regulačním účelům, včetně kontrol prováděných provozovatelem krmivářského podniku k zajištění dodržování ustanovení nařízení (ES) č. 183/2005.

Plynová chromatografie s detektorem elektronového záchytu (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS nebo rovnocenné metody.

Sledování alespoň následujícího počtu molekulárních iontů nebo charakteristických iontů z molekulárních klastrů:

• a) dvou specifických iontů u HRMS;
• b) tří specifických iontů u LRMS;
• c) dvou specifických prekurzorových iontů, každý s jedním odpovídajícím specifickým přechodovým produktovým iontem pro MS-MS.

Nejvyšší přípustné tolerance intenzity vybraných hmotnostních fragmentů:

Relativní odchylka intenzity vybraných hmotnostních fragmentů od teoretické intenzity nebo kalibračního standardu pro cílový iont (nejintenzivnější sledovaný iont) a identifikační iont (ionty): ± 15 %

Konfirmace výsledků překračujících maximální limit s dvěma kolonami GC se stacionární fází jiné polarity.

Účinnost metody se prokáže v rozsahu maximálního limitu (polovina až dvojnásobek maximálního limitu) s přijatelným variačním koeficientem pro opakovanou analýzu (viz požadavky na mezilehlou preciznost uvedené v bodě 9).

Suma mezí stanovitelnosti(V příslušných případech je třeba se řídit zásadami popsanými v dokumentu „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food“ [https://data.europa.eu/doi/10.2787/8931].) PCB bez dioxinového efektu nesmí překročit jednu třetinu maximálního limitu(Velmi se doporučuje, aby hodnoty slepého stanovení činidla byly nižší, než je obsah kontaminující látky ve vzorku. Je povinností laboratoře kontrolovat rozptyl hodnot slepých stanovení, zejména v případě, kdy se hodnoty slepého stanovení odečítají.).

Pravidelné slepé kontrolní vzorky, analýzy obohacených vzorků, vzorky pro kontrolu kvality, účast v mezilaboratorních studiích o příslušných matricích.

přidání k produktům (před extrakcí a čištěním).

• a) korekce výsledků na výtěžnost vnitřních standardů;
• b) výtěžnost vnitřních standardů značených izotopem musí být mezi 60 a 120 %;
• c) nižší nebo vyšší výtěžnost jednotlivých kongenerů, která se na sumě PCB bez dioxinového efektu podílí méně než 10 %, je přijatelná.

• a) kontrola výtěžnosti vnitřního standardu (vnitřních standardů) pro každý vzorek;
• b) výtěžnost vnitřních standardů musí být mezi 60 a 120 %;
• c) korekce výsledků na výtěžnost vnitřních standardů.

V souladu s ustanoveními nařízení (EU) 2017/625 musí být laboratoře akreditovány uznaným subjektem působícím v souladu s pokyny ISO/IEC Guide 58, aby bylo zaručeno, že uplatňují postupy zajištění analytické kvality. Laboratoře musí být akreditovány podle normy EN ISO/IEC 17025. Kromě toho je v příslušném případě třeba řídit se zásadami popsanými v technických pokynech pro odhad nejistoty měření a meze stanovitelnosti pro analýzu PCB(Viz poznámka pod čarou 9.).

Pro použití čl. 34 odst. 2 písm. a) nařízení (EU) 2017/625 jsou relevantní tyto normy EN:

• EN 17194 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení deoxynivalenolu, aflatoxinu B1, fumonisinu B1 a B2, T-2 a HT-2 toxinů, zearalenonu a ochratoxinu A v krmných surovinách a krmných směsích metodou LC-MS/MS

• EN 17270 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení theobrominu v krmných surovinách a krmných směsích, včetně složek pocházejících z kakaa, metodou kapalinové chromatografie

• EN 17504 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení gossypolu v semenech bavlníku a krmivech pomocí LC-MS/MS

• EN 17362 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení pentachlorfenolu (PCP) v krmných surovinách a krmných směsích metodou LC-MS/MS

• EN 16279 Krmiva – Stanovení obsahu fluoridů po extrakci kyselinou chlorovodíkovou metodou iontově selektivní elektrody (ISE)

• EN 17053 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení stopových prvků, těžkých kovů a dalších prvků v krmivech metodou ICP-MS (multimetoda)

• EN 15550 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení kadmia a olova po tlakovém rozkladu metodou atomové absorpční spektrometrie s grafitovou píckou (GF-AAS)

• EN 16206 Krmiva – Stanovení arzenu metodou atomové absorpční spektrometrie s generováním hydridů (HGAAS) po mikrovlnném tlakovém rozkladu (rozklad pomocí 65 % kyseliny dusičné a 30 % peroxidu vodíku)

• EN 16277 Krmiva – Stanovení rtuti atomovou absorpční spektrometrií metodou studených par (CVAAS) po mikrovlnném tlakovém rozkladu (extrakce s 65 % kyselinou dusičnou a 30 % peroxidem vodíku)

• EN 16278 Krmiva – Stanovení anorganického arzenu atomovou absorpční spektrometrií s generováním hydridů (HG-AAS) po mikrovlnné extrakci a oddělení pomocí extrakce na pevné fázi (SPE)

• EN 17374 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Stanovení anorganického arzenu v krmivu metodou anexové iontově výměnné HPLC-ICP-MS

PŘÍLOHA VI

METODY ZKOUŠENÍ PRO STANOVENÍ SLOŽEK ŽIVOČIŠNÉHO PŮVODU PRO ÚŘEDNÍ KONTROLU KRMIV

Identifikace složek živočišného původu v krmivech se provádí pomocí světelné mikroskopie nebo polymerázové řetězové reakce podle ustanovení uvedených v této příloze.

Tyto dvě metody umožňují zjistit přítomnost složek živočišného původu v premixech, krmných surovinách a krmných směsích. Neumožňují však výpočet množství takových složek v premixech, krmných surovinách a krmných směsích. Obě metody mají mezní hodnotu detekce nižší než 0,1 % (hmot.).

Metoda polymerázové řetězové reakce umožňuje identifikaci systematické skupiny složek živočišného původu, jež jsou přítomny v premixech, krmných surovinách a krmných směsích.

Tyto metody se použijí ke kontrole uplatňování zákazů, jež jsou stanoveny v čl. 7 odst. 1 a příloze IV nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 999/2001(Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 999/2001 ze dne 22. května 2001 o stanovení pravidel pro prevenci, tlumení a eradikaci některých přenosných spongiformních encefalopatií (Úř. věst. L 147, 31.5.2001, s. 1).) a v čl. 11 odst. 1 nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1069/2009(Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1069/2009 ze dne 21. října 2009 o hygienických pravidlech pro vedlejší produkty živočišného původu a získané produkty, které nejsou určeny k lidské spotřebě, a o zrušení nařízení (ES) č. 1774/2002 (nařízení o vedlejších produktech živočišného původu) (Úř. věst. L 300, 14.11.2009, s. 1).)

V závislosti na druhu zkoušeného krmiva lze tyto metody použít v rámci jednoho operačního protokolu, a to buď jednotlivě, či ve vzájemné kombinaci v souladu se standardními operačními postupy, jež stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP)(https://www.eurl.craw.eu/legal-sources-and-sops/method-of-reference-and-sops/).

Složky živočišného původu, jež mohou být přítomny v premixech, krmných surovinách a krmných směsích zaslaných k analýze, jsou identifikovány na základě charakteristických, mikroskopicky rozeznatelných znaků, jako jsou např. svalová vlákna a jiné masité částice, chrupavky, kosti, rohy, chlupy, štětiny, fragmenty kutikul bezobratlých, tracheální struktury hmyzu, krevní produkty, kapky mléka, krystaly laktózy, peří, vaječné skořápky, rybí kosti a šupiny.

Mikroskopická vyšetření se provedou po přípravě vzorků sedimentací.

U vzorků se provede sedimentace takto:

• Tetrachlorethylen (hustota 1,62)

• Petrolether (PE) bod varu 40–60 °C (specifická hustota 0,65)

• Roztok alizarinové červeně (2,5 ml 1M kyseliny chlorovodíkové se rozpustí ve 100 ml vody a do tohoto roztoku se přidá 200 mg alizarinové červeně).

• Louh (NaOH 2,5 % hm./obj. nebo KOH 2,5 % hm./obj.)

• Glycerol (neředěný, viskozita: 1490 cP) nebo zalévací přípravek s rovnocennými vlastnostmi pro přípravu neustálených podložních mikroskopických sklíček.

• Norland ® Optical Adhesive 65 (viskozita: 1200 cP) nebo pryskyřice s rovnocennými vlastnostmi pro přípravu ustálených podložních sklíček.

• Lugolův roztok (2 g jodidu draselného se rozpustí ve 100 ml vody a přidá se 1 g jódu za častého protřepávání).

• Činidlo na cystin (2 g octanu olovnatého, 10 g NaOH/100 ml vody).

• Fehlingovo činidlo (připravuje se těsně před použitím ze dvou stejně velkých částí (1/1) ze dvou roztoků A a B: roztok A (6,9 g modré skalice se rozpustí ve 100 ml destilované vody); roztok B (34,6 g vinanu sodnodraselného tetrahydrátu a 12 g NaOH se rozpustí ve 100 ml destilované vody).

• Tetramethylbenzidin/peroxid vodíku (1 g 3,3‘,5,5’ tetramethylbenzidinu se rozpustí ve 100 ml ledové kyseliny octové a 150 ml destilované vody. Před použitím je nutno promíchat 4 díly roztoku tetramethylbenzidinu s 1 dílem 3 % peroxidu vodíku).

• Ethanol ≥ 96 % (technický)

• Aceton (technický)

• Komerční roztok hypochloritu sodného (9 až 14 % aktivního chlóru)

• Analytické váhy s přesností 0,001 g

• Rozmělňovací zařízení: nůž nebo rotorový mlýn. Jestliže se používá rotorový mlýn, jsou zakázána mlýnská síta ≤ 0,5 mm.

• Síta se čtvercovými oky v šíři o rozměrech 0,25 mm a 1 mm. S výjimkou předběžného prosévání vzorku nesmí průměr síta překročit 10 cm, aby se zabránilo ztrátě materiálů. Kalibrace síta se nevyžaduje.

• Skleněná kuželovitá dělicí nálevka o objemu 250 ml s teflonovým nebo skleněným zabroušeným kohoutem na spodku kužele. Průřez kohoutu v otevřené poloze je ≥ 4 mm. Namísto skleněné kuželovité dělicí nálevky může být pouze pro jednoduchou sedimentaci s využitím TCE použita usazovací kádinka s kónickým dnem, prokázala-li laboratoř, že hodnoty mezní detekce odpovídají hodnotám získaným za použití skleněné kuželovité dělicí nálevky.

  Dělicí nálevka

• Stereoskopický mikroskop umožňující minimálně konečný rozsah zvětšení 6,5× až 40×.

• Kombinovaný mikroskop umožňující minimálně konečný rozsah zvětšení 100× až 400× v jasném poli procházejícího světla. Dále lze použít i polarizační zařízení, diferenciální interferenční kontrast.

• Běžné laboratorní sklo.

• Vybavení pro přípravu podložního sklíčka: běžná mikroskopická sklíčka, děrovaná sklíčka, krycí sklíčka (20×20 mm), pinzety, laboratorní stěrka.

• Laboratorní pec.

• Odstředivka.

• Filtrační papír: filtr z kvalitní buničiny (o rozměru pórů 4–11 μm).

Používá se reprezentativní vzorek odebraný v souladu s přílohou I.

Vzorky s obsahem vody > 14 % se před zpracováním vysuší podle přílohy III.

Za účelem shromáždění informací o možné kontaminaci krmiva z okolního prostředí se doporučuje předběžně prosít granulované a jádrové krmivo sítem o velikosti 1 mm, a následně připravit, analyzovat a zvlášť vykazovat dvě vzniklé frakce, jež je třeba považovat za samostatné vzorky.

Veškeré vybavení k vícenásobnému použití se před použitím důkladně vyčistí, čímž se zabrání křížové kontaminaci v laboratoři. Před čištěním se rozebere dělicí nálevka na jednotlivé části. Jednotlivé části dělicí nálevky a skleněné vybavení se předem omývají ručně a následně se vloží do mycího zařízení. Síta se čistí kartáčem s tuhými syntetickými štětinami. Po prosívání materiálu s obsahem tuků, jako je např. rybí moučka, se na závěr doporučuje očistit síta acetonem a tlakovým vzduchem.

Pro přípravu vzorků obsahujících tuky se použije tento protokol:

• je-li tuk v pevném stavu, ohřívá se v troubě, dokud není kapalný.

• Pomocí pipety se přenese 40 ml tuku ze spodní části vzorku do odstředivkové zkumavky.

• Vzorek se odstřeďuje po dobu 10 minut při 4000 ot./min.

• Pokud tuk po odstřeďování ztuhl, znovu se ohřeje v troubě, dokud není kapalný.

• Opakuje se odstřeďování po dobu 5 minut při 4000 ot./min.

• Pomocí laboratorní lžičky či tyčinky se polovina dekantovaných nečistot přenese na mikroskopická sklíčka za účelem rozboru. Doporučuje se použít glycerol coby zalévací přípravek.

• Zbylé nečistoty se použijí pro přípravu sedimentu podle bodu 2.1.3.4.3 první odrážky.

Stejný protokol, s výjimkou první a čtvrté odrážky, se použije pro přípravu vzorků obsahujících olej.

• Extrakce a příprava sedimentu:

  Do dělicí nálevky nebo do usazovací kádinky s kónickým dnem se přenese navážka 10 g (s přesností na 0,01 g) rozemletého dílčího vzorku a přidá se 50 ml TCE. V případě rybí moučky nebo jiných výrobků čistě živočišného původu, minerálních složek či premixů, jež vytvářejí více než 10 % sedimentu, se navážka do dělicí nálevky sníží na 3 g. Směs se důkladně protřepává po dobu alespoň 30 s a v průběhu oplachování vnitřního povrchu dělicí nálevky za účelem odstranění jakýchkoli přilnutých pevných částic se opatrně přidává dalších 50 ml TCE. Vzniklá směs se ponechá ustát po dobu alespoň pěti minut, než je otevřením kohoutu oddělen sediment.

  Je-li použita usazovací kádinka s kónickým dnem, musí být směs důkladně promíchávána alespoň po dobu 15 s a veškeré pevné částice, jež přilnou na stěně usazovací kádinky, je nutné z vnitřního povrchu opatrně opláchnout alespoň 10 ml TCE. Směs se ponechá ustát alespoň po dobu tří minut a následně se opět promíchá po dobu 15 s a veškeré pevné částice, jež přilnou na stěny usazovací kádinky, je nutné z vnitřního povrchu opatrně opláchnout alespoň 10 ml TCE. Vzniklá směs se ponechá ustát minimálně po dobu pěti minut a následně se pomocí dekantace tekutá frakce opatrně odstraní a vylije, přičemž se dbá na to, aby nedošlo k vylití sedimentu.

  Sediment se zachytí na filtrační papír umístěný do nálevky, aby bylo možné oddělit zbývající TCE a zároveň se vyhnout ukládání tuku do sedimentu. Sediment se vysuší. Pro kontrolu sedimentace se doporučuje sediment následně zvážit (s přesností na 0,001 g). Nakonec se sediment proseje sítem o velikosti 0,25 mm, přičemž budou analyzovány tyto dvě vzniklé frakce, ledaže by prosévání nebylo považováno za nutné.

• Extrakce a příprava flotátu:

  Po izolaci sedimentu podle výše popsané metody v dělicí nálevce zůstanou dvě fáze: tekutá, kterou tvoří TCE, a pevná z vrstvy plovoucího materiálu. Pevnou složkou je flotát, který je nutno odebrat tak, že se z nálevky otevřením výpustního kohoutu zcela vypustí TCE. Obrácením dělicí nálevky se flotát přemístí na velkou Petriho misku a vysuší vzduchem v laboratorní digestoři. Je třeba jej prosít sítem o velikosti 0,25 mm, přičemž budou analyzovány tyto dvě vzniklé frakce.

• Použití činidel k barvení:

  Osoba provádějící analýzu může pro usnadnění správné identifikace složek živočišného původu použít při přípravě vzorků činidla k barvení v souladu s pokyny, jež stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

  Je-li k obarvení sedimentu použit roztok alizarinové červeně, použije se tento protokol:

  • Vysušený sediment se přemístí do skleněné zkumavky a dvakrát vypláchne asi 5 ml ethanolu (vždy se použije po dobu 30 s ponorný mixér, rozpouštědlo se nechá usadit po dobu 1 min. 30 s a odlije se).

  • Sediment se vybělí přidáním nejméně 1 ml roztoku hypochloritu sodného. Umožní se průběh reakce po dobu 10 minut. Zkumavka se naplní vodou, sediment se nechá po dobu dvou až tří minut usadit a voda se suspendovanými částicemi se opatrně odlije.

  • Sediment se dvakrát přelije 10 ml destilované vody (vždy se použije po dobu 30 s ponorný mixér, směs se nechá pokaždé usadit a odlije se destilovaná voda).

  • Přidá se 2 až 10 kapek roztoku alizarinové červeně a směs se za použití ponorného mixéru rozmixuje. Reakce se ponechá probíhat po dobu 30 s a obarvený sediment se dvakrát vypláchne asi 5 ml ethanolu a následně jedenkrát acetonem (vždy se použije po dobu 30 s ponorný mixér, rozpouštědlo se nechá usadit po dobu 1 min. a odlije se).

  • Obarvený sediment se vysuší.

Všechny kroky se provedou ve skleněné kuželovité dělicí nálevce o objemu 250 ml, jak je popsáno v bodě 2.1.2.2 čtvrté odrážce.

• Do dělicí nálevky se přenese navážka 10 g (s přesností na 0,01 g) rozemletého dílčího vzorku a podrobí se nejprve jednoduché sedimentaci s využitím TCE, jak je popsáno v bodě 2.1.3.4.3, včetně izolace sedimentu na filtračním papíru umístěném v nálevce. Tento sediment lze použít jako sediment získaný podle bodu 2.1.3.4.3.

• Malý objem TCE vypuštěný spolu se sedimentem se převede do odměrného válce. Otevřením kohoutu dělicí nálevky se musí odměrný válec dále naplnit až do objemu 30 ml TCE. Jakmile je tohoto objemu dosaženo, kohout se uzavře.

• Tento získaný objem TCE se doplní přidáním 30 ml petroletheru s bodem varu 40–60 °C do dělicí nálevky. Obsah dělicí nálevky se důkladně promíchá, aby se získala směs 30 % PE/70 % TCE (o hustotě přibližně 1,26 g.cm^-3). Materiál se nechá usazovat po dobu 10 minut. Oddělí se dvě nové frakce: druhý sediment a konečný flotát (< 1,26 g.cm^-3). Druhý sediment se odebere na Petriho misku (nebo filtrační papír umístěný v nálevce) otevřením kohoutu, dokud v dělicí nálevce nezůstane pouze malé množství směsi rozpouštědla a konečný flotát. Zbývající kapalina a konečný flotát se zachytí odděleně na filtrační papír umístěný v nálevce. Stěna dělicí nálevky se opláchne pomocí PE, aby se sebral veškerý materiál z konečného flotátu. Konečný flotát se nechá vysušit. Konečný flotát se proseje sítem o velikosti 0,25 mm, přičemž pro zjištění složek živočišného původu suchozemských bezobratlých budou analyzovány tyto dvě vzniklé frakce, ledaže by prosévání nebylo považováno za nutné.

Podložní mikroskopická sklíčka se připraví ze sedimentu a dle úvahy osoby provádějící analýzu rovněž buď z flotátu, nebo suroviny. Je-li to vhodné, připraví se pouze pro zjištění složek živočišného původu suchozemských bezobratlých mikroskopická podložní sklíčka z konečného flotátu získaného podle popisu v bodě 2.1.3.4.4. Připraví se dvě vzniklé frakce (jemná a hrubá). Navážky frakcí nanesené na podložní mikroskopická sklíčka by měly být reprezentativní pro celou frakci.

Za účelem provedení úplného zkušebního protokolu stanoveného v bodě 2.1.4.2 je třeba připravit dostatečný počet podložních sklíček.

Mikroskopická podložní sklíčka se zalijí přiměřeným zalévacím přípravkem v souladu se standardním operačním postupem, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP). Podložní sklíčka se zakryjí krycími sklíčky.

Připravená mikroskopická podložní sklíčka se pozorují v souladu s vývojovými diagramy pozorování, jež jsou stanoveny v diagramech č. 1 a 2.

Mikroskopická pozorování se provádí pomocí kombinovaného mikroskopu, přičemž je pozorován sediment a dle úvahy osoby provádějící analýzu rovněž buď flotát, nebo surovina. Pro zjištění složek živočišného původu suchozemských bezobratlých se kromě toho provedou rovněž pozorování konečného flotátu získaného podle popisu v bodě 2.1.3.4.4 v souladu s diagramem 3. Pro hrubší frakce lze kromě kombinovaného mikroskopu použít i stereoskopický mikroskop. Celá plocha mikroskopického podložního sklíčka se prozkoumá při různém zvětšení. Přesné vysvětlení, jak používat vývojové diagramy, podrobně popisuje standardní operační postup, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

Minimální počet mikroskopických podložních sklíček, jež mají být zkoumána, je třeba důsledně dodržet u každého z kroků vývojových diagramů pozorování s výjimkou případů, kdy celý materiál frakce neumožňuje dosažení stanoveného počtu podložních sklíček, například pokud není získán žádný sediment. Pro záznam počtu částic se provádí pozorování na jednotlivé stanovení s nejvýše 6 podložními sklíčky.

Jsou-li na flotátu nebo na surovině připravována další mikroskopická podložní sklíčka pomocí specifičtějšího barvícího zalévacího přípravku popsaného v bodě 2.1.2.1.4 pro další charakterizaci struktur (např. peří, chlupů, svalových nebo krevních částic), které byly zjištěny na podložních sklíčkách připravených jinými zalévacími přípravky, jak je popsáno v bodě 2.1.2.1.3, počet částic se vypočítá na základě počtu podložních sklíček na jednotlivé stanovení s nejvýše 6 podložními sklíčky, včetně dalších podložních sklíček se specifičtějším zalévacím přípravkem. Další mikroskopická podložní sklíčka připravená z konečného flotátu získaného podle popisu v bodě 2.1.3.4.4 pro zjištění složek živočišného původu suchozemských bezobratlých se neberou v úvahu pro identifikaci jiné povahy (suchozemských obratlovců a ryb).

Osoba provádějící pozorování může za účelem usnadnění identifikace povahy a původu částic využít podpůrných nástrojů, jako jsou např. podpůrné systémy pro rozhodování, knihovny snímků a referenční vzorky.

Stanovení se provádějí na různých dílčích vzorcích o hmotnosti 50 g.

Nejsou-li po prvním stanovení, jež bylo provedeno v souladu s vývojovým diagramem pozorování uvedeným v diagramu 1 nebo případně 3, zjištěny žádné živočišné částice, není další stanovení nutné a výsledky analýzy se nahlašují s využitím formulací stanovených v bodě 2.1.5.1.

Je-li po prvním stanovení, jež bylo provedeno v souladu s vývojovým diagramem pozorování uvedeným v diagramu 1, zjištěna jedna nebo více živočišných částic dané povahy (tj. ze suchozemských obratlovců či ryb) a povaha zjištěných částic potvrdí deklarovaný obsah vzorku, není nutné druhé stanovení. Je-li počet živočišných částic dané povahy zjištěný během tohoto prvního stanovení vyšší než 5, podá se o výsledku analýzy zpráva podle živočišné povahy s využitím formulací stanovených v bodě 2.1.5.3. Jinak se o výsledku analýzy podává zpráva podle živočišné povahy s využitím formulací stanovených v bodě 2.1.5.2.

Je-li po prvním stanovení provedeném v souladu s vývojovým diagramem pozorování stanoveným v diagramu 3 zjištěno více než 5 částic suchozemských bezobratlých, není nutné druhé stanovení a o výsledku analýzy se podá zpráva podle živočišné povahy s využitím formulací stanovených v bodě 2.1.5.3.

Ve všech ostatních případech, včetně případů, kdy nebylo laboratoři poskytnuto prohlášení o obsahu, se provede druhé stanovení s novou navážkou dílčího vzorku. Je-li po druhém stanovení provedeném v souladu s vývojovým diagramem pozorování stanoveným v diagramu 2 nebo případně 3 celkový počet živočišných částic dané povahy zjištěný během dvou stanovení vyšší než 10, podá se o výsledku analýzy zpráva podle živočišné povahy s využitím formulací stanovených v bodě 2.1.5.3. Jinak se o výsledku analýzy podává zpráva podle živočišné povahy s využitím formulací stanovených v bodě 2.1.5.2.

Při nahlašování výsledků uvede laboratoř druh materiálu, na kterém byla analýza provedena (sediment, flotát, konečný flotát, surovina). Při nahlašování musí být jasně uveden počet stanovení, jež byla vykonána, a zda nebylo před přípravou podložního sklíčka provedeno prosévání frakcí v souladu s bodem 2.1.3.4.3 první odrážkou třetím pododstavcem nebo bodem 2.1.3.4.4 třetí odrážkou.

Laboratorní zpráva musí obsahovat přinejmenším informace o přítomnosti složek ze suchozemských obratlovců a z ryb.

Různé nálezy se nahlašují následovně:

Fragmenty deoxyribonukleové kyseliny (DNA) živočišného původu, jež mohou být přítomny v krmných surovinách a krmných směsích, jsou zjišťovány prostřednictvím polymerázové řetězové reakce pomocí genetické amplifikace, jež se zaměřuje na příslušné sekvence DNA jednotlivých živočišných druhů.

Metoda polymerázové řetězové reakce vyžaduje fázi extrakce DNA. Fáze amplifikace se používá na takto získaný extrakt DNA s cílem zjistit živočišné druhy, na něž je zkouška zaměřena.

Používají se pouze činidla, která schválila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

Použijí se pouze primery a sondy validované Referenční laboratoří EU pro živočišné proteiny v krmivech(Seznam těchto primerů a sond je pro jednotlivé druhy živočichů k dispozici na internetových stránkách Referenční laboratoře EU pro živočišné proteiny v krmivech.).

Použijí se pouze roztoky Master Mix, jež neobsahují činidla, která by mohla vést k nesprávným výsledkům z důvodu přítomnosti živočišné DNA(Příklady Master Mixů, jež lze použít, jsou k dispozici na internetové stránce Referenční laboratoře EU pro živočišné proteiny v krmivech.).

Běžné plastové vybavení pro molekulární biologii: zkumavky pro mikroodstředivky, plastové špičky mikropipet s filtrem, vhodné misky pro termocykler

Používá se reprezentativní vzorek odebraný podle postupů stanovených v příloze I.

Příprava laboratorních vzorků pro extrakci DNA musí splňovat požadavky stanovené v příloze II. Alespoň 50 g vzorku by mělo být rozděleno na dílčí vzorky pro účely analýzy a následně rozemleto.

Příprava vzorku probíhá v jiné místnosti, než je místnost určená k extrakci DNA a k reakcím genetické amplifikace, jak je stanoveno v normě ISO 24276.

Připraví se dvě navážky vzorku, každá minimálně o hmotnosti 100 mg.

Extrakce DNA se provede u každé navážky vzorku připravené podle standardního operačního postupu, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

Pro každou ze sérií navážek k extrakci se připraví dvě extrakční kontroly, jak je stanoveno v normě ISO 24276:

• jedna slepá extrakční kontrola,

• jedna extrakční kontrola pozitivní DNA.

Genetická amplifikace se provádí s využitím metod validovaných pro každý druh, který vyžaduje identifikaci. Tyto metody jsou stanoveny ve standardním operačním postupu, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP). Každý extrakt DNA se analyzuje alespoň ve dvou rozdílných ředěních, aby bylo možné vyhodnotit inhibici.

Pro každý cílový druh se připraví dvě kontroly amplifikace, jak je stanoveno v normě ISO 24276:

• kontrola pozitivní cílové DNA se použije pro každé z plat či pro každou ze sérií zkoušek prostřednictvím polymerázové řetězové reakce,

• kontrola amplifikačních činidel (nazývaná rovněž beztemplátová kontrola) se použije pro každé z plat či pro každou ze sérií zkoušek prostřednictvím polymerázové řetězové reakce.

Při nahlašování výsledků uvádí laboratoř minimálně hmotnost použitých navážek vzorku, použitý způsob extrakce, počet provedených stanovení a mezní hodnotu detekce dané metody.

Výsledky se neinterpretují a neohlašují, pokud extrakční kontrola pozitivní DNA a kontroly pozitivní cílové DNA nejsou pro zkoumaný cíl pozitivní a zároveň je kontrola amplifikačních činidel negativní.

V případě neslučitelných výsledků ze dvou navážek vzorku se zopakuje alespoň fáze genetické amplifikace. Domnívá-li se laboratoř, že neslučitelnosti by mohly být zapříčiněny extrakty DNA, provede se před vypočtením výsledků nová extrakce DNA a následná genetická amplifikace.

Konečné vyjádření výsledků vychází z integrace a interpretace výsledků dvou navážek vzorku v souladu se standardním operačním postupem, jejž stanovila a na svých internetových stránkách zveřejnila Referenční laboratoř EU pro živočišné proteiny v krmivech (EURL-AP).

Negativní výsledek se oznamuje takto:

V předloženém vzorku nebyla zjištěna žádná DNA z X (přičemž X označuje živočišný druh či skupinu živočišných druhů, na který či na kterou byla zkouška zaměřena).

Pozitivní výsledek se oznamuje takto:

V předloženém vzorku byla zjištěna DNA z X (přičemž X označuje živočišný druh či skupinu živočišných druhů, na který či na kterou byla zkouška zaměřena).

PŘÍLOHA VII

METODA VÝPOČTU ENERGETICKÉ HODNOTY KRMIVA PRO DRŮBEŽ

Energetická hodnota krmné směsi pro drůbež se vypočte podle níže uvedeného vzorce na základě procentního podílu určitých analytických složek krmiva. Tato hodnota se vyjadřuje v megajoulech (MJ) metabolizovatelné energie (ME) s korekcí na dusík na jeden kilogram krmné směsi:

MJ/kg ME = 0,1551 × % hrubého proteinu + 0,3431 × % hrubého tuku + 0,1669 × % škrobu + 0,1301 × % celkového obsahu cukrů (vyjádřeného jako sacharóza).

Jestliže úřední kontroly zjistí odchylku mezi výsledkem kontroly a deklarovanou energetickou hodnotou znamenající zvýšení nebo snížení energetické hodnoty krmiva, je přípustná tolerance 0,4 MJ/kg ME.

Výsledek vypočtený podle výše uvedeného vzorce se uvádí s přesností na jedno desetinné místo.

Odběr vzorku krmné směsi a stanovení obsahu analytických složek uvedených v metodě výpočtu se provádí podle metod odběru vzorků a metod analýzy Unie pro úřední kontrolu krmiv.

Použije se:

• ke stanovení obsahu hrubého tuku: postup B metody pro stanovení obsahu hrubých olejů a tuků stanovené v příloze III části G,

• ke stanovení obsahu škrobu: polarimetrická metoda stanovená v příloze III části K.

Energetická hodnota v krmných surovinách a krmných směsích pro kočky a psy se vypočte v souladu s normou EN 16967 Krmiva: Metody vzorkování a analýz – Predikční rovnice pro výpočet metabolizovatelné energie v krmných surovinách a krmných směsích (krmiva pro zvířata v zájmovém chovu) pro kočky a psy včetně dietních krmiv.

PŘÍLOHA VIII METODY ZKOUŠENÍ PRO KONTROLU NEPŘÍPUSTNÉ PŘÍTOMNOSTI JIŽ NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK V KRMIVECH

DŮLEŽITÉ UPOZORNĚNÍ:

Pro zjištění nepřípustné přítomnosti již nepovolených doplňkových látek v krmivech lze použít citlivější metody zkoušení, než jsou metody zkoušení uvedené v této příloze.

Metody zkoušení uvedené v této příloze se použijí pro účely potvrzování.

2-methyl-7-benzyl-oxy-6-butyl-1,4-dihydro-4-oxychinolin-3-karboxylát

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu methylbenzochátu v krmivech. Mez kvantifikace je 1 mg/kg.

Methylbenzochát se extrahuje ze vzorku pomocí methanolového roztoku kyseliny methansulfonové. Extrakt se přečistí dichlormethanem, ionexovou chromatografií, a následně pak znovu dichlormethanem. Obsah methylbenzochátu se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

Do 250 ml kónické baňky se naváží s přesností na 0,01 g asi 20 g upraveného vzorku. Přidá se 100 ml roztoku kyseliny methansulfonové (3.4) a mechanicky se třepe (4.1) po dobu 30 minut. Roztok se přefiltruje přes papírový filtr a filtrát se použije na extrakci kapalina-kapalina (5.3).

Do 500 ml dělicí nálevky obsahující 100 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.5) se přidá 25,0 ml filtrátu, který byl získán postupem uvedeným v bodě 5.2. Dále se do nálevky přidá 100 ml dichlormethanu (3.1) a třepe po dobu jedné minuty. Potom se nechají vrstvy separovat a spodní vrstva (dichlormethanu) se odpustí do 500 ml baňky s kulatým dnem. Extrakce vodné fáze se opakuje se dvěma dalšími 40 ml dávkami dichlormethanu a ty se spojí s prvním extraktem v baňce s kulatým dnem. Extrakt dichlormethanu se odpaří do sucha na rotační odparce (4.2) při sníženém tlaku a teplotě 40 ^oC. Odparek se rozpustí v 20–25 ml methanolu (3.2), baňka se zazátkuje a celý extrakt se použije pro chromatografii s iontovou výměnou (5.4).

Do dolního konce skleněné kolony (4.3) se vloží tampon ze skelné vaty. Připraví se suspenze z 5,0 g upraveného ionexu (3.6) a z 50 ml kyseliny chlorovodíkové (3.5). Tato směs se nalije do skleněné kolony a nechá se usadit. Přebytečná kyselina se odpustí až těsně nad hladinu ionexu a kolona se promývá vodou, dokud proteklý eluát není neutrální na lakmusový papír. Potom se do kolony se nalije 50 ml methanolu (3.2) a nechá se stéci až k povrchu ionexu.

Na kolonu se opatrně napipetuje získaný extrakt (5.3). Baňka s kulatým dnem se vypláchne dvěma dávkami 5–10 ml methanolu (3.2) a výplachy se také převedou na kolonu. Kolona se promyje 50 ml methanolu tak, aby průtok nepřesahoval 5 ml za minutu. Proteklá kapalina se odstraní. Methylbenzochát se eluuje z kolony 150 ml roztoku kyseliny methansulfonové (3.4) a eluát se jímá do 250 ml kónické baňky.

Získaný eluát (5.4.2) se převede do 1000 ml dělicí nálevky. Kónická baňka se propláchne 5–10 ml methanolu (3.2) a výplach se přidá do dělicí nálevky. Dále se do dělicí nálevky přidá 300 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.5) a 130 ml dichlormethanu (3.1). Třepe se po dobu jedné minuty a potom se nechají fáze separovat. Spodní vrstva (dichlormethanu) se odpustí do 500 ml baňky s kulatým dnem. Extrakce vodné fáze se opakuje se dvěma dalšími 70 ml dávkami dichlormethanu a tyto extrakty se smísí s prvním extraktem v baňce s kulatým dnem.

Extrakt dichlormethanu se odpaří do sucha v rotační odparce (4.2) při sníženém tlaku a teplotě 40 ^oC. Odparek v baňce se rozpustí v přibližně 5 ml methanolu (3.2) a tento roztok se kvantitativně převede do 10 ml odměrné baňky. Baňka s kulatým dnem se vypláchne dvěma dalšími dávkami 1–2 ml methanolu a opět se převede do odměrné baňky. Baňka se doplní po značku methanolem a promíchá. Alikvotní část se přefiltruje přes membránový filtr (4.6). Tento roztok se použije pro stanovení HPLC (5.6).

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky:

• kolona pro kapalinovou chromatografii (4.4.1),

• mobilní fáze HPLC: směs methanolu a vody (3.3),

• průtok: 1–1,5 ml/min,

• vlnová délka detektoru: 265 nm,

• objem nástřiku: 20–50 μl.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.7.3) obsahujícího 4 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek nebo ploch píků a konstantních retenčních časů.

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.7.3) a změří výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

Opakovaně se nastřikuje extrakt vzorku (5.5) s použitím stejného objemu, jaký byl použit pro kalibrační roztoky, a určí se průměrná hodnota výšky (plochy) píků methylbenzochátu.

Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků methylbenzochátu v roztoku vzorku se stanoví koncentrace v roztoku vzorku v μg/ml porovnáním s kalibrační křivkou (5.6.2).

Obsah methylbenzochátu (w) ve vzorku v mg/kg se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

Identita analytu může být potvrzena opakovaným stanovením s přídavkem nebo pomocí detektoru diodového pole, který umožňuje porovnání spektra extraktu vzorku se spektrem kalibračního roztoku (3.7.3) obsahujícího 10 μg/ml methylbenzochátu.

Extrakt vzorku se obohatí přidáním vhodného množství pracovního standardního roztoku (3.7.2). Množství přidaného methylbenzochátu musí být podobné jako odhadovaný obsah methylbenzochátu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku methylbenzochátu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ±10 %.

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

• a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s přesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor diodového pole se udává obvykle ±2 nm;

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit: 10 % relat. z hodnoty vyššího výsledku při obsahu methylbenzochátu od 4,0 do 20 mg/kg.

Výtěžnost pro obohacený vzorek musí být nejméně 90 %.

V deseti laboratořích bylo zkoušeno pět vzorků. U každého vzorku byly provedeny dvě zkoušky.

2-[N-2'-(hydroxyethyl)karbamoyl]-3-methylchinoxalin-N¹,N⁴-dioxid

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu olachindoxu v krmivech. Mez kvantifikace je 5 mg/kg.

Vzorek se extrahuje směsí vody a methanolu. Obsah olachindoxu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi za použití UV detektoru.

Směs vody (3.3) a methanolu (3.2), 900 + 100 (V + V).

PoznámkaOlachindox je citlivý na světlo. Všechny postupy se musí provádět při tlumeném světle nebo v nádobách z tmavého skla.

PoznámkaPro účely této metody je slepý vzorek krmiva podobného typu jako zkoušený vzorek a nesmí být zjištěn olachindox.

Naváží se přibližně 50 g vzorku s přesností na 0,01 g. Přenese se do kónické baňky o obsahu 1000 ml, přidá se 100 ml methanolu (3.1) a baňka se umístí na pět minut do ultrazvukové lázně (4.1). Přidá se 410 ml vody a ponechá se v ultrazvukové lázni dalších 15 minut. Baňka se vyjme z ultrazvukové lázně, dále se třepe 30 minut na míchacím zařízení (4.2) a potom se přefiltruje složeným filtrem. 10,0 ml filtrátu se přenese do 20 ml odměrné baňky, doplní se vodou po značku a promíchá. Poměrná část se přefiltruje membránovým filtrem (4.4). (viz bod 9 Poznámka). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.5.3), který obsahuje 2,5 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.5.3) a změří se průměrná hodnota výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek (ploch) píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

Provede se několik nástřiků extraktu vzorku (5.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a změří se průměrná hodnota výšky (plochy) píků olachindoxu.

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píků olachindoxu v roztoku vzorku se stanoví koncentrace v roztoku vzorku v μg/ml porovnáním s kalibrační křivkou (5.3.2).

Obsah olachindoxu ve vzorku (w) v mg/kg se vypočítá podle následujícího vzorce:

kde:

Identita analytu může být potvrzena opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) nebo využitím detektoru diodového pole, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku (5.2) a kalibračního roztoku (3.5.3), obsahujícího 5,0 μg/ml.

Extrakt vzorku (5.2) se obohatí přídavkem přiměřeného množství kalibračního roztoku (3.5.3). Množství přidaného olachindoxu musí odpovídat množství olachindoxu nalezeného v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku olachindoxu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině jeho výšky musí být v rozmezí ±10 % původní šířky píku olachindoxu v neobohaceném extraktu vzorku.

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

• a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s nepřesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor diodového pole se udává obvykle ±2 nm;
• b) při vlnové délce mezi 220 a 400 nm se nesmí záznam spektra zkoušeného vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže odchylka mezi dvěma spektry nikde nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu;
• c) při vlnové délce mezi 220 a 400 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje nikde 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku.

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí přesáhnout 15 % relat. z vyššího výsledku při obsahu olachindoxu mezi 10 a 200 mg/kg.

Výtěžnost pro obohacený slepý vzorek krmiva musí být nejméně 90 %.

V rámci ES byly provedeny kruhové testy, při nichž až 13 laboratoří zkoušelo čtyři vzorky krmiva pro selata, včetně jednoho slepého vzorku. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

Ačkoliv tato metoda nebyla ověřena pro krmiva obsahující více než 100 mg/kg olachindoxu, je možné obdržet uspokojivé výsledky menší navážkou vzorku a/nebo zředěním extraktu (5.2) tak, aby se dosáhlo koncentrace v rozsahu kalibrační křivky (5.3.2).

1-[(4-amino-2-propyl-pyrimidinyl)-metyl]-2-picoliniumchlorid hydrochlorid

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu amprolia v krmivech a premixech. Mez detekce je 1 mg/kg, mez kvantifikace je 5 mg/kg.

Vzorek se extrahuje směsí methanolu a vody. Po zředění mobilní fází a membránové filtraci se obsah amprolia stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s výměnou kationtů a UV detekcí.

13,80 g dihydrogenfosforečnanu sodného se rozpustí ve vodě (3.3) v odměrné baňce o objemu 1000 ml, doplní se vodou (3.3) po značku a promíchá.

224,74 g chloristanu sodného se rozpustí ve vodě (3.3) v odměrné baňce o objemu 1000 ml, doplní se vodou (3.3) po značku a promíchá.

Směs acetonitrilu (3.2), roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného (3.4) a roztoku chloristanu sodného (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Roztok se před použitím přefiltruje přes membránový filtr 0,22 μm (4.3) a odplyní (např. v ultrazvukové lázni (4.4) po dobu nejméně 15 minut).

Do 100 ml odměrné baňky se s přesností na 0,1 mg naváží 50 mg amprolia (3.7), rozpustí se v 80 ml methanolu (3.1) a vloží se na 10 minut do ultrazvukové lázně (4.4). Po vyjmutí z ultrazvukové lázně se roztok ochladí na laboratorní teplotu, doplní vodou po značku a promíchá. Roztok je při teplotě ≤ 4 ^oC stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se napipetuje 5,0 ml základního standardního roztoku (3.7.1), doplní se po značku extrakční směsí (3.8) a promíchá. Roztok je při teplotě ≤ 4 ^oC stálý jeden měsíc.

Do sady 50 ml odměrných baněk se napipetuje 0,5, 1,0 a 2,0 ml pracovního standardního roztoku (3.7.2). Doplní se po značku mobilní fází (3.6) a promíchá. Tyto roztoky obsahují 0,5, 1,0 a 2,0 μg amprolia v 1 ml. Tyto roztoky se musí připravovat čerstvé před použitím.

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (5.1.2) se provede zkouška slepého vzorku krmiva za účelem kontroly, že ve vzorku není přítomno amprolium ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva je podobného složení jako zkoušený vzorek a nesmí být zjištěno amprolium ani rušivé látky.

Zkouška na výtěžnost se provede na slepém vzorku krmiva, ke kterému bylo přidáno takové množství amprolia, které odpovídá množství amprolia ve zkoušeném vzorku. Pro obohacení na obsah 100 mg/kg se převede 10,0 ml základního standardního roztoku (3.7.1) do 250 ml kónické baňky a roztok se odpaří na přibližně 0,5 ml. Poté se přidá 50 g slepého vzorku krmiva. Důkladně se promíchá, nechá se 10 minut stát a před zahájením extrakce (5.2) se znovu několikrát promíchá.

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako zkoušený vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se ke zkoušenému vzorku přidá přibližně stejné množství amprolia, jaké je ve vzorku již obsaženo. Obohacený vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

Podle obsahu amprolia se do 500 ml kónické baňky naváží 5–40 g vzorku s přesností na 0,01 g a přidá se 200 ml extrakční směsi (3.8). Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (4.4). Poté se vyjme a 1 hodinu třepe nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.5). Alikvotní část extraktu se zředí mobilní fází (3.6) na obsah amprolia 0,5–2 μg/ml a promíchá se (viz poznámka 9.3). 5–10 ml tohoto naředěného roztoku se přefiltruje přes membránový filtr (4.2). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

Podle obsahu amprolia se do 500 ml kónické baňky naváží 1–4 g premixu s přesností na 0,001 g a přidá se 200 ml extrakční směsi (3.8). Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (4.4). Poté se vyjme a 1 hodinu třepe nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.5). Alikvotní část extraktu se zředí mobilní fází (3.6) na obsah amprolia mezi 0,5–2 μg/ml a promíchá se. 5–10 ml tohoto zředěného roztoku se přefiltruje přes membránový filtr (4.2). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.3).

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.7.3), který obsahuje 1,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.7.3) a změří se průměrná hodnota výšek (ploch) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

Provede se několik nástřiků extraktu vzorku (5.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a zjistí se průměrná hodnota výšek (ploch) píků amprolia.

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píků amprolia u roztoku vzorku se podle kalibrační křivky (5.3.2) stanoví koncentrace roztoku vzorku v μg/ml.

Obsah amprolia (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:

(mg/kg)

kde:

Identitu analytů lze potvrdit opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) nebo pomocí detektoru diodového pole, přičemž se porovnávají spektra roztoku vzorku (5.2) a kalibračního roztoku (3.7.3) obsahujícího 2,0 μg/ml.

K roztoku vzorku (5.2) se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.7.3). Přidané množství amprolia musí odpovídat obsahu amprolia v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku amprolia, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku amprolia v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ±10 %.

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

• a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s přesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor diodového pole se udává obvykle ±2 nm;
• b) při vlnové délce mezi 210 a 320 nm se nesmí záznam spektra ve zkoušeném vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže odchylka mezi dvěma spektry nikde nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu;
• c) při vlnové délce mezi 210 a 320 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje nikde 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku.

Není-li některé z těchto kritérií splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit

• 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku u obsahu amprolia mezi 25 mg/kg a 500 mg/kg,

• 75 mg/kg u obsahu amprolia mezi 500 mg/kg a 1000 mg/kg,

• 7,5 % relat. z hodnoty vyššího výsledku u obsahu amprolia vyššího než 1000 mg/kg.

Pro obohacený (slepý) vzorek musí být výtěžnost nejméně 90 %.

Při kruhových testech byla zkoušena tři krmiva pro drůbež (vzorky 1–3), minerální krmivo (vzorek 4) a premix (vzorek 5). Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce.

Methyl-3-(2-chinoxalinylmethylen)-carbazat-N¹,N⁴-dioxid

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu carbadoxu v krmivech, premixech a přípravcích. Mez detekce je 1 mg/kg, mez kvantifikace je 5 mg/kg.

Vzorek se zvlhčí vodou a poté se extrahuje směsí methanolu a acetonitrilu. U krmiv se alikvotní část extraktu po filtraci přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Extrakt z premixů a přípravků se přímo ředí na vhodnou koncentraci směsí vody, methanolu a acetonitrilu. Obsah carbadoxu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

500 ml methanolu (3.1) se smíchá s 500 ml acetonitrilu (3.2).

10 ml kyseliny octové (3.3) se smíchá se 100 ml vody.

PoznámkaLze použít i skleněnou kolonu s kohoutem a kónicky zúženou skleněnou kolonu; v tom případě se do spodní části kolony vloží malá zátka ze skelné vaty a utěsní se pomocí skleněné tyčinky.

PoznámkaCarbadox je citlivý na světlo. Celý postup se musí provádět při tlumeném světle nebo je třeba použít nádobí z tmavého skla nebo sklo obalit hliníkovou fólií.

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (5.1.2) se provede zkouška slepého vzorku krmiva za účelem kontroly, že není přítomen ani carbadox, ani rušivé látky. Slepý vzorek krmiva má podobné složení jako zkoumaný vzorek a nesmí být zjištěn carbadox ani rušivé látky.

Zkouška na výtěžnost se provede na slepém vzorku krmiva (5.1.1), ke kterému bylo přidáno takové množství carbadoxu, které odpovídá množství carbadoxu ve zkoušeném vzorku. Pro obohacení na obsah 50 mg/kg se 5,0 ml základního standardního roztoku (3.11.1) převede do 200 ml kónické baňky. Roztok se v proudu dusíku odpaří na přibližně 0,5 ml. Přidá se 10 g slepého vzorku krmiva, promíchá se a po deseti minutách se může začít s extrakcí (5.2).

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako zkoušený vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se ke zkoušenému vzorku přidá přibližně stejné množství carbadoxu, jaké je ve vzorku již obsaženo. Obohacený vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

Do 200 ml kónické baňky se naváží 10 g vzorku s přesností na 0,01 g. Přidá se 15,0 ml vody, promíchá se a nechá se 5 minut stát. Poté se přidá 35,0 ml směsi methanolu a acetonitrilu (3.5), baňka se uzavře a 30 minut se protřepává nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.1). Roztok se přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken (4.2). Tento roztok se použije k čištění (5.3).

Do 200 ml kónické baňky se naváží 1 g nemletého vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 15,0 ml vody, promíchá se a nechá se 5 minut stát. Poté se přidá 35,0 ml směsi methanolu a acetonitrilu (3.5), baňka se uzavře a 30 minut se protřepává nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.1). Roztok se přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken (4.2).

Alikvotní část filtrátu se odpipetuje do 50 ml odměrné baňky. Přidá se 15,0 ml vody, doplní se po značku směsí methanolu a acetonitrilu (3.5) a promíchá. Koncentrace carbadoxu v konečném roztoku je přibližně 10 μg/ml. Alikvotní část se přefiltruje přes filtr 0,45 μm (4.6).

Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.4).

Do 250 ml kónické baňky se naváží 0,2 g nemletého vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 45,0 ml vody, promíchá se a nechá se 5 minut stát. Poté se přidá 105,0 ml směsi methanolu a acetonitrilu (3.5), baňka se uzavře a homogenizuje. Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (4.7) a poté se 15 minut třepe nebo míchá na magnetickém míchacím zařízení (4.1). Roztok se přefiltruje přes filtr ze skleněných vláken (4.2).

Alikvotní část filtrátu se zředí směsí vody, methanolu a acetonitrilu (3.12) tak, aby se získala koncentrace carbadoxu 10–15 μg/ml (pro 10 % přípravek je faktor ředění 10). Alikvotní část se přefiltruje přes filtr 0,45 μm (4.6).

Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.4).

Do skleněně kolony (4.3) se naváží 4 g oxidu hlinitého (3.4).

Na kolonu s oxidem hlinitým se nanese 15 ml přefiltrovaného extraktu (5.2.1) a první 2 ml eluátu se odstraní. Následujících 5 ml se zachycuje, alikvotní část se přefiltruje přes filtr 0,45 μm (4.6).

Dále se pokračuje se stanovením HPLC (5.4).

Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (3.11.2), který obsahuje 5,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek (ploch) píků a konstantních retenčních časů.

Provede se několikrát nástřik každého kalibračního roztoku (3.11.2) a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek (ploch) píků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

Extrakt ze vzorku ((5.3.2) pro krmiva, (5.2.2) pro premixy a (5.2.3) pro přípravky) se opakovaně nastřikuje a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píku carbadoxu.

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píků carbadoxu v roztoku vzorku se porovnáním s kalibrační křivkou (5.4.2) stanoví koncentrace carbadoxu v roztoku vzorku v μg/ml.

Obsah carbadoxu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

[mg/kg]

kde:

Obsah carbadoxu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočítá podle následujícího vzorce:

[mg/kg]

kde:

Identitu analytu lze potvrdit opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) nebo pomocí detektoru diodového pole, přičemž se srovnávají spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (3.11.2) obsahujícího 10,0 μg/ml carbadoxu.

K extraktu vzorku se přidá vhodné množství kalibračního roztoku (3.11.2). Přidané množství carbadoxu musí odpovídat obsahu carbadoxu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku carbadoxu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se může odchylovat od šířky původního píku carbadoxu nejvýše o ±10 %.

Výsledky jsou posuzovány podle následujících kritérií:

• a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s přesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor diodového pole se udává obvykle ±2 nm;
• b) při vlnové délce mezi 225 a 400 nm se nesmí záznam spektra ve zkoušeném vzorku a standardu zaznamenaný ve vrcholu píku chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže odchylka mezi dvěma spektry nikde nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu;
• c) při vlnové délce mezi 225 a 400 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10–100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku.

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí při obsahu carbadoxu 10 mg/kg překračovat 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

Pro obohacený (slepý) vzorek musí být výtěžnost nejméně 90 %.

Při kruhových testech bylo 8 laboratořemi zkoušeno 6 krmiv, 4 premixy a 3 přípravky. U každého vzorku byly provedeny dvě zkoušky. (Přesnější údaje o těchto kruhových testech viz Journal of the AOAC, Volume 71, 1998, s. 484–490.) Výsledky (s výjimkou odlehlých hodnot) jsou shrnuty v níže uvedené tabulce:

Tabulka 1 Výsledky kruhových testů u krmiv

Tabulka 2 Výsledky kruhových testů u premixů a přípravků

PŘÍLOHA IX SROVNÁVACÍ TABULKY PODLE ČLÁNKU 6

1. Směrnice 71/250/EHS